Contact

Ana-Maria Šimundić
Editor-in-Chief
Clinical Institute of Chemistry
Sestre milosrdnice University hospital
Vinogradska 29
10 000 Zagreb, Croatia

Phone: +385 1 3787 184
Fax: +385 1 3768 280

e-mail address: editorial_office [at] biochemia-medica [dot] com
 

Useful links

Events

šećerna bolest

 Pregledni članak

 

Tamas Nagy1, Attila Miseta1,2, Gabor L. Kovacs1,2. O-GlcNAc, proteinski vezan višefunkcijski mehanizam u staničnoj signalizaciji te njegova uloga u patogenezi šećerne bolesti, stresa i zloćudnih bolesti. Biochemia Medica 2007;17(2):162-77.
 
1 Institute of Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, Pecs, Hungary
2 Znanstveni centar MEDIPOLIS, Sveučilište u Pečuhu, Pečuh, Mađarska
*Corresponding author:: gabor [dot] l [dot] kovacs [at] aok [dot] pte [dot] hu
 
Sažetak
Sve veći broj dokaza ukazuje na to da put biosinteze heksozamina (HPB, engl. hexosamine biosynthesis pathway) ima značajnu ulogu u modulaciji unutarstaničnih putova preoblikovanja signala. Njegov krajnji produkt, tj. UDP-GlcNAc, je supstrat kod spajanja O-vezanog β-N-acetilglukozamina (O-GlcNAc) s ostatcima Ser/Thr. To spajanje regulira široki raspon proteina preko interferencije s fosforilacijom. O-GlcNAc je dinamična posttranslacijska modifikacija koja je bitna za funkciju normalne stanice u sisavaca; njeno je, međutim, najveće značenje utvrđeno u patološkim procesima. Kako HBP iziskuje glukozu, veliki unos glukoze znatno povećava protok kroz HBP te također povećava omjer proteina povezanih s O-GlcNac. To, pak, utječe na različite funkcije stanice koje uključuju tradicijski prihvaćene štetne učinke u šećernoj bolesti i njenim komplikacijama ili, kao što je nedavno nađeno, O-GlcNAc bi mogao biti koristan kod ishemijskih/reperfuzijskih ozljeda. U ovom pregledu sažeto prikazujemo trenutne spoznaje u istraživanju O-GlcNAc vezane za njegovo sudjelovanje u signalnim putovima i staničnim procesima. Također se usredotočujemo na utjecaj O-GlcNAc u bolestima kao što su šećerna bolest, upala, razvoj zloćudnih bolesti ili ozljede uzrokovane hipoksijom.
Ključne riječi: O-GlcNAc, Ca2+, šećerna bolest, odgovor na stres, zloćudna bolest
Pristiglo: 22. ožujka 2007.                                                                                            Prihvaćeno: 17. kolovoza 2007.
 
 
Uvod
Osim što je izvor energije koja se dobiva glikolizom i citratnim ciklusom, glukoza sudjeluje u mnogim drugim unutarstaničnim metaboličkim putovima kao što je pentoza-fosfatni put, glikogeneza, sinteza nukleotidnih šećera itd. Jedan od tih putova je i put biosinteze heksozamina (HBP) te njegov krajnji produkt: proteinski vezana O-glikozilacija. Tijekom posljednjih su godina heksozaminski put i O-GlcNAc postali predmetom intenzivnog istraživanja, posebice stoga što bi mogli interferirati s kinazama i fosforilacijom u nekoliko signalnih putova (1). O-glikozilacija se odigrava unutar citoplazme i jezgre i uključuje osjetljive ciljne proteine zbog specifičnog i reverzibilnog enzimskog prijenosa metabolita heksozaminskog puta: UDP-N-acetilglukozamina na OH-skupinu aminokiselina proteina serina ili treonina.
O-GlcNAc je prvi put opisan 1984. godine (2) i otada je njegova važnost spoznata u nekoliko staničnih procesa kao što su prepoznavanje hranjivih tvari (3), regulacija staničnog ciklusa (4) ili modifikacija nekoliko čimbenika prijepisa (5-9). S obzirom na tako široku funkcionalnost O-GlcNAc ne iznenađuje da je povezan s razvojem brojnih patofizioloških procesa. Najočitije i dobro poznato značenje O-GlcNAc ustanovljeno je u kroničnim komplikacijama šećerne bolesti i inzulinske rezistencije (pregled pod 10); međutim, prilagodba na stres, osobito s obzirom na srce, odnedavno je također u središtu pozornosti (11,12). Donekle je paradoksno da dok je s jedne strane učinak povećanog protoka kroz heksozaminski put štetan kod šećerne bolesti, s druge se strane čini da je povećani O-GlcNAc blagotvoran kod bolesti zglobova kao što je osteoartritis, ili u situacijama akutnog stresa kao što je ishemijski srčani napadaj (13,14). Naš je cilj dati prošireni pregled mehanizama i teškoća kod signalnih putova, osvrnuti se na trenutno razumijevanje uloge GlcNAc u određenim bolestima, te postići što dublji uvid u dvostrana svojstva O-GlcNAc.
 
Put HBP
Približno 2-4% glukoze koja pristigne u stanicu metabolizira se putem biosinteze heksozamina (HBP). Ključni enzim je glutamin-fruktoza-6P-amidotransferaza (GFAT) koja katalizira reakciju: L-glutamin + D-fruktoza-6P = L-glutamat + D-glukozamin-6P. Tu je reakciju moguće zaobići tako što se glukozamin neposredno dodaje stanicama i time se povećava protok HBP. Nakon dva kasnija metabolita u protoku (N-acetilglukozamin-6P, N-acetilglukozamin-1P), krajnji produkt HBP je UDP-N-acetilglukozamin (UDP-GlcNAc).
UDP-GlcNAc se koristi u sintezi peptidoglikana, u sintezi lipo- i mukopolisaharida, biosintezi proteoglikana N-tipa (vezanog na amid „N” na pokrajnjem lancu Asn) ili O-tipa (najčešće se prvi N-acetilgalaktozamin (galNAc) veže α-glikozidnom vezom na OH-skupinu Ser/Thr, a zatim se spajaju dodatne ugljikohidratne molekule kao npr. GlcNAc), te biosintezi povezanoj glikozil-fosfatidilinozitolom (kojom se osigurava učvršćenje proteina na membrane). Proteinski povezan O-GlcNAc (Slika 1.) pripada O-tipu glikozilacije, no on dodaje samo jednu O-vezanu molekulu b-N-acetilglukozamina serinskim i treoninskim ostatcima ciljnih proteina (15). O-GlcNAc je također jedinstven po tome što se pojavljuje poglavito u citoplazmi i jezgri. O-vezani GlcNAc predstavlja reverzibilnu reakciju dok se preostale poslijetranslacijske glikozilacije, koje su trajne, zbivaju u endoplazmatskom retikulu (ER) ili Golgijevom aparatu. O-GlcNAc je brz, dinamičan proces; kratkotrajna primjena glukozamina ili izlaganje raznolikim uvjetima stresa mogu dovesti do povišenih razina proteinski vezanog O-GlcNAc (11,16). S druge strane, razine O-GlcNAc nakon oporavka od podražaja poprimaju prijašnje vrijednosti u relativno kratkom vremenskom razmaku (11). S obzirom da treba OH-ostatke Ser/Thr, O-GlcNAc može konkurirati fosforilaciji i time ukazuje na mogućnost preinačivanja signalnih slijedova (kaskada) ovisnih o fosforilaciji (1,17-19). Postoje, međutim, također dokazi da mjesta za fosforilaciju kao i za O-GlcNAc mogu istodobno biti prisutni na istom proteinu i u tom slučaju utjecati na funkcije proteina u suradnji, a ne na konkurentski način (20,21).
 
 
 
 
Slika 1. Odvijanje biosinteze heksozamina
 
Zanimljivo je da pored mnoštva kinaza samo jedan gen kodira O-GlcNAc-transferazu (OGT) koja je smještena na kromosomu X (22). Regulacija OGT zasad nije shvaćena u potpunosti, no postoje dokazi da je sama OGT meta kako fosforilacije, tako i O-GlcNAc (23). Uklanjanje N-acetilglukozaminske skupine iz proteina katalizira i specifičan enzim nazvan O-GlcNAkaza, a njegov je gen smješten na 10. kromosomu (24). Dokazivanje da je protein in vivo zaista O-glikoziliran iziskuje sveobuhvatne, višestruke pristupe kao što su imunoprecipitacija, dvodimenzionalna elektroforeza i spektrometrija masa tako da se istraživači u većini studija odlučuju za istodobno mjerenje ukupnih razina O-GlcNAc i aktivnosti i razina izražaja proteina od interesa. Najčešće korištena specifična antitijela protiv O-GlcNAc-proteina nazivaju se CTD110.6 i RL-2 (25,26). Postoji više načina da se na razine O-GlcNAc utječe eksperimentalno; npr. pretjeranim izražajem ili brisanjem/prigušivanjem gena ključnih enzima kao što su GFAT, OGT i O-GlcNAkaza (11,27-29). Treba istaknuti da unatoč tome što je moguće proizvesti stanične linije s pogreškom u HBP, prisutnost O-GlcNAc je od vitalnog značenja tako da genetički manipulirane životinje s OGT umiru u embrionalnom stadiju (22). Radi oponašanja dijabetičkih uvjeta protok kroz HBP može se povećati dodavanjem glukozamina izvana ili visokih koncentracija (25-30 mM) šećera (29). Kod korištenja vrsti stanica koje su ovisne o inzulinu te bez drugih dostupnih izvora energije (npr. laktata) posebna je pozornost potrebna kad su stanice izložene glukozaminu tijekom duljeg razdoblja jer glukozamin može iscrpsti razine ATP-a (30).
U studijama je također opisano da primjena glutamina ima sličan učinak (povećanjem aktivnosti GFAT) (31). Azaserin i 6-diazo-5-oksonorleukin (DON) inhibiraju GFAT te time smanjuju protok kroz HBP, dok aloksan inhibira OGT smanjujući time samo razine O-GlcNAc, uz relativno nepromijenjene ostale metabolite HBP (32). O-(2-acetamido-2-deoksi-D-glukopirnosiliden)amino-N-fenil-karbamat (PUGNAc) i streptozotocin (STZ) blokiraju O-GlcNAkazu, a time i uklanjanje O-GlcNAc iz proteina (33,34). Treba napomenuti da su aloksan i STZ nespecifični inhibitori; iako posebice STZ ima prijeporan učinak, on je unatoč tome lijek u širokoj uporabi u studijama na životinjama za izazivanje šećerne bolesti tipa 1 preko razaranja β-stanica gušterače.
Broj identificiranih proteina koji omogućuju poslijetranslacijsku O-glikozilaciju ubrzano raste te danas obuhvaća više od 400 staničnih proteina kao što su NF-κB, aneksin, endotelna dušična oksid-sintaza, αB-kristalin, OGT, α-tubulin, c-myc, protein 70 toplinskog šoka itd. Kako bi potpomogao istraživanje O-GlcNAc, Centar za analizu bioloških sekvenci ima internetske stranice dostupne na: http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/ gdje iznosi predviđanja vezana za živčanu mrežu i mjesta spajanja O-β-GlcNAc u eukariotskim proteinskim sekvencama.
 
Utjecaj O-GlcNAc na funkciju proteina
Modifikacija proteina preko O-GlcNAc definitivno izaziva promjene u njihovoj funkcionalnosti. Prva i temeljito istražena funkcija O-GlcNAc je odnos prema fosforilaciji (35,36). Wells i sur. su pokazali da OGT i proteinska fosfataza 1 koegzistiraju u zajedničkom kompleksu (37). U nekim su proteinima snižene razine O-GlcNAc povezane s povišenim razinama fosforilacije (Tau iz moždanog tkiva bolesnika s Alzheimerovom bolešću, 38). Nedavna je studija također dokazala da je fosforilacija p38 podložna modifikaciji pomoću GlcNAc (39). Dokazano je da inhibicija kinaza kao što su PKC i PKA može povećati razine O-GlcNAc (35). Ako se ti podatci razmotre zajedno, čini se da je najuobičajenija interakcija između fosforilacije i O-GlcNAc recipročna.
O-GlcNAc može također priječiti razgradnju proteina, bilo blokiranjem fosforilacijskih mjesta nužnih da bi pospješio razgradnju (npr. estrogenski receptor - ER - β koji ima sekvencu PEST = kratak život proteina signalizira područje bogato aminokiselinama prolinom - P, glutamičnom kiselinom - E, serinom - S, i treoninom - T), ili O-GlcNAc izravno blokira ciljna mjesta razgradnje proteina (npr. Sp1) (40,41). Postoje također dokazi koji ukazuju da je proteazom O-glikoziliran te da razina O-GlcNAc na proteazomima ovisi o prehrambenom stanju stanica (42). Prema toj hipotezi koncentracije glukoze te stoga i protok u HBP i O-GlcNAc smanjuju se tijekom izgladnjelosti stanice, pa se proteazom time rješava inhibicije i omogućuje da razgradnja proteina bude izvor energije.
Osim gore navedenih mehanizama, O-GlcNAc može također regulirati interakcije protein-protein i lokalizacije proteina (pregled u 1, 43). S obzirom da je ugljikohidrat, dodatavanje O-GlcNAc može promijeniti hidrofobnost proteina. Danas se malo zna o učinku O-GlcNAc na hidrofobnost proteina, premda postoje određeni dokazi da O-GlcNAc može promijeniti hidrofobne reakcije između proteina (42). Također, naši su nedavni, no još neobjavljeni rezultati, pokazali izmijenjenu osmotsku rezistenciju i difuziju unutarstanične vode nakon primjene glukozamina.
 
Uloga O-GlcNAc u unutarstaničnim procesima
Prepoznavanje hranjivih tvari
Uvjerljivi dokazi ukazuju da HBP i O-GlcNAc značajno sudjeluju u prepoznavanju hranjivih tvari (3). Visoke koncentracije glukoze uzrokuju povećani protok kroz HBP i kasnije povećavaju O-GlcNAc koji smanjuje iskorištenje glukoze negativnim mehanizmom povratne sprege. Protok kroz HBP, međutim, ne povećava samo glukoza već i slobodne masne kiseline, glutamin i glukozamin (3,44-46). Povišeni O-GlcNAc najprije inhibira ulazak glukoze kroz staničnu membranu povišenjem inzulinske rezistencije. Točan mehanizam koji je u osnovi inzulinske rezistencije nije još uvijek potpuno jasan, no postoji nekoliko studija koje otkrivaju oštećenje translokacije prijenosnika glukoze GLUT4 na staničnoj membrani kod primjene visokih koncentracija glukoze ili glukozamina (47,48). Ta se pojava može, primjerice, dovesti u vezu s poremećenom aktivacijom AKT za koju se pretpostavlja da je nužna za translokaciju GLUT4 ovisnu o inzulinu (vidjeti u nastavku).
O-GlcNAc također modulira sintezu glikogena (49). Glikogen-sintazu (GS) deaktivira glikogen-sintaza-kinaza 3 (GSK-3). Inzulin preko PI3-kinaze, AKT i PKC inhibira GSK-3 i time uzrokuje pojačanu aktivnost GS (50). Jedan način reguliranja O-GlcNAc jest blokiranje signalnog puta potaknutog inzulinom. Kao što je već navedeno, studije su već opisale da je nakon porasta O-GlcNAc aktivnost AKT bila smanjena bilo izravnom inhibicijom fosforilacije ili prethodnom inhibicijom kinaze (36). S druge je pak strane prikazano da sama GS može biti O-glikozilirana te da ta modifikacija inhibira njenu funkciju baš kao i fosforilacija pomoću GSK3 (21). Mehanizam koji je vjerojatan u tom slučaju predstavlja dobar primjer koji ukazuje da fosforilacija i O-GlcNAc zajednički djeluju u istom proteinu kako bi blokirali njegovu aktivnost.
 
Stanični ciklus
Postoji mnogo proteina koji su podložni O-GlcNAc, a koji su uključeni u stanični ciklus, kao što je to protoonkogen c-myc (51) ili citoskeletni proteini (regulacija diobenog vretena tijekom citokineze) poput α-tubulina i keratina 8,13,18 (52-54). O-GlcNAc također modificira YY1 (55), protein koji sudjeluje u preslikavanju DNA, staničnom rastu i diferencijaciji. Manjkava regulacija staničnog ciklusa predstavlja najznačajniji čimbenik u razvoju karcinoma te je stoga razumijevanje uloge O-GlcNAc iznimno bitno. Prekid HBP (npr. delecijom gena glukozamin-6P-acetiltransferaze) rezultira značajno smanjenim ukupnim koncentracijama O-GlcNAc. Zatajenje HBP je smrtonosno za eksperimentalne životinje u embrionalnom stadiju (22), no održanje staničnih linija s manjkavim HBP je moguće. Ipak, takve su stanične linije obilježene sporijim brzinama rasta i izmijenjenim staničnim ciklusima (56). S obzirom da povišeni O-GlcNAc također remeti stanični rast, čini se da se regulacija O-GlcNAc razlikuje u različitim stadijima staničnog ciklusa. Slawson i sur. su nedavno pokazali da je ispravno tretiranje O-GlcNAc nužno za normalan stanični ciklus te da je O-GlcNAc potreban za usklađivanje napredovanja M-faze, citokinezu i fosforilaciju proteina u mitozi (4).
 
Čimbenici prijepisa
Općenito, glavnina proteina koje modificira O-GlcNAc smještena je u jezgri i vezana za kromatin (57). U O-GlcNAc je također obilno prisutan kompleks jezgrenih pora (58), što ukazuje da O-GlcNAc modulira promet kroz jezgru. Ipak, nedavno je opisano da prisutnost O-GlcNAc nije nužna za prijenos kroz pore (59). Najvažnija uloga O-glikozilacije u jezgri je regulacija prijepisa (transkripcije). Popis poznatih čimbenika prijepisa koje O-GlcNAc povisuje ili smanjuje svakim je danom sve veća; Whelan i sur. su nedavno objavili obnovljeni popis (60). Neki od primjera tih čimbenika su Sp1 (41), p53 (8), CREB (5) i NF-κB (7). O-GlcNAc služi kao signal za lokalizaciju proteina u jezgri (17), a također i kao modifikacija u odnosu na transkripcijsku aktivnost. Modifikacija O-GlcNAc može povećati (p53 (8)) ili smanjiti (CREB (5)) transkripcijsku aktivnost, ili oboje (Sp1) (41,61,62). Moguće objašnjenje za takvu raznoliku funkcionalnost jest da bi na tim proteinima mogla biti prisutna višestruka mjesta za O-GlcNAc koja su odgovorna bilo za odgođenu razgradnju proteina (posljedica pojačane razgradnje je smanjena aktivnost) ili regulaciju (pozitivno ili negativno) aktivnosti prijepisa. NF-κB (vidjeti u nastavku) je prisutan u svim stanicama i aktivira ga širok raspon podražaja: stres, citokini, slobodni radikali ili antigeni. NF-κB ima važnu ulogu u imunom odgovoru, upali, autoimunim bolestima, šećernoj bolesti, karcinomu, te odgovoru na srčani stres tako da je modifikacija O-GlcNAc svakako od osobitog značenja (7,63,64).
 
Tretiranje Ca2+
Uzevši u obzir njegovu široku staničnu primjenjivost, vjerojatno je da bi O-GlcNAc mogao ometati regulaciju unutarstaničnog Ca2+, osobito kod stresa i epizoda ishemije/reperfuzije u kojima je [Ca2+]i ključni element preoblikovanja signala. Međudjelovanje između O-GlcNAc i fosforilacije je nepobitno dokazano; do sada, međutim, samo neizravni dokazi naznačuju takvo međudjelovanje s homeostazom [Ca2+]i (65).
Već je odavno poznato da je tzv. glukoza-inzulin-kalij (engl. glucose-insulin-potassium, GIK) blagotvoran za bolesnike zahvaćene ishemijom/reperfuzijom (66). Štoviše, u ispitivanjima na životinjama kratkotrajna hiperglikemija ili primjena glukozamina štiti od opterećenja s Ca2+ potaknutog ishemijom/reperfuzijom (67). Čini se da glukozamin također priječi ulaz kapacitacijskog kalcija (engl. capacitative calcium entry, CCE) koji predstavlja povećanje Ca2+ koje potiče IP3 (16,68). Kao što smo nedavno i dokazali, ta se inhibicija u kardiomiocitima zbiva preko O-GlcNAc (16) iako specifični ciljni proteini nisu poznati. Regulacija [Ca2+]i tijekom ishemije/reperfuzije u srcu je po sebi složen mehanizam koji nije poznat u svim detaljima; međutim, gore navedeni neizravni dokazi ukazuju da HBP i/ili O-GlcNAc moduliraju homeostazu [Ca2+]i.
Tijekom epizode ishemije ili nakon podražaja agonista kao što je angiotenzin II (AngII) aktivira se fosfolipaza C (PLC) koja stvara dva sekundarna glasnika, tj. inozitol-trifosfat (IP3) i diacil-glicerol (DAG). Porast Ca2+ može nastati i pomoću puta IP3 i puta DAG/PKC. IP3 otpušta Ca2+ iz ER (što je popraćeno ulaskom drugog Ca2+ iz izvanstaničnog prostora (nazvanog CCE)), dok PKC/DAG aktivira Ca2+-kanale u staničnoj membrani (L-tipa i vjerojatno druge Ca2+-kanale također). Nekoliko je članaka pokazalo da skupina TRPC (engl. transient receptor protein channel, kanal kratkotrajnog receptorskog proteina) proteina membrane ima važnu ulogu u regulaciji [Ca2+]i u srcu bilo preko aktivacije IP3 ili PKC-a (69).
O-GlcNAc može na nekoliko razina interferirati s tom regulacijom [Ca2+]i, npr. u PLC ili nakon receptora PLC: IP3 i/ili PKC i drugih kinaza. Uklanjanje i ponovni unos Ca2+ (izmjenjivači Na+/Ca2+, SERCA (sarko/endoplasmatska Ca2+ -ATPase), mitohondriji) mogu također biti zahvaćeni. Zapravo, nedavno je opisano da je O-GlcNAc smanjio aktivnost PLC te se time ukazalo na PLC kao moguću metu O-GlcNAc (65). Proteini TRPC su također vjerojatni kandidati za O-GlcNAc, npr. analiza proteinskog slijeda za TRPC1 ukazuje na visokoafinitetno mjesto za O-GlcNAc blizu završnog područja NH2.
Proteini O-GlcNAc povezani s [Ca2+]i koje smo do sada razmatrali utječu uglavnom na kratkotrajne poslijetranslacijske modifikacije. Alternativno, dugotrajna izloženost visokim koncentracijama glukoze također omogućuje promjene u izražaju jer modifikacija čimbenika prijepisa potaknuta s O-GlcNAc može utjecati na razine izražaja proteina uključenih u postupke s [Ca2+]i. Zapravo, za SERCA2a je izviješteno da ima smanjen izražaj nakon dulje inkubacije visoke glukoze i ta se promjena pripisala razini prijepisa (Sp1), a ne poslijetranslacijskoj modifikaciji (29). Zbog toga, čak i kad visoke koncentracije glukoze mogu u određenim okolnostima biti korisne za preživljenje stanica, prethodna povijest dugotrajne izloženosti visokim koncentracijama glukoze vjerojatno zasjenjuje blagotvorne učinke u ovom slučaju.
 
Uloga O-GlcNAc u patogenezi
Šećerna bolest
Šećernu bolest tipa 2 obilježavaju povišene koncentracije glukoze u krvi zbog inzulinske rezistencije perifernih stanica, kao i komplikacije šećerne bolesti prouzročene duljom izloženosti visokoj glukozi. Premda je još potrebno čekati na objašnjenje točnih mehanizama, glavnina studija slaže se u tome da O-GlcNAc doprinosi kako inzulinskoj rezistenciji, tako i razvoju komplikacija šećerne bolesti.
 
Inzulinska rezistencija
Smanjeni prijenos glukoze kroz membranu stanica rezultira inzulinskom rezistencijom. Uzrok tome je poremećena translokacija prijenosnika glukoze GLUT4 (koji je vjerojatno protein O-GlcNAc (70)). Tu translokaciju (kao i modeliranje i fuziju s membranom) reguliraju višestruki mehanizmi, uz inzulin i aktivaciju inzulinskog receptora kao najvažnije čimbenike. Sljedeći korak uključuje IRS-1 i IRS-2 (supstrati inzulinskog receptora) čiji je kapacitet vezanja O-GlcNAc nepobitno potvrđen (19,71,72). Nakon IRS;PI3kinaze, Akt, (smanjene aktivnosti kod inzulinske rezistencije) PKC, p38 i NF-κB (povećane aktivnosti kod inzulinske rezistencije) uključeni su u slijed (kaskadu) inzulinskog signalnog puta. Od navedenih su glasnika IRS (72) i PI3kinaza (19) O-GlcNAc-proteini, dok su vjerojatno Akt (72), p38 (39) i NF-κB (7) također kandidati za O-glikozilaciju. Iako je O-glikozilacija NF-κB još uvijek pretpostavka, aktivacija NF-κB u šećernoj bolesti je dobro opisana (7). Osim pomoću O-GlcNAc, NF-κB se može aktivirati pomoću AngII ili slobodnih radikala, što također doprinosi inzulinskoj rezistenciji.
Funkcionalnost Munc18c, regulatora modeliranja/fuzije vezikula (koji npr. sadrže GLUT4) na plazmatsku membranu, poremećena je kod primjene glukozamina ili visokih koncentracija glukoze (73). Munc18c je također podložan O-glikozilaciji. Iako navedeni dokazi ukazuju da O-GlcNAc ima ključnu ulogu u inzulinskoj rezistenciji, O-GlcNAc nije ni u kom slučaju nužan za razvoj tog poremećaja (74).
 
Komplikacije šećerne bolesti
Brownlee (75) je objavio najsveobuhvatniju pretpostavku kao objašnjenje temeljnoga molekularnog patomehanizma svih komplikacija šećerne bolesti kao što su ubrzana ateroskleroza, zatajenje perifernih živaca, te komplikacije vezane za bubrege i mrežnicu uzrokovane mikrovaskularnim oštećenjem. Prema tom autoru pretjerano stvaranje mitohondrijskog superoksida potaknuto hiperglikemijom blokira gliceraldehid-3P-dehidrogenazu, ključni enzim u glikolizi. Zbog toga su kasniji metaboliti usmjereni na druge putove; poliolni put, krajnje produkte glikacije (engl. advanced end-glycation products, AGE), aktivaciju PKC (zbog povećanog stvaranja DAG), te povećani protok kroz HBP. Kod komplikacija šećerne bolesti, HBP je povezan s povećanim izražajem TGFα (engl. transforming growth factor, transformirajući čimbenik rasta), TGF-β1 i PAI-1 (engl. plasminogen activator inhibitor, inhibitor aktivatora plazminogena) (62,76,77). Točna veza između TGF i HBP nije još otkrivena (pretpostavlja se da je to PKC (78)); međutim, čimbenik prijepisa Sp1, koji je O-GlcNAc-protein, povećava izražaj PAI-1.
Endotelna dušično-oksidna sintaza (eNOS) također je podložna O-glikozilaciji; činjenica da O-GlcNAc prikriva fosforilacijska mjesta Akt na eNOS-u sprječava aktivaciju Akt i time smanjuje koncentracije NO koji je snažan vazodilatator (19,79). HBP neizravno aktivira i put PKC, premda ne samom neposrednom O-glikozilacijom PKC već vjerojatno uključivanjem drugih kasnijih kinaza (80). Ako se razmotre zajedno, ti dokazi uvjerljivo ukazuju da O-glikozilacija proteina regulira mnogo staničnih procesa povezanih s šećernom bolesti, te da dugotrajni poremećaj HBP i/ili postupaka vezanih za O-GlcNAc dovodi do teških komplikacija šećerne bolesti.
 
Odgovor na stres
Kao što je već prethodno navedeno, glukozamin i visoka glukoza sprječavaju ishemijsku/reperfuzijsku ozljedu i paradoks vezan za Ca2+. Nedavno je pokazano da selektivno povećanje razina O-GlcNAc ima sličan učinak (14,16). Bilo u prokrvljenom srcu ili u štakora s traumatskim krvarenjem, glukozamin uzrokuje i povećane koncentracije O-GlcNAc kao i istodobno smanjenje ishemijskog oštećenja (14,81). PUGNAc, specifičan inhibitor O-GlcNAkaze, također štiti od hipoksijskog oštećenja u izoliranim kardiomiocitima (82).
S druge strane, stanice su bez ikakvog vanjskog zahvata sklone povećati svoje koncentracije O-GlcNAc kod stresa. Kao što su pokazali Hart i sur., odgovor na nekoliko različitih stresova (vrućina, hipoksija, osmotski stres) uključivao je povišeni O-GlcNAc (11). Slabljenje OGT ne samo da je poništilo O-GlcNAc povišen zbog stresa već je smanjilo i podnošenje stresa te preživljenje stanice. Čini se da takav rezultat podupire pretpostavku da je O-GlcNAc nužan element normalnog odgovora na stres.
Koji su specifični ciljni proteini povezani s O-glikozilacijom aktiviranom stresom? Čini se da su proteini toplinskog šoka (Hsp, engl. heat shock proteins) prvi razumni odgovor, jer zaista nekoliko takvih proteina predstavlja kandidate za O-GlcNAc (51,83). Također je ukazano da je izražaj Hsp70 pojačan nakon modifikacije O-GlcNAc (11). Glede O-GlcNAc, homeostaza [Ca2+]i bi mogla biti još jedan predmet regulacije. Hipoksija ili stres povećavaju [Ca2+]i, a Ca2+ je posrednikom u nekoliko štetnih učinaka ukoliko se početni stres ubrzano ne ukloni. Povećani [Ca2+]i aktivira unutarstanične glasnike kao što su kalcineurin, kalmodulin, NF-AT, PKC i kaspaze. Posljedica toga je aktivacija nekoliko čimbenika prijepisa tako da stanice umiru uslijed hipertrofije ili apoptoze. Zanimljivo je da hipoksija izaziva prijenos glukoze od strane Ca2+ (84), što je neizravan dokaz veze između [Ca2+]i i regulacije O-GlcNAc. Kao što je ranije spomenuto, pokazali smo da je manipuliranje O-GlcNAc utjecalo na regulaciju [Ca2+]i u kardiomiocitima (16). Povećane koncentracije O-GlcNAc u kardiocitima, nastale bilo povećanjem protoka kroz HBP zbog primjene glukozamina ili inhibiranja O-GlcNAkaze pomoću PUGNAc, sprječavaju porast bazalnog [Ca2+]i koji izaziva AngII (Slika 2). Moguće je da se taj inhibicijski učinak O-GlcNAc na razinu [Ca2+]i razvija preko višestrukih meta, npr. PLC ili kanala TRPC.
 
 
Slika 2. Povećane koncentracije O-GlcNAc inhibiraju porast [Ca2+]i izazvan od AngII. A) Lijevo: Primjena AngII (naznačena strelicom) uzrokuje ubrzani porast dijastoličkog [Ca2+]u neonatalnim kardiomiocitima štakora. Desno: prethodna primjena 5 mM glukozamina tijekom 10 minuta inhibira porast dijastoličkog [Ca2+] izazvanog od AngII. B) Promjene baznog [Ca2+] nakon primjene AngII u odnosu na kontrole. Glukozamin i PUGNAc, koji je inhibitor O-GlcNAkaze, oboje smanjuju porast [Ca2+]dok je aloksan, inhibitor OGT, djelomice poništio učinak glukozamina.
 
Uloga O-GlcNAc u odgovoru na stres može se opisati na sljedeći način: stres aktivira nekoliko signalnih putova, od kojih je najvažniji Ca2+ koji zaista na početku služi kao prirodan i nužan mehanizam prilagodbe. [Ca2+]i zatim olakšava ulazak glukoze u stanice, čime osigurava dodatni izvor energije. Međutim, mali udio glukoze prolazi kroz HBP i izaziva modulaciju i smanjenje [Ca2+]i te odgovora na stres od strane O-GlcNAc. Ako je stresni podražaj kratkotrajan ili ograničen, HBP može spriječiti pretjeranu reakciju stanice, no ako je podražaj dulji (no još uvijek nije smrtonosan) fiziološki porast O-GlcNAc često nije dovoljan da bi poništio štetne učinke preopterećenja s Ca2+.
O-GlcNAc se također dobro uklapa u teoriju preduvjetovanja: kratka, blaga ishemija ili stres smanjuju rizik i ozbiljnost kasnijeg ishemijskog napadaja (85). Preduvjetovanost se pripisuje i određenom broju signalnih putova kao što su Akt/PI3kinaza ili PKC (86). S obzirom da mu stres povećava koncentraciju, O-GlcNAc raste tijekom prvog podražaja, a kod druge izloženosti može pomoći u smanjivanju oštećenja izazvanog stresom. Kao i ranije, pretpostavljamo da se taj učinak zbiva pomoću višestrukih mehanizama i meta, a ne modificiranjem jedinstvenog odabranog glasnika. Vjerojatno je da ukupna razina O-GlcNAc u stanici odražava općenitu podnošljivost za stres i stanje prilagodbe u određenom vremenu.
Učinak HBP i O-GlcNAc u šećernoj bolesti i odgovoru na stres vrlo je proturječan. Moguće objašnjenje za to jest to činjenica da je šećerna bolest dugotrajna, kronična bolest kod koje su pridruženoj hiperglikemiji i povećanom O-GlcNAc potrebni mjeseci ili godine da bi razvili komplikacije šećerne bolesti, dok je O-glikozilacija izazvana stresom akutno i vrlo ubrzano stanje (12). To znači da su u šećernoj bolesti i stresu modificirani različiti proteini, ili pak da su uključeni isti proteini no da početna, kratkotrajna aktivacija nije dovoljna za pokretanje aktivacije signalnih slijedova (kaskada) i štetne učinke zapažene kod šećerne bolesti.
Za oboljele od šećerne bolesti dobro je poznato da imaju značajno povećani rizik za kardiovaskularno oštećenje i epizode ishemije. Za to je potrebna dugotrajna izloženost visokoj koncentraciji glukoze koja nepovratno oštećuje srčanožilni sustav. Tijekom akutnog napadaja ishemije mogući regulacijski porast O-GlcNAc je beznačajan u odnosu na sprječavanje ozljeda izazvanih hipoksijom. S druge strane, bolesnik koji nema šećernu bolest mogao bi imati veću korist od povećane glukoze i HBP koja je već uključena uporabom infuzija. Premda u krajnje teorijskom smislu, primjena glukozamina mogla bi imati iste ili bolje rezultate. Glukozamin je već u širokoj uporabi kao terapijski lijek kod osteoartritisa. On bi mogao imati prodijabetički učinak iako dosadašnje studije nisu to mogle nedvosmisleno dokazati (87). Čini se da je relativno neškodljiv u normalnoj dozi ili kod kratkotrajne primjene.
 
Upala
Uloga O-GlcNAc u upali je prijeporna. U šećernoj bolesti je aktiviran NF-κB, a i posrednici upale povećavaju svoj izražaj, primjerice TGF-β1 ili PAI-1 (62,77). Pretjerani izražaj TGF-β1 je vjerojatno povezan s aktivacijom PKC (78) koji sudjeluje u inzulinskoj rezistenciji i komplikacijama, dok promotor PAI-1 aktivira Sp1, jedan od prvih čimbenika prijepisa za kojega je utvrđeno da je O-glikoziliran.
S druge strane, nekoliko je studija opisalo da primjena glukozamina inhibira NF-κB u konjuktivnim stanicama (88) ili u hondrocitima (13). Ta inhibicija očigledno može objasniti blagotvorne učinke glukozamina kod osteoartritisa. Također je u studijama izviješteno da glukozamin sprječava proliferaciju T-stanica izazvanu CD3 (89) te utvrđeno da produžuje preživljenje kardijalnog alo-presatka u miševa (90). Autori druge publikacije predlažu da bi protuupalni i imunosupresijski učinak glukozamina mogao biti povezan s prolaznom izloženošću, dok je za inzulinsku rezistenciju nužna stalna prisutnost glukozamina.
 
Zloćudne bolesti
Postoji relativno malo dostupnih podataka o ulozi O-GlcNAc u zloćudnim bolestima. O-GlcNAc, međutim, ima značajnu ulogu u staničnom ciklusu, a brojni su čimbenici prijepisa podložni O-glikozilaciji. Primjerice, za protoonkogen c-myc je utvrđeno da je O-glikoziliran, a mjesto(a) O-GlcNAc je smješteno unutar ili blizu N-terminalne domene aktivacije prijepisa/zloćudne transformacije, područja gdje se mutacije često nalaze u Burkittovim i s AIDS-om povezanim limfomima (91). Za supresor tumora p53 također je utvrđeno da je O-glikoziliran; čini se da O-GlcNAc modulira njegovu sposobnost vezanja DNA (8) ili blokira fosforilaciju koja odgađa proteolitsku razgradnju p53 (92).
Čimbenik prijepisa Sp1 također se često povezuje s karcinomima (93). Sp1 je povezan sa stanjem hipoglikozilacije i ubrzano ga razgrađuje proteazom, no ta se razgradnja može spriječiti primjenom glukoze ili glukozamina (41). Drugo, Sp1 sadrži jedinstveni ostatak O-GlcNAc čija modifikacija inhibira hidrofobne interakcije između Sp1 i dva spoja: proteinski povezanog čimbenika koji veže TATA (TAFII110) te holo-Sp1 (61). Roos i sur. predlažu da Sp1 nakon vezanja DNA mora izgubiti svoj ostatak O-GlcNAc pomoću nestalnog mehanizma uz fosforilaciju kako bi vezao TAFII110, holo-Sp1 i pokrenuo prijepis.
Hipermetilirani gen u karcinomu 1 (HIC1) je kandidat za gen supresora tumora kojega O-GlcNAc modificira u nekoliko zloćudnih staničnih linija; čini se, međutim, da O-glikozilacija utječe na stabilnost, a ne afinitet za vezanje DNA (94). Konačno, O-GlcNAc može modificirati i RNA polimerazu II. Jedna studija izvještava da OGT međusobno djeluje s kompleksom histonske deacetilaze vezanjem na korepresor mSin3A te potiskuje prijepis usporedo s deacetilacijom histona. mSin3A usmjerava OGT na promotore kako bi inaktivirao čimbenike prijepisa i RNA polimerazu II modifikacijom O-GlcNAc (95).
Način na koji O-GlcNAc utječe na razvoj zloćudnih poremećaja još uvijek je sporan zato jer O-GlcNAc može spriječiti razgradnju čimbenika prijepisa, no čini se da također izravno blokira ili aktivira te iste čimbenike. Za razumijevanje složenog ponašanja O-glikozilacije biti će potrebno uzeti u obzir lokalizaciju, prostornu organizaciju OGT te također kartiranje pojedinačnih (a moguće i višestrukih) mjesta za O-GlcNAc na čimbenicima prijepisa.
 
Zaključci
Dokazi utvrđeni tijekom posljednja dva desetljeća ukazuju na O-GlcNAc kao jedinstven no važan unutarstanični signalni mehanizam koji obuhvaća i sudjeluje u skoro svakom staničnom događaju, bilo fiziološkom ili patološkom. Premda je O-glikozilacija općenit, uobičajen proces u stanici kojega regulira jedan enzim - OGT, mehanizam, učinci i proteini podložni modifikaciji O-GlcNAc su visokospecifični. To se postiže prostornom i vremenskom organizacijom te usklađenošću s fosforilacijom. Modulacija nekoliko signalnih događaja u šećernoj bolesti, stresu, zloćudnim bolestima ili u upali nesumnjivo zaslužuje pozornost u daljnjem istraživanju. Premda su povećane koncentracije O-GlcNAc očigledno štetne u šećernoj bolesti, razjašnjenje njegove uloge u odgovoru na akutni stres moglo bi predstavljati veliki korak naprijed prema poboljšanoj prevenciji ishemijskih/reperfuzijskih ozljeda. Možemo se nadati da će bolje razumijevanje O-GlcNAc u budućnosti pomoći kako u smanjenju komplikacija šećerne bolesti, tako i u povećanju životnog vijeka bolesnika s ishemijom.
 
Literatura
1     Zachara NE, Hart GW. Cell signaling, the essential role of O-GlcNAc! Biochim Biophys Acta 2006;1761:599-617.
2     Torres CR, Hart GW. Topography and polypeptide distribution of terminal N-acetylglucosamine residues on the surfaces of intact lymphocytes. Evidence for O-linked GlcNAc. J Biol Chem 1984;259:3308-17.
3     Wells L, Vosseller K, Hart GW. A role for N-acetylglucosamine as a nutrient sensor and mediator of insulin resistance. Cell Mol Life Sci 2003;60:222-8.
4     Slawson C, Zachara NE, Vosseller K, Cheung WD, Lane MD, Hart GW. Perturbations in O-linked beta-N-acetylglucosamine protein modification cause severe defects in mitotic progression and cytokinesis. J Biol Chem 2005;280:32944-56.
5     Lamarre-Vincent N, Hsieh-Wilson LC. Dynamic glycosylation of the transcription factor CREB: a potential role in gene regulation. J Am Chem Soc 2003;125:6612–3.
6     Jackson SP, Tjian R. O-glycosylation of eukaryotic transcription factors: implications for mechanisms of transcriptional regulation. Cell 1988; 55:125–33.
7     James LR, Tang D, Ingram A, Ly H, Thai K, Cai L, Scholey JW. Flux through the hexosamine pathway is a determinant of nuclear factor κB-dependent promoter activation. Diabetes 2002;51:1146–56.
8     Shaw P, Freeman J, Bovey R, Iggo R. Regulation of specific DNA binding by p53: evidence for a role for O-glycosylation and charged residues at the carboxy-terminus. Oncogene 1996;12:921–30.
9     Hiromura M, Choi CH, Sabourin NA, Jones H, Bachvarov D, Usheva A. YY1 is regulated by O-linked N-acetylglucosaminylation (O-GlcNAcylation). J Biol Chem 2003;278:14046–52.
10   Buse MG. Hexosamines, insulin resistance, and the complications of diabetes: current status. Am J Physiol Endocrinol Metab 2006;290:E1-E8.
11   Zachara NE, O’Donnell N, Cheung WD, Mercer JJ, Marth JD, Hart GW. Dynamic O-GlcNAc modification of nucleocytoplasmic proteins in response to stress. A survival response of mammalian cells. J Biol Chem 2004;279:30133-42.
12   Fulop N, Marchase RB, Chatham JC. Role of protein O-linked N-acetylglucosamine in mediating cell function and survival in the cardiovascular system. Cardiovasc Res 2007;73:288-97.
13   Largo R, Alvarez-Soria MA, Diez-Ortego I, Calvo E, Sanchez-Pernaute O, Egido J, Herrero-Beaumont G. Glucosamine inhibits IL-1beta-induced NFkappaB activation in human osteoarthritic chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage 2003;11:290-8.
14   Liu J, Pang Y, Chang T, Bounelis P, Chatham JC, Marchase RB. Increased hexosamine biosynthesis and protein O-GlcNAc levels associated with myocardial protection against calcium paradox and ischemia. J Mol Cell Cardiol 2006;40:303-12.
15   Snow DM, Hart GW. Nuclear and cytoplasmic glycosylation. Int Rev Cytol 1998;181:43-74.
16   Nagy T, Champattanachai V, Marchase RB, Chatham JC. Glucosamine inhibits angiotensin II-induced cytoplasmic Ca2+ elevation in neonatal cardiomyocytes via protein-associated O-linked N-acetylglucosamine. Am J Physiol Cell Physiol 2006;290:C57-65.
17   Lefebvre T, Ferreira S, Dupont-Wallois L, Bussiere T, Dupire MJ, Delacourte A, et al. Evidence of a balance between phosphorylation and O-GlcNAc glycosylation of Tau proteins–a role in nuclear localization. Biochim Biophys Acta 2003;1619:167–76.
18   Kelly WG, Dahmus ME, Hart GW. RNA polymerase II is a glycoprotein. Modification of the COOH-terminal domain by O-GlcNAc. J Biol Chem 1993;268:10416–24.
19   Federici M, Menghini R, Mauriello A, Hribal ML, Ferrelli F, Lauro D, et al. Insulin-dependent activation of endothelial nitric oxide synthase is impaired by O-linked glycosylation modification of signaling proteins in human coronary endothelial cells. Circulation 2002;106:466–72.
20   Reason AJ, Morris HR, Panico M, Marais R, Treisman RH, Haltiwanger RS, et al. Localization of O-GlcNAc modification on the serum response transcription factor. J Biol Chem 1992;267:16911–21.
21   Parker GJ, Lund KC, Taylor RP, McClain DA. Insulin resistance of glycogen synthase mediated by o-linked N-acetylglucosamine. J Biol Chem 2003;278:10022–7.
22   Shafi R, Lyer SP, Ellies LG, O’Donnell N, Marek KW, Chui D, et al. The O-GlcNAc transferase gene resides on the X chromosome and is essential for embryonic stem cell viability and mouse ontogeny. Proc Natl Acad Sci USA 2000;97:5735–9.
23   Kreppel LK, Blomberg MA, Hart GW. Dynamic glycosylation of nuclear and cytosolic proteins: cloning and characterization of a unique O-GlcNAc transferase with multiple tetratricopeptide repeats. J Biol Chem 1997;272:9308–15.
24   Wells L, Gao Y, Mahoney JA, Vosseller K, Chen C, Rosen A, Hart GW Dynamic O-glycosylation of nuclear and cytosolic proteins: further characterization of the nucleocytoplasmic beta-N-acetylglucosaminidase, O-GlcNAcase. J Biol Chem 2002;277:1755–61.
25   Comer FI, Vosseller K, Wells L, Accavitti MA, Hart GW. Characterization of a mouse monoclonal antibody specific for O-linked N-acetylglucosamine. Anal Biochem 2001;293:169-77.
26   Snow CM, Senior A, Gerace L. Monoclonal antibodies identify a group of nuclear pore complex glycoproteins. J Cell Biol 1987;104:1143-56.
27   James LR, Fantus IG, Goldberg H, Ly H, Scholey JW. Overexpression of GFAT activates PAI-1 promoter in mesangial cells. Am J Physiol Renal Physiol 2000;279:F718-27.
28   McClain DA, Lubas WA, Cooksey RC, Hazel M, Parker GJ, Love DC, Hanover JA. Altered glycan-dependent signaling induces insulin resistance and hyperleptinemia. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:10695–9.
29   Clark RJ, McDonough PM, Swanson E, Trost SU, Suzuki M, Fukuda M, Dillmann WH. Diabetes and the accompanying hyperglycemia impairs cardiomyocyte calcium cycling through increased nuclear O-GlcNAcylation. J Biol Chem 2003;278:44230-7.
30   Hresko RC, Heimberg H, Chi MM, Mueckler M. Glucosamine-induced insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes is caused by depletion of intracellular ATP. J Biol Chem 1998;273:20658-68.
31   Liu J, Marchase RB, Chatham JC. Glutamine-induced protection of isolated rat heart from ischemia/reperfusion injury is mediated via the hexosamine biosynthesis pathway and increased protein O-GlcNAc levels. J Mol Cell Cardiol 2007;42:177-85.
32   Konrad RJ, Zhang F, Hale JE, Knierman MD, Becker GW, Kudlow JE. Alloxan is an inhibitor of the enzyme O-linked N-acetylglucosamine transferase. Biochem Biophys Res Commun. 2002;293:207-12.
33   Haltiwanger RS, Grove K, Philipsberg GA. Modulation of O-linked N-acetylglucosamine levels on nuclear and cytoplasmic proteins in vivo using the peptide O-GlcNAc-beta-N-acetylglucosaminidase inhibitor O-(2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranosylidene)amino-N-phenylcarbamate. J Biol Chem 1998;273:3611-7.
34   Konrad RJ, Mikolaenko I, Tolar JF, Liu K, Kudlow JE. The potential mechanism of the diabetogenic action of streptozotocin: inhibition of pancreatic β-cell O-GlcNAc-selective N-acetyl-β-D-glucosaminidase. Biochem J 2001;356:31–41.
35   Griffith LS, Schmitz B. O-linked N-acetylglucosamine levels in cerebellar neurons respond reciprocally to pertubations of phosphorylation. Eur J Biochem 1999;262:824–31.
36   Vosseller K, Wells L, Lane MD, Hart GW. Elevated nucleocytoplasmic glycosylation by O-GlcNAc results in insulin resistance associated with defects in Akt activation in 3T3-L1 adipocytes. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:5313–8.
37   Wells L, Kreppel LK, Comer FI, Wadzinski BE, Hart GW. OglcNAc transferase is in a functional complex with protein phosphatase 1 catalytic subunits. J Biol Chem 2004;279:38466–70.
38   Robertson LA, Moya KL, Breen KC. The potential role of tau protein Oglycosylation in Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis 2004;6:489–95.
39   Fulop N, Zhang Z, Marchase RB, Chatham JC. Glucosamine cardioprotection in perfused rat heart associated with increased O-Linked N-acetylglucosamine protein modification and altered p38 activation. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007;292:H2227-36.
40   Cheng X, Hart GW. Alternative O-glycosylation/O-phosphorylation of serine-16 in murine estrogen receptor beta: posttranslational regulation of turnover and transactivation activity. J Biol Chem 2001;276:10570–5.
41   Han I, Kudlow JE. Reduced O-glycosylation of Sp1 is associated with increased proteasome susceptibility. Mol Cell Biol 1997;17:2550–8.
42   Zhang F, Su K, Yang X, Bowe DB, Paterson AJ, Kudlow JE. OglcNAc modification is an endogenous inhibitor of the proteasome. Cell 2003;115:715–25.
43   Kamemura K, Hart GW. Dynamic interplay between O-glycosylation and O-phosphorylation of nucleocytoplasmic proteins: a new paradigm for metabolic control of signal transduction and transcription. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 2003;73:107-36.
44   Hawkins M, Barzilai N, Liu R, Hu M, Chen W, Rossetti L. Role of the glucosamine pathway in fat-induced insulin resistance. J Clin Invest 1997;99:2173–82.
45   Marshall S, Bacote V, Traxinger RR. Complete inhibition of glucose-induced desensitization of the glucose transport system by inhibitors of mRNA synthesis. Evidence for rapid turnover of glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase. J Biol Chem 1991;266: 10155–61.
46   Rossetti L, Hawkins M, Chen W, Gindi J, Barzilai N. In vivo glucosamine infusion induces insulin resistance in normoglycemic but not in hyperglycemic conscious rats. J Clin Invest 1995;96:132–40.
47   Robinson KA, Sens DA, Buse MG. Pre-exposure to glucosamine induces insulin resistance of glucose transport and glycogen synthesis in isolated rat skeletal muscles. Study of mechanisms in muscle and in rat-1 fibroblasts overexpressing the human insulin receptor. Diabetes 1993;42:1333–46.
48   Ross SA, Chen X, Hope HR, Sun S, McMahon EG, Broschat K et al. Development and comparison of two 3T3-L1 adipocyte models of insulin resistance: increased glucose flux vs glucosamine treatment. Biochem Biophys Res Commun 2000;273: 1033–41.
49   Parker G, Taylor R, Jones D, McClain D. Hyperglycemia and inhibition of glycogen synthase in streptozotocin-treated mice: role of O-linked N-acetylglucosamine. J Biol Chem 2004;279:20636–42.
50   Oriente F, Formisano P, Miele C, Fiory F, Maitan MA, Vigliotta G, et al. Insulin receptor substrate-2 phosphorylation is necessary for protein kinase C zeta activation by insulin in L6hIR cells. J Biol Chem 2001;276:37109-19.
51   Kamemura K, Hayes BK, Comer FI, Hart GW. Dynamic interplay between O-glycosylation and O-phosphorylation of nucleocytoplasmic proteins: alternative glycosylation/phosphorylation of THR-58, a known mutational hot spot of c-Myc in lymphomas, is regulated by mitogens. J Biol Chem 2002;277:19229–35.
52   Walgren JL, Vincent TS, Schey KL, Buse MG. High glucose and insulin promote O-GlcNAc modification of proteins, including α-tubulin. Am J Physiol Endocrinol Metab 2003;284:424–34.
53   King IA, Hounsell EF. Cytokeratin 13 contains O-glycosidically linked N-acetylglucosamine residues. J Biol Chem 1989;264:14022–8.
54   Chou CF, Smith AJ, Omary MB. Characterization and dynamics of O-linked glycosylation of human cytokeratin 8 and 18. J Biol Chem 1992;267:3901-6.
55   Hiromura M, Choi CH, Sabourin NA, Jones H, Bachvarov D, Usheva A. YY1 is regulated by O-linked N-acetylglucosaminylation (O-GlcNAcylation). J Biol Chem 2003;278:14046–52.
56   Boehmelt G, Wakeham A, Elia A, Sasaki T, Plyte S, Potter J, et al. Decreased UDP-GlcNAc levels abrogate proliferation control in EMeg32-deficient cells. EMBO J 2000;19:5092-104.
57   Kelly WG, Hart GW. Glycosylation of chromosomal proteins: localization of O-linked N-acetylglucosamine in Drosophila chromatin. Cell 1989;57:243–51.
58   Hanover JA, Cohen CK, Willingham MC, Park MK. O-linked N-acetylglucosamine is attached to proteins of the nuclear pore. Evidence for cytoplasmic and nucleoplasmic glycoproteins. J Biol Chem 1987;262:9887–94.
59   Miller MW, Hanover JA. Functional nuclear pores reconstituted with beta 1-4 galactose-modified O-linked N-acetylglucosamine glycoproteins. J Biol Chem 1994;269:9289–97.
60   Whelan SA, Hart GW. Proteomic approaches to analyze the dynamic relationships between nucleocytoplasmic protein glycosylation and phosphorylation. Circ Res 2003;93:1047-58.
61   Roos MD, Su K, Baker JR, Kudlow JE. O-Glycosylation of an Sp1-derived peptide blocks known Sp1 protein interactions. Mol Cell Biol 1997;17:6472–80.
62   Goldberg HJ, Whiteside CI, Hart GW, Fantus IG. Posttranslational, reversible O-glycosylation is stimulated by high glucose and mediates plasminogen activator inhibitor-1 gene expression and Sp1 transcriptional activity in glomerular mesangial cells. Endocrinology 2006;147:222-31 Erratum in: Endocrinology 2006;147:5490.
63   Freund C, Schmidt-Ullrich R, Baurand A, Dunger S, Schneider W, Loser P, et al. Requirement of nuclear factor-kappaB in angiotensin II- and isoproterenol-induced cardiac hypertrophy in vivo. Circulation 2005;111:2319-25.
64   Umezawa K. Inhibition of tumor growth by NF-kappaB inhibitors. Cancer Sci 2006;97:990-5.
65   Kim YH, Song M, Oh YS, Heo K, Choi JW, Park JM, et al. Inhibition of phospholipase C-beta1-mediated signaling by O-GlcNAc modification. J Cell Physiol 2006;207:689-96.
66   Schipke JD, Friebe R, Gams E. Forty years of glucose-insulin-potassium (GIK) in cardiac surgery: a review of randomized, controlled trials. Eur J Cardiothorac Surg 2006;29:479-85.
67   Schaffer SW, Croft CB, Solodushko V. Cardioprotective effect of chronic hyperglycemia: effect on hypoxia-induced apoptosis and necrosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2000;278:H1948-54.
68   Hunton DL, Lucchesi PA, Pang Y, Cheng X, Dell’Italia LJ, Marchase RB. Capacitative calcium entry contributes to nuclear factor of activated T-cells nuclear translocation and hypertrophy in cardiomyocytes. J Biol Chem 2002;277:14266-73.
69   Bush EW, Hood DB, Papst PJ, Chapo JA, Minobe W, Bristow MR, et al. Canonical transient receptor potential channels promote cardiomyocyte hypertrophy through activation of calcineurin signaling. J Biol Chem 2006;281:33487-96.
70   Buse MG, Robinson KA, Marshall BA, Hresko RC, Mueckler MM. Enhanced O-GlcNAc protein modification is associated with insulin resistance in GLUT1-overexpressing muscles. Am J Physiol Endocrinol Metab 2002;283:241–50.
71   Andreozzi F, D’Alessandris C, Federici M, Laratta E, Del Guerra S, Del Prato S, et al. Activation of the hexosamine pathway leads to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 on Ser307 and Ser612 and impairs the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/mammalian target of rapamycin insulin biosynthetic pathway in RIN pancreatic beta-cells. Endocrinology 2004;145:2845–57.
72   Park SY, Ryu J, Lee W. O-GlcNAc modification on IRS-1 and Akt2 by PUGNAc inhibits their phosphorylation and induces insulin resistance in rat primary adipocytes. Exp Mol Med 2005;37:220-9.
73   Chen G, Liu P, Thurmond DC, Elmendorf JS. Glucosamine-induced insulin resistance is coupled to O-linked glycosylation of Munc18c. FEBS Lett 2003;534:54–60.
74   Robinson KA, Ball LE, Buse MG. Reduction of O-GlcNAc protein modification does not prevent insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes. Am J Physiol Endocrinol Metab 2007;292:E884-90.
75   Brownlee M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 2001;414:813-20.
76   Daniels MC, Kansal P, Smith TM, Paterson AJ, Kudlow JE, McClain DA. Glucose regulation of transforming growth factor-alpha expression is mediated by products of the hexosamine biosynthesis pathway. Mol Endocrinol 1993;7:1041–8.
77   Kolm-Litty V, Sauer U, Nerlich A, Lehmann R, Schleicher ED. High glucose-induced transforming growth factor beta1 production is mediated by the hexosamine pathway in procine glomerular mesangial cells. J Clin Invest 1998;101:160–9.
78   Weigert C, Brodbeck K, Sawadogo M, Haring HU, Schleicher ED. Upstream stimulatory factor (USF) proteins induce human TGF-beta1 gene activation via the glucose-response element-1013/-1002 in mesangial cells: up-regulation of USF activity by the hexosamine biosynthetic pathway. J Biol Chem 2004;279:15908–15.
79   Du XL, Edelstein D, Dimmeler S, Ju Q, Sui C, Brownlee M. Hyperglycemia inhibits endothelial nitric oxide synthase activity by posttranslational modification at the Akt site. J Clin Invest 2001;108:1341–8.
80   Matthews JA, Acevedo-Duncan M, Potter RL. Selective decrease of membrane-associated PKC-alpha and PKC-epsilon in response to elevated intracellular O-GlcNAc levels in transformed human glial cells. Biochim Biophys Acta 2005;1743:305-15.
81   Yang S, Zou LY, Bounelis P, Chaudry I, Chatham JC, Marchase RB. Glucosamine administration during resuscitation improves organ function after trauma hemorrhage. Shock 2006;25:600-7.
82   Champattanachai V, Marchase RB, Chatham JC. Glucosamine protects neonatal cardiomyocytes from ischemia-reperfusion injury via increased protein-associated O-GlcNAc. Am J Physiol Cell Physiol 2007;292:C178-87.
83   Roquemore EP, Chevrier MR, Cotter RJ, Hart GW. Dynamic O-GlcNAcylation of the small heat shock protein αB-crystallin. Biochemistry 1996;35:3578–86.
84   Wright DC, Geiger PC, Holloszy JO, Han DH. Contraction- and hypoxia-stimulated glucose transport is mediated by a Ca2+-dependent mechanism in slow-twitch rat soleus muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab 2005;288:E1062-6.
85   Bolli R. Preconditioning: a paradigm shift in the biology of myocardial ischemia. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007;292:H19-27.
86   Hausenloy DJ, Yellon DM. Survival kinases in ischemic preconditioning and postconditioning. Cardiovasc Res 2006;70:240-53.
87   Marshall PD, Poddar S, Tweed EM, Brandes L. Clinical inquiries: Do glucosamine and chondroitin worsen blood sugar control in diabetes? J Fam Pract 2006;55:1091-3.
88   Chen JT, Chen CH, Horng CT, Chien MW, Lu DW, Liang JB, et al. Glucosamine sulfate inhibits proinflammatory cytokine-induced ICAM-1 production in human conjunctival cells in vitro. J Ocul Pharmacol Ther 2006;22:402-16.
89   Forchhammer L, Thorn M, Met O, Gad M, Weidner MS, Claesson MH. Immunobiological effects of glucosamine in vitro. Scand J Immunol 2003;58:404-11.
90   Ma L, Rudert WA, Harnaha J, Wright M, Machen J, Lakomy R, et al. Immunosuppressive effects of glucosamine. J Biol Chem 2002;277:39343-9.
91   Chou TY, Hart GW. O-linked N-acetylglucosamine and cancer: messages from the glycosylation of c-Myc. Adv Exp Med Biol 2001;491:413-8.
92   Yang WH, Kim JE, Nam HW, Ju JW, Kim HS, Kim YS, Cho JW. Modification of p53 with O-linked N-acetylglucosamine regulates p53 activity and stability. Nat Cell Biol 2006;8:1074-83.
93   Kanai M, Wei D, Li Q, Jia Z, Ajani J, Le X, et al. Loss of Kruppel-like factor 4 expression contributes to Sp1 overexpression and human gastric cancer development and progression. Clin Cancer Res 2006;12:6395-402.
94   Lefebvre T, Pinte S, Guerardel C, Deltour S, Martin-Soudant N, Slomianny MC, et al. The tumor suppressor HIC1 (hypermethylated in cancer 1) is O-GlcNAc glycosylated. Eur J Biochem 2004;271:3843-54.
95   Yang X, Zhang F, Kudlow JE. Recruitment of O-GlcNAc transferase to promoters by corepressor mSin3A: coupling protein O-GlcNAcylation to transcriptional repression. Cell 2002;110:69-80.

Izvorni stručni članak

 
Jelena Kozar, Ana-Maria Šimundić, Nora Nikolac, Marijana Žirović, Elizabeta Topić. Analitička evaluacija glukometra Accu Chek Compact Plus. Biochemia Medica 2008;18(3):361-7.
Klinički zavod za kemiju, Klinička bolnica „Sestre milosrdnice“, Zagreb
*Adresa za dopisivanje:am [dot] simundic [at] gmail [dot] com
 
Sažetak
Cilj: Cilj našeg istraživanja bio je odrediti netočnost i nepreciznost Accu Chek Compact Plus glukometra usporedbom s referentnim laboratorijskim sustavom.
Metoda: Kao referentna metoda za određivanje koncentracije glukoze korišten je originalni reagens tvrtke Olympus. Razlika između koncentracija izmjerenih na analizatoru Olympus i glukometeru Accu Chek određivana je parnim t-testom. Netočnost glukometra je određivana: izračunom odstupanja (%), regresijskom analizom Passing-Bablock, analizama Bland-Altman i Clarke error grid. Nepreciznost glukometra je određivana mjerenjem 10 uzastopnih mjerenja na tri razine koncentracija glukoze.
Rezultati: Srednje odstupanje glukometra Accu Chek iznosilo je -6,6%; analiza Passing-Bablock je pokazala kako nije bilo značajnog odstupanja od linearnosti; analiza Bland-Altman pokazala je da se više od 95% rezultata nalazilo unutar ± 1.96 SD. Svi rezultati analize Clarke Error Grid su bili 100% unutar zone A.
Zaključak: Glukometar Accu Chek Compact Plus pokazao je zadovoljavajuću nepreciznost i netočnost i može se koristiti za dnevnu kontrolu glukoze kao zamjenska metoda za naš laboratorijski referentni sustav.
Ključne riječi: netočnost; nepreciznost; analitička evaluacija; uređaj za samokontrolu koncentracije glukoze; analiza Bland-Altman; analiza Clarke Error Grid
Pristiglo: 18. kolovoza 2008.                                                                                              Prihvaćeno: 10. rujna 2008.
 
 
Uvod
Uređaji za samokontrolu koncentracije glukoze osiguravaju brzu informaciju o koncentraciji glukoze u krvi i nisu namijenjene za postavljanja dijagnoze (1). Ti uređaji su vrlo jednostavni za upotrebu, mali i vrlo praktični za široku primjenu. No, uočeno je da uređaji za samokontrolu koncentracije glukoze u krvi imaju upitnu netočnost i nisku nepreciznost. (2). Primarni cilj ovog istraživanja bio je evaluirati glukometar Accu Chek Compact Plus tvrtke Roche, tako da se usporedi njegova netočnost i nepreciznost s našim laboratorijskim referentnim sustavom. Kriteriji prihvaćanja su bili: nepreciznost < 5%, netočnost < 10%.
 
Materijali i metode
Ispitanici
Uzorci krvi su sakupljani od ambulantnih bolesnika koji su dolazili na redovitu kontrolu glukoze u krvi, tijekom rujna 2007. godine. Svi su bolesnici pristali sudjelovati u ovom istraživanju.
 
Uzorci
Krv je vadio vrlo iskusan laboratorijski tehničar. Kapilarna krv je skupljana nakon jednog uboda lancetom u jagodicu prsta i odmah je izmjerena koncentracija glukoze na glukometru. Potom je od svakog bolesnika skupljeno 500 mL pune krvi u epruvete BD Microtainer® uz dodatak NaF/Na2-EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA), uzorak je centrifugiran na 3500g 10 minuta i koncentracija glukoze u plazmi je određena na referentnom analizatoru Olympus AU 2700 (Olympus, Tokyo, Japan).
 
Analizator Olympus AU 2700
Koncentracija glukoze određivala se s originalnim reagensom na analizatoru Olympus AU 2700 (Olympus, Hamburg, Germany), enzimatskom metodom s heksokinazom. Metoda se kalibrirala dnevno, a unutarnja analitička kontrola kvalitete provodila se na dvije razine komercijalnim kontrolnim uzorcima Olympus Control Level 1 i 2 (Olympus, Hamburg, Germany; O1 = 5,4 mmol/L i O2 = 13,2 mmol/L) svakih osam sati i/ili nakon 100 provedenih mjerenja. Kalibratori su sljedivi prema referentnom materijalu National Institute of Standards and Technology Standard reference Material (NIST SRM 965).
Prema navodima proizvođača, metoda je linearna u rasponu koncentracija 0,6–45,0 mmol/L; donja granica detekcije je 0,04 mmol/L; nepreciznost u seriji izražena koeficijentom varijacije (engl. coefficient of variation, CV) je 0,9% za O1 i 1,0% za O2, dok je netočnost metode -0.2% za O1 i 0.4% za O2 (3).
 
Prenosivi uređaj za samokontrolu glukoze u krvi Accu Chek Compact Plus
Prenosivi uređaj za samokontrolu glukoze u krvi Accu Chek Compact Plus (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) koristi enzimatsku metodu s glukoza-oksidazom, uz detekciju refleksnom fotometrijom.
Prema navodima proizvođača metoda je linearna u rasponu koncentracija 0,6–33,3 mmol/L, donja granica detekcije je 0,6 mmol/L, a srednja nepreciznost u seriji izražena koeficijentom varijacije je < 2% (4).
 
Statistička analiza
Normalnost raspodjela je ispitana Kolmogorov-Smirnovljevim testom. Značajnost razlike između koncentracija glukoze mjerene na analizatoru Olympus AU 2700 i uređaju Accu Chek ispitana je parnim t-testom. Netočnost glukometra je evaluirana korištenjem četiriju metoda: (a) usporedbom koncentracija dobivenih dvjema metodama, izražena kao odstupanje (engl. bias) (%); (b) regresija Passing-Bablock; (c) analiza Bland-Altman; (d) analiza Clarke Error Grid (5).
Nepreciznost u seriji ispitana je na 10 uzastopnih određivanja koncentracije glukoze u jednom uzorku kapilarne krvi bolesnika i dva originalna komercijalno dostupna kontrolna uzorka za uređaj Accu Chek (Roche, Mannheim, Germany). Deklarirane ciljne koncentracije kontrolnih uzoraka glukometra Accu Chek su 3,3-5,0 mmol/L za K1 i 8,8-11,9 mmol/L za K2.
Statistička analiza je rađena MedCalc® statističkim programom (MedCalc 9.3.3.0, Frank Schoonjans, Mariakerke, Belgium). Vrijednost P < 0,05 se smatrala statistički značajnom. Analiza Clarke Error Grid je načinjena u programu Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Santa Rosa, USA). Formule za izračun i izradu grafa nam je velikodušno proslijedio prof. Michael P. Kane, Pharm. D., (Department of Pharmacy Practice, Albany College of Pharmacy).
 
Rezultati
U istraživanje je bilo uključeno 48 bolesnika, čija je srednja dob izražena medijanom iznosila 64 godine (interkvartilni raspon 58-66). U skupini bolesnika je bilo 28 žena (58 %).
Netočnost
Odstupanje je određena računanjem srednje razlike (%) između rezultata mjerenih glukometrom Accu Chek i referentnom metodom u našem laboratoriju. Mjerenja se nisu značajno razlikovala (odstupanje –6,6%, P = 0,146) između glukometra Accu Chek (10,8 ± 3,5 mmol/L) i referentne metode (11,6 ± 3.8 mmol/L).
Regresija Passing-Bablock
Regresija Passing-Bablock korištena je za usporedbu uređaja za samokontrolu glukoze u krvi s referentnom metodom Olympus AU 2700. Regresijska jednadžba glasi: y = 0,1478 + 0,9130x i nema značajnog odstupanja od linearnosti.
Analiza Bland-Altman
Graf Bland-Altman prikazuje odnos razlike dvaju mjerenja u ovisnosti o srednjoj vrijednosti ta dva mjerenja (Slika 1). Vodoravne linije na grafu označavaju srednju vrijednost razlike i ± 1,96 SD razlike (6). U našem istraživanju srednja razlika između dvaju mjerenja koncentracije glukoze je bila 0,8 ± 0,5 mmol/L.
 
 
Slika 1. Regresija Bland Altman
 
Analiza Clarke Error Grid
U analizi Clarke Error Grid, na apscisu su nanesene koncentracije glukoze u krvi mjerene referentnom metodom, a na ordinatu koncentracija izmjerena ispitivanom metodom na glukometru. Graf je podijeljen u pet područja koje definiraju zone rezultata s različitom interpretacijom. Vrijednosti unutar zona A i B, predstavljaju područja ispravnih rezultata. Vrijednosti koje se nalaze unutar zone A ne razlikuju se za više od 20% od koncentracije izmjerene referentnom metodom. Vrijednosti unutar zone B veće su za više od 20% od vrijednosti izmjerene referentnom metodom. Iako zaključci koje možemo izvući iz rezultata unutar zone B, nisu posve prihvatljivi, oni neće dovesti do ozbiljnih posljedica za bolesnika. Vrijednosti unutar područja C, značajno se razlikuju od stvarnih vrijednosti. Rezultati koji se nalaze unutar zone D upozoravaju na klinički značajnu razliku, tj. grubu pogrešku. U tom će slučaju za bolesnika u hiperglikemičnom stanju, koncentracija glukoze izmjerena glukometrom biti unutar referentnog raspona. Zona E predstavlja područje pogrešne kliničke odluke, budući da su u tom slučaju koncentracije glukoze suprotne onima mjerenim referentnom metodom. Naime, za bolesnika u hipoglikemiji, izmjerena koncentracija glukoze na glukometru biti će iznad granica referentnog raspona (hiperglikemija). Odluke temeljene na podacima iz zone E su netočne i opasne (5). Svi rezultati analize Clarke error grid su bili 100% unutar zone A (Slika 2).
 
 
Slika 2. Analiza Clarke Error Grid
 
Nepreciznost
Nepreciznost u seriji ispitana je na 10 uzastopnih određivanja koncentracije glukoze u jednom uzorku kapilarne krvi bolesnika i dva originalna komercijalno dostupna kontrolna uzorka za uređaj Accu Chek (Roche, Mannheim, Germany). Izmjerena nepreciznost za uzorak bolesnika u kojemu je koncentracija glukoze bila 6,2 ± 0,1 mmol/L, iznosila je 1,83%. Za kontrolni uzorak K1 u kojem je izmjerena koncentracija glukoze 4,5 ± 0,1 mmol/L, nepreciznost u seriji iznosila je 2,72%, dok je za kontrolni uzorak K2 koncentracije 11,0 ± 0,2 mmol/L nepreciznost u seriji bila 1,43%. Izmjerene nepreciznosti bile su unutar naših zadanih kriterija prihvaćanja.
 
Rasprava
Međunarodne agencije su preporučile više različitih kriterija za analitičku evaluaciju mjerenja koncentracije glukoze glukometrom. Ti se kriteriji međusobno značajno razlikuju. Tako, primjerice, Nacionalni odbor za standarde u kliničkom laboratoriju (engl. National Comittee on Clinical Laboratory Standards, NCCLS) dopušta razliku u rezultatima dobivenih referentnom metodom i na glukometru do čak 20%. Za razliku od NCCLS, Američka udruga za šećernu bolest (engl. American Diabetes Association, ADA) dopušta odstupanje rezultata od referentne metode od samo 5%. Kriterij za netočnost < 10% odstupanja od referentne laboratorijske vrijednosti, koji je najčešće u primjeni, izdala je Međunarodna organizacija za standarde (engl. International Organization of Standardization, ISO). U našem istraživanju srednje odstupanje glukometra iznosilo je –6,6%. Ti su rezultati prihvatljivi prema kriteriju organizacije ISO, ali ne zadovoljavaju kriterije udruge ADA. 91,7% naših rezultata nalazi se u rasponu od ± 10% od vrijednosti dobivenih referentnom metodom, kao što to propisuje ISO. Prema literaturnim navodima netočnost uređaja za samokontrolu glukoze u krvi značajno se razlikuje: za točnost glukometra dobivene su vrijednosti 78.3% (7), 73% (8) i 55% (9) mjerenja koja se nalaze unutar 10% odstupanja od vrijednosti izmjerenih referentnom metodom. Glukometar zadovoljavajuće kvalitete je onaj kojemu je više od 60% mjerenja unutar 10% odstupanja od vrijednosti izmjerenih referentnom metodom (7). Korelacija između uređaja za samokontrolu glukoze i referentne metode se često interpretira kao mjerilo netočnosti. Razni su autori dobivali koeficijente korelacije u rasponu od 0,904 do 0,998 (10,11). Naš koeficijent korelacije je bio relativno nizak (R = 0,913, P < 0,05), najvjerojatnije zbog razlika između koncentracija glukoze u punoj krvi i plazmi.
Regresijska analiza Passing-Bablock i procjena greške izražene odstupanjem nisu najbolji statistički pokazatelji analitičke pogreške. Čak i kada korelacija ne pokaže značajnije odstupanje od linearnosti i kad je apsolutna greška unutar dozvoljenih granica, između dva mjerenja još uvijek može postojati odstupanje uz postojanje konstantne razlike u koncentracijama. Zbog toga se uz regresijsku analizu Passing-Bablock preporučuje koristiti i osjetljivije statističke analize, kao što su analiza Bland-Altman i analiza Clarke Error Grid (6,12). Na grafu Bland-Altman uspoređuje se razlika između mjerenja sa srednjom vrijednosti oba mjerenja. S obzirom da se više od 95% naših rezultata nalazi unutar ± 1,96 SD, nema statistički značajne razlike između metoda te se koncentracija glukoze može mjeriti i na glukometru kao zamjenskom analizatoru (6). Analiza naših podataka metodom Bland-Altman pokazala je da su razlike između glukometra i referentne metode veće u području viših koncentracija glukoze što su također opazili Cohen i suradnici u svom istraživanju (13). Opažene razlike mogu biti posljedica korištenja različitih vrsta uzoraka, a ne samo različitih analitičkih metoda mjerenja.
Netočnost smo procijenili i analizom Clarke Error Grid. Kao što je ranije spomenuto, tom metodom računaju se razlike između koncentracija glukoze mjerene referentnom metodom i glukometrom te ispravnost kliničke odluke koja se donosi na temelju koncentracije glukoze izmjerene glukometrom. U novije vrijeme, analiza Clarke Error Grid je prihvaćena kao zlatni standard za određivanje netočnosti glukometara. Svi naši rezultati bili su 100% unutar zone A te se, kao takvi, smatraju valjanima.
Odstupanje naših rezultata za sve je koncentracijske razine bilo niže od preporučenih kriterija. Nadalje, izmjerena nepreciznost na dvije razine zadovoljava i stroge kriterije prema Westgardu (< 2,2%) (14). Do sada u literaturi nije zabilježeno da glukometri zadovoljavaju kriterije prema Westgardu. Prema nekim autorima, izmjerena nepreciznost glukometara iznosi čak 6-15% (9, 13).
Temeljem naših opažanja možemo zaključiti da glukometar Accu Chek Compact Plus ima zadovoljavajuću netočnost i nepreciznost te se, kao takav, može koristiti za dnevnu kontrolu glukoze kao zamjenska metoda za naš laboratorijski referentni sustav.
 
Zahvala
Ovo istraživanje je financijski podržalo Ministarstvo znanosti, obrazovanja i sporta, Republika Hrvatska, projekt broj 134-1340227-0200. Autori zahvaljuju tvrtki Roche d.o.o., Hrvatska, na ustupanju glukometra Accu Chek Compact Plus, test trakica i kontrolnog materijala za potrebe ovog istraživanja.
 
Literatura
1.    American Diabetes Association. Self-monitoring of blood glucose. Diab Care 1996;19:S62-6.
2.    Kovatchev BP, Gonder-Frederick LA, Cox DJ, Clarke WL. Evaluating the accuracy of Continuous Glucose Monitoring Sensors. Diab Care 2004;27:1922-8.
3.    Olympus Operations Manual. Olympus, Tokyo, Japan.
4.    Accu Chek Operations Manual. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany.
5.    Clarke WL, Cox D, Gonder-Frederick LA, Carter W, Pohl SL. Evaluating clinical accuracy of systems for self-monitoring of blood glucose. Diab Care 1987;10:622-8.
6.    Bland JM, Altman DG. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet 1986;1:307-10.
7.    Dai KS, Tai DY, Ping H, Chen CC, Peng WC, Chen ST, et al. Accuracy of the EasyTouch blood glucose self-monitoring system: a study of 516 cases. Clin Chim Acta 2004;349:135-41.
8.    Ghys T, Goedhuys W, Spincemaille K, Gorusa F, Gerlo E. Plasma equivalent glucose at the point-of-care: evaluation of Roche Accu Chek Inform and Abbott Precision PCx glucose meters. Clin Chim Acta 2007;386:63-8.
9.    Hawkins CR. Evaluation of Roche Accu-Chek Go and Medisense Optium blood glucose meters. Clin Chim Acta 2005;353:127-31.
10. Lippi G, Salvagno GL, Guidi GC, Negri M, Rizzotti P. Evaluation of four portable self-monitoring blood-glucose meters. Ann Clin Biochem 2006;43:408-13.
11. JosephRJ, AllysonK, GravesTK, RondeauMJ, PetersonME. Evaluation of two reagent strips and three reflectance meters for rapid determination of blood glucose concentrations. J Vet Inter Med 1987;4:170-4.
12. Poirier JY, Le Prieur N, Campion L, Guilhem I, Allannic H, Maugendre D. Clinical and Statistical Evaluation of Self-Monitoring Blood Glucose meters. Diab Care 1998;21:1919-24.
13. Cohen M, Boyle E, Delaney C, Shaw J. A comparison of blood glucose meters in Australia; Diab Res Clin Prac 2006;71:113-8.
14. http://www.westgard.com/europe.htm. Accessed February 4th, 2008.

Prikaz slučaja

 
Slavica Dodig, Renata Zrinski Topić, Jadranka Živčić. Latentna tuberkulozna infekcija u osobe sa šećernom bolesti – prikaz bolesnika. Biochemia Medica 2008;18(3):368-73.
Odjel za kliničko-laboratorijsku dijagnostiku, Dječja bolnica Srebrnjak, Referentni centar Ministarstva zdravstva za kliničku alergologiju djece, Zagreb
*Adresa za dopisivanje: dodig [at] bolnica-srebrnjak [dot] hr
 
Sažetak
Uvod: Bolesnici sa šećernom bolesti tipa 1 često imaju narušenu staničnu imunost i podložni su zaraznim bolestima. Cilj je ovog rada prikazati slučaj latentne tuberkulozne infekcije (LTBI) u 46-godišnje zdravstvene djelatnice (medicinske sestre na odjelu za tuberkulozu male djece) koja 20 godina boluje od šećerne bolesti tipa 1.
Materijali i metode: Tuberkulinski kožni test učinjen je s 2 tuberkulinske jedinice (Tuberkulin RT-23, Statens Serum Institute, Kopenhagen, Danska). Krv za ispitivanje oslobađanja interferona gama, IFN-γ, (engl. Interferon Gamma Releasing Assay, IGRA) uzorkovana je u epruvete koje sadrže specifične antigene mikobakterija tuberkuloze (ESAT-6, CFP10 i TB7.7). Nakon inkubacije (22 sata) na 37oC u plazmi je određena koncentracija IFN-γ metodom ELISA (QuantiFERON-TB Gold In Tube – Cellestis Ltd., Victoria, Australia). Pozitivna kontrola bila je krv uzorkovana s mitogenom fitohemaglutininom, a negativna kontrola krv uzorkovana s heparinom.
Rezultati: Tuberkulinski kožni test bio je negativan (induracija 6 mm), a nalaz otpuštanja IFN-γ iz aktiviranih limfocita (≥ 0,35 kIU/L) pozitivan. Normalna stanična imunost potvrđena je pozitivnom kontrolom. Ispitanica nema znakova aktivne tuberkuloze.
Zaključak: U medicinske sestre koja boluje od šećerne bolesti tipa 1, a godinama radi s tuberkuloznim bolesnicima LTBI je dokazana testom oslobađanja IFN-γ, ali ne i tuberkulinskim kožnim testom. Unatoč dugogodišnje šećerne bolesti tipa 1, reakcija oslobađanja IFN-γ prema specifičnim tuberkuloznim antigenima je očuvana, a aktivna se tuberkuloza nije razvila.
Ključne riječi: Latentna tuberkulozna infekcija, šećerna bolest, šećerne bolest tipa 1, IFN-gama
Pristiglo: 2. srpnja 2008.                                                                                                      Prihvaćeno: 15. rujna 2008.
 
 
Uvod
Oko 2 milijarde ljudi ima latentnu infekciju mikobakterijem tuberkuloze (engl. latent tuberculosis infection, LTBI) (1). Učestalost LTBI kod zdravstvenih djelatnika (engl. health care workers, HCW) u srednje i slabo razvijenim zemljama kreće se između 33 i 79% (2), a u visoko razvijenim zemljama nije veća od 55% (3). Zbog profesionalne izloženosti tuberkuloznim bolesnicima, zdravstveni djelatnici imaju povećani rizik za tuberkuloznu infekciju.
Dijagnoza LTBI stotinjak se godina provodi metodom in vivo, tuberkulinskim kožnim testom (engl. tuberculin skin test, TST). TST se temelji na mjerenju reakcije odgođene preosjetljivosti nakon potkožne primjene slabo definirane smjese mikobakterijskih antigena (engl. purified protein derivative, PPD). Njime se određuje kumulativan učinak profesionalne i neprofesionalne izloženosti bacilu tuberkuloze, a na ishod reakcije utječu i čimbenici poput BCG-cijepljenja (Calmette-Guerin Bacillus) i prethodne izloženosti ne-tuberkuloznim mikobakterijama (4,5). Heterogenost sadržaja PPD-pripravaka, subjektivnost pri očitavanju reakcije te različite granične vrijednosti za određivanje pozitivnog TST smanjuju njegovu specifičnost. Kako se u testu ne koristi pozitivna kontrola, mogući su i lažno negativni rezultati kao posljedica imunosupresivnih stanja (6). U zemljama kao što je Hrvatska, gdje se BCG cijepljenje redovito provodi, TST može dati lažno pozitivne rezultate.
Novi pristup otkrivanju LTBI temelji se na ex vivo testovima iz pune krvi kojima se određuje IFN-γ oslobođen iz limfocita T nakon što su kroz dulje vrijeme bili u kontaktu s antigenima specifičnim za M. tuberculosis. Po tim se antigenima M. tuberculosis razlikuje od većine preostalih mikobakterija (7). Upravo ta činjenica pridonosi većoj specifičnosti ovoga testa u odnosu na TST. Upotrebom testa oslobađanja IFN-γ (IGRA) mogu se isključiti osobe koje su BCG-cijepljene, što kod TST-a nije slučaj.
Bolesnici sa šećernom bolesti tipa 1 često imaju narušenu staničnu imunost i podložni su zaraznim bolestima (8). Cilj je ovog rada prikazati slučaj LTBI u 46-godišnje zdravstvene djelatnice (medicinske sestre na odjelu za tuberkulozu male djece) koja boluje od šećerne bolesti tipa 1. Prema našem znanju, ovo je prvi prikaz primjene IGRA u otkrivanju LTBI u osobe koja je profesionalno izložena mikobakteriju tuberkuloze, a boluje od IDDM.
 
Prikaz bolesnika
Prikazana je 46-godišnja zdravstvena djelatnica (medicinska sestra) koja 26 godina radi na odjelu za tuberkulozu male djece. Zadnjih 20 godina boluje od šećerne bolesti tipa 1. Zbog bliskog kontakta s tuberkuloznim bolesnicima podvrgnuta je uobičajenom pregledu za probiranje tuberkulozne infekcije.
Bolesnica je cijepljena s BCG te ima ožiljak (engl. BCG scar). Trenutno nije akutno bolesna, afebrilna je, eupnoična, auskultacijski nad plućima ima normalan šum disanja. TST je bio negativan (promjer induracije 6 mm; očitanje nakon 72 sata; 2 tuberkulinske jedinice tuberkulina RT-23, Statens Serum Institute, Kopenhagen, Danska). Nalaz ex vivo određivanja IFN-γ bio je pozitivan (≥ 0,35 kIU/L), a pozitivna mitogenska kontrola uredna (≥ 0,50 kIU/L). Ispitanica je imala povećanu koncentraciju glukoze, IgA, hsCRP, te povećane vrijednosti sedimentacije eritrocita (Tablica 1).
 
 Tablica 1. Rezultati laboratorijskih pretraga
 
 
Načelo određivanja interferona gama nakon aktivacije tuberkuloznim antigenima
Uzorkovanje venske krvi provodi se prije izvođenja TST. Postupak određivanja odvija se u dvije faze:
aktivacija limfocita iz pune krvi ispitanika sa specifičnim antigenima mikobakterija tuberkuloze (epruveta sadrži tri antigena – ESAT-6, CFP10 i TB7.7). Istodobno se uzorkuju krvi za pozitivnu kontrolu (epruveta s fitohemaglutininom) i negativnu kontrolu (epruveta s heparinom). Sva tri uzorka inkubiraju se preko noći (22 sata) na 37 °C, nakon čega se odvaja plazma te pohranjuje na +4°C do analize (najdulje 7 dana).
određivanje koncentracije IFN-γ metodom ELISA s pomoću komercijalnog testa QuantiFERON-TB Gold In Tube (Cellestis Ltd., Victoria, Australija). Nalaz se izražava kao pozitivan ako je koncentracija IFN-γ veća od granične vrijednosti ≥ 0,35 kIU/L.
 
Rasprava
Samo je test oslobađanja IFN-γ (IGRA) ukazao na postojanje LTBI kod medicinske sestre koja je godinama u kontaktu s tuberkuloznim bolesnicima, a nalaz TST bio je lažno negativan. Unatoč dugogodišnjoj šećernoj bolesti, aktivna se tuberkuloza nije razvila. Od ostalih nalaza treba ukazati na povećanu koncentraciju glukoze kao pokazatelja loše kontrolirane bolesti, te na povećane upalne biljege. Povećana koncentracija IgA može se naći u serumu oko 23% bolesnika sa šećernom bolesti, osobito ako se bolesti liječi dulje od 10 godina (9), što je slučaj kod naše ispitanice, odnosno ako se razvije dijabetička nefropatija (10). Povećana koncentracija hsCRP ukazuje na latentnu upalu koja je svojstvena bolesnicima sa šećernom bolesti (11), odnosno ukazuje na rizik pojave kardiovaskularne bolesti (12).
Ovaj prikaz slučaja otvara dvije teme za raspravu: vrijednost in vivo i ex vitro testova za otkrivanje tuberkulozne infekcije u osoba profesionalno izloženih uzročniku, te odnos između tuberkulozne infekcije i šećerne bolesti.
Britanske preporuke za dijagnozu i liječenje tuberkuloze predlažu početno pretraživanje pomoću TST te potvrđivanje pozitivnih rezultata nekim od IGRA testova (13). Prema američkim preporukama novija inačica IGRA (QuantiFERON-TB Gold) može u potpunosti zamijeniti TST te nije potrebno oba testa izvoditi istodobno (14). Međutim, treba imati u vidu dijagnostičku vrijednost tih testova. Dijagnostička vrijednost TST ovisi o određivanju granične vrijednosti koja razlikuje pozitivne od negativnih rezultata (15), o prethodnoj izloženosti ne-tuberkuloznim mikobakterijama (4), a za oba testa važna je procijepljenost populacije (16-18). BCG-cijepljenje utječe na rezultate TST, osobito u osoba < 40 godina u zemljama s malom incidencijom tuberkuloze (19). BCG-irane osobe koje imaju TST > 11 mm mogu se smatrati inficiranima (20). Pozitivan rezultat TST nakon zaraze bakterijom M.tuberculosis često ostaje trajno pozitivan („jednom pozitivan, nikad više koristan“) (21,22). Određivanje koncentracije IFN-γ bolji je indikator u cijepljenih osoba (18) i u osoba koje su u dugotrajnijem kontaktu s M. tuberculosis (23) nego TST jer ukazuju na akutnu izloženost specifičnim tuberkuloznim antigenima. Rezultat IGRA kod osoba s LTBI pokazao je senzitivnost od 90% i specifičnost 98% (24). Specifičnost IGRA je povećana stavljanjem više mikrobakterijskih antigena u epruvetu. Rezultate testova jednostavno je tumačiti kad su njihovi rezultati sukladni. U većini istraživanja podudarnost između rezultata TST i IGRA može varirati između 60–90% (25). U slučajevima gdje je rezultat TST pozitivan, a IGRA negativan, to bi se razilaženje moglo pripisati prethodnom cijepljenju BCG (25). Obrnuta nepodudarnost (TST negativan; IGRA pozitivan) također je zabilježena među zdravstvenim djelatnicima (26). Podudarnost rezultata IFN testova nove generacije (Quantiferon-TB Gold, korišten u ovom istraživanju) s TST je 79–94% (27). Međutim, u osoba koje imaju smanjenu staničnu imunost (bolesnici s malignim bolestima, šećernom bolesti, kroničnim bubrežnim oštećenjem, HIV, imunosupresivnom terapijom) rezultati tih testova ne moraju biti sukladni (28). Kobashi i sur. su pokazali da imunokompromitirani bolesnici imaju negativan kožni test, a pozitivan nalaz IGRA (23), što je slučaj i kod naše ispitanice. Dakle, u osoba s narušenom imunošću testovi in vivo i ex vivo nemaju jednaku dijagnostičku vrijednost kao u zdravih osoba. Tome u prilog ide i ovaj prikaz slučaja koji je pokazao lažno negativan rezultat kožnog testa, a pozitivan nalaz IGRA. Taj je nalaz potvrdio da je unatoč dugogodišnjoj šećernoj bolesti reakcija oslobađanja IFN-γ prema specifičnim tuberkuloznim antigenima još uvijek očuvana. Istodobno, ispitivanjem stanične imunosti određivanjem IFN-γ nakon aktivacije limfocita fitohemaglutininom izbjegnut je mogući lažno negativan rezultat. Veza između tuberkuloze i šećerne bolesti poznata je već 2000 godina (29). Već je u V. stoljeću tuberkuloza opisana kao komplikacija šećerne bolesti. Bolesnici sa šećernom bolesti podložni su infekcijama (8), pa tako i infekciji s mikobakterijem tuberkuloze. Iako nema dovoljno spoznaja o tome kako šećerna bolest oštećuje obrambeni sustav, čini se da se smanjena obrambena sposobnost može pripisati hiperglikemiji (30). Na tu je uzročno-posljedičnu svezu ukazalo i ispitivanje na dijabetičnim miševima zaraženima s M. tuberculosis (31) i ispitivanje uloge IFN-γ u osoba sa šećernom bolesti (32). Dijabetični miševi imali su upalne promjene u plućima te istodobno smanjeno stvaranje IFN-γ (31), a osobe sa šećernom bolesti bile su podložne obolijevanju od tuberkuloze upravo zbog pomanjkanja IFN-γ koji je potreban za inhibiciju početnog rasta M. tuberculosis (32). Iz toga slijedi da bi, u svrhu otkrivanja smanjenog stvaranja IFN-γ i posljedične podložnosti razvoju aktivne tuberkuloze, ex vivo određivanje IFN-γ bilo potrebno uključiti u redovitu godišnju obradu naše ispitanice.
 
Literatura
1.    World Health Organization: GlobalTuberculosis Control: Surveilleance, Planning, Financing. WHO report 2005. Geneva, Switzerland, 2005.
2.    Joshi R, Reingold AL, Menzies D, Pai M. Tuberculosis among health-care workers in low- and middle-income countries: a systematic review. PLOS Medicine 2006;3:2376-91.
3.    Seidler A, Nienhaus A, Diel R. Review of epidemiological studies on the occupational risk of tuberculosis in low-incidence areas. Respiration 2005;2:431-6.
4.    Snider DE. Bacille Calmette-Guerin vaccinations and tuberculin skin test. J Am Med Assoc 1985;253:3438-9.
5.    Daley AJ, Isaacs D. Differential avian and human tuberculin skin testing in non-tuberculous mycobacterial infection. Arch Dis Child 1999;80:377-9.
6.    Huebner RE, Schein MF, Bass JBJ. The tuberculin skin test. Clin Infect Dis 1993;17:968-75.
7.    Mori T, Sakatani M, Yamagishi F, Takashima T, Kawabe Y, Nagao K, et al. Specific detection of tuberculosis infection. An interferon-γ-based assay using new antigens. Am J Respir Crit Care Med 2004;170:59-64.
8.    Joshi N, Caputo GM. Weitekamp MR, Karchmer AW. Infections in patients with diabetes mellitus. N Engl J Med 1999;341:1906-12.
9.    Rodriguez-Segade S, Camina MF, Carnero A, Lorenzo MJ, Alban A, Quinteiro C, et al. High serum IgA concentrations in patients with diabetes mellitus: agewise distribution and relation to chronic complications. Clin Chem 1996;42:1064-7.
10. Kanauchi M. Serum IgA levels in patients with diabetic nephropathy and IgA nephropathy superimposed on diabetes mellitus. Diabetes Research and Clinical Practice 2000;48:113-8.
11. King DE, Mainous AG, Buchanan TA, Pearson WS: C-reactive protein and glycemic control in adults with diabetes. Diabetes Care 2003;26:1535–9.
12. Pradhan AD, Manson JE, Rifai N, Buring JE, Ridker PM. C-reactive protein, interleukin 6, and risk of developing type 2 diabetes mellitus. JAMA 2001;286:327-34.
13. NICE - National Institute for Health and Clinical Excellence. Clinical Guideline 33, Tuberculosis: clinical diagnosis and management of tuberculosis and measurement for its prevention and control. NICE, London, UK, 2006. Available at http://www.nice.org.uk.
14. Mazurek GH, Hereb J, Lobue P, Iademarco MF, Metchock B, Vernon A. Guideline for using the QuantiFERON-TB Gold test for detecting Mycobacterium tuberculosis infection, United States. MMWR Recomm Rep 2005;54(RR-15):49-55.
15. Ozdemir D, Annakkaya AN, Tarhan G, Sencan I, Cesur S, Balbay O, et al. Comparison of the tuberculin skin test and the Quantiferon test for latent Mycobacterium tuberculosis infections in health care workrs in Turkey. Jpn J Infect Dis 2007;60:102-5.
16. Nienhaus A, Schablon A, Le Bâcle C, Siano B, Diel R. Evaluation of the interferon-γ release assay in healthcare workers. Int Arch Occup Environ Health 2008;81:295-300.
17. Harada N, Nakajima Y, Higuchi K, Sekiya Y, Rothel J, Mori T. Screening for tuberculosis infection using whole-blood interferon- γ and Mantoux testing among Japanese healthcare workers. Infect Control Hosp Epidemiol 2006;27:442-8.
18. Kang YA, Lee HW, Yoon HI, Cho BL, Han SK, Shim YS, et al. Discrepancy between the tuberculin skin test and the whole-blood interferon-γ assay for the diagnosis of latent tuberculosis infection in an intermediate tuberculosis-burden country. JAMA 2005;293:2756-61.
19. Tissot F, Zanetti G, Francioli P, Zellweger JP, Zysset F. Influence of bacille Calmette-Guérin vaccination on size of tuberculin skin test reaction: to what size? Clin Infect Dis 2005;40:211-7.
20. Bugiani M, Borraccino A, Migliore E, Carosso A, Piccioni P, Cavallero M, et al. Tuberculin reactivity in adult BCG-vaccinated subjects: a cross-sectional study. Int J Tuberc Lung Dis 2003;7:320-6.
21. Arend SM, Thijsen SFT, Leyten EMS, Bouwman JJM, Franken WPJ, Koster BFPJ, et al. Comparison of two interferon-γ assays and tuberculin skin test for tracing tuberculosis contacts. Am J Resp Crit Care Med 2007;175:618-27.
22. Menzies D. Interpretation of repeated tuberculin tests: boosting, conversion, and reversion. Am J Respir Crit Care Med 1999;159:15–21.
23. Kobashi Y, Obase Y, Fukuda M, Yoshida K, Miyashita N, Fujii M, et al. Usefulness of QuantiFERON TB-2G, a diagnostic method for latent tuberculosis infection, in a contact investigation of health care workers. Intern Med 2007;46;1543-9.
24. Streeton JA, Desem N, Jones SL. Sensitivity and specificity of gamma interferon blood test for tuberculosis infection. Int J Tuberc Lung Dis 1998;2:435-50.
25. Pai M, Kalantri S, Dheda K. New tools and emerging technologies for the diagnosis of tuberculosis: Part I. Latent tuberculosis. Expert Rev Mol Diagn 2006;6:413-22.
26. Pai M, Gokhale K, Joshi R, Dogra S, Kalantri S, Mendiratta DK. Mycobacterium tuberculosis Infection in health care workers in rural India. Comparison of a whole-blood - γ assay with tuberculin skin testing. JAMA 2005;293:2746-55.
27. Madariaga MG, Jalali Z, Swindells S. Clinical utility of interfereon gamma assay in the diagnosis of tuberculosis. J Am Board Fam Med 2007;20:540-7.
28. Kobashi Y, Mouri K, Obase Y, Fukuda M, Miyashita N, Oka M. Clinical evaluation of QuantiFERON TB-2G test for immunocompromised patients. Eur Respir J 2007;30:945-50.
29. Broxmeyer L. Diabetes mellitus, tuberculosis and the mycobacteria: Two millenia of enigma. Med Hypotheses 2005;65:433-9.
30. Gupta S, Koirala J, Khardori R, Khardori N. Infections in diabetes mellitus and hyperglycemia. Inf Dis Clin North Am 2007;21:617-38.
31. Martens FW, Arikan MC, Lee J, Ren F, Greiner D, Kornfeld H. Tuberculosis susceptibiliy of diabetic mice. Am J Respir Cell Mol Biol 2007;37:518-24.
32. Stalenhoef JE, Alisjahbana B, Nelwan EJ, van der Ven-Jongerkrijg J, Ottenhoff TH, van der Meer JW, et al. The role of interferon-gamma in the increased tuberculosis risk in type 2 diabetes mellitus. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2008;27:97-103.

Izvorni znanstveni članak

 

Jasminka Matica, Višnja Rački-Čargonja, Štefica Dvornik. Učinak trajanja šećerne bolesti tipa 1 na aktivnost N-acetil-β-D glukozaminidaze u mokraći djece i adolescenata. Biochemia Medica 2006;16(1):50-6.
KBC Rijeka, Zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Rijeka
Corresponding author: jasminka [dot] matica [at] ri [dot] t-com [dot] hr
 
Sažetak
 
Cilj: Cilj je bio ispitati ovisi li izlučivanje NAG u mokraći djece i adolescenata s šećernom bolesti tipa 1 o trajanju bolesti.
Metode: Katalitičke koncentracije N-acetil-b-D-glukozaminadaze određivale su se spektrofotometrijski u slučajnim uzorcima mokraće 66 djece i adolescenata s šećernom bolesti tipa 1 68 ispitanika iz kontrolne skupine. Bolesnici iz skupine dijabetičara bili su podijeljeni s obzirom na trajanje bolesti: skupina I manje od tri godine (N=17); skupina II tri do pet godina (N=19); skupina III pet do deset godina (N=19); skupina IV više od deset godina (N=11). Vrijednosti NAG izražene su u odnosu na koncentraciju kreatinina u mokraći radi isključivanja razlika u koncentraciji mokraće.
Rezultati: Izlučivanje NAG mokraćom kod dijabetičara bilo je statistički značajno povišeno u odnosu na kontrolnu skupinu. (p<0,001). U sve je četiri skupine dijabetičara statistički značajno bilo povećano izlučivanje NAG mokraćom u odnosu na kontrolnu skupinu (skupina I, p=0,001; skupine II i III, p<0,001 i skupina IV, p=0,004) no nije nađena statistički značajna razlika među skupinama dijabetičara (skupina I vs. II, p=0,716; skupina I vs. III, p=0,899; skupina I vs. IV, p>0,10; skupina II vs. III, p=0,549; skupina II vs. IV, p>0,10; skupina III vs. IV, p>0,10). Nije nađena korelacija između vrijednosti NAG u mokraći dijabetičara i trajanja bolesti (r=–0,017, p=0,892)
Zaključak: Izlučivanje NAG mokraćom povećano je kod djece i adolescenata s šećernom bolesti tipa 1, ali ne ovisi o trajanju bolesti.
Ključne riječi: N-acetil-b-D-glukozaminidaza, šećerna bolest tipa 1, dijabetička nefropatija
 
Pristiglo: 3. kolovoza 2005.                                                                                                         Prihvaćeno: 16. ožujka 2006.
 
Uvod
 
Bubrežno oštećenje je ozbiljna komplikacija u šećernoj bolesti. Ako je dijabetička nefropatija dijagnosticirana na temelju mikroalbuminurije, proteinurije ili sniženoga klirensa kreatinina, vrlo je malo moguće postići da bi se spriječilo zatajenje bubrega (1). Stoga postoji potreba za ranijim pokazateljima strukturnih i funkcionalnih promjena u bubregu koje bi bilo moguće spriječiti strogom glikemijskom kontrolom.
U nekoliko je studija ukazano da rana tubularna promjena nastala zbog peritubularne mikroangiopatije može prethoditi glomerularnim promjenama te imati važnu ulogu u pojavi dijabetičke nefropatije (2). Pojačano urinarno izlučivanje enzima koji potječu iz proksimalnih bubrežnih tubula utvrđeno je u bolesnika sa šećernom bolesti tipa 1 kao posljedica tubularne ozljede; ti enzimi su N-acetil-b-D-glukozaminidaza (NAG), alanin-aminopeptidaza, alkalna fosfataza, urinarna dipeptidil-aminopeptidaza IV (3). Aktivnost nekolicine od tih tubularnih biljega povišena je u mokraći i prije pojave mikroalbuminurije.
NAG (EC 3.2.1.30) je lizosomski enzim velike molekulske mase, široko rasprostranjen u mnogim tkivima i tjelesnim tekućinama. Mokraćna NAG je bubrežnoga podrijetla (5) jer ne može proći kroz glomerularnu membranu zbog svoje velike molekularne težine (130 000 do 140 000 D). Otpušta se iz stanica kao posljedica fiziološke egzocitoze (6) ili raspada stanica (7). NAG je raspodijeljen uzduž čitavog nefrona no uglavnom se nalazi u proksimalnim bubrežnim tubulima i možemo ju smatrati ranim neinvazivnim biljegom tubularnog oštećenja bubrega. Aktivnosti NAG u mokraći su povišene u pijelonefritisu (8), refluksnoj nefropatiji (9), hipertenziji (5) i reumatskom artritisu, kod izloženosti nefrotoksičnim lijekovima, zagađivačima okoline poput žive (10), kadmija (11), te kod radnika koji su tijekom rada izloženi trikloroetilenu (12). NAG može biti koristan parametar u bolesnika s tubulointersticijskim nefropatijama za razlikovanje akutnih od kroničnih poremećaja. Aktivnost NAG veća od 20 U/L (15 U/g kreatinina) može se mjeriti kod akutnoga oštećenja tubularnog sustava (13).
NAG u mokraći je rani pretkazatelj razvoja dijabetičke nefropatije; u šećernoj bolesti tipa 1 povišen je prije pojave mikroalbuminurije (14).
Schultz i sur. (15) su dokazali da su povišene aktivnosti NAG u mokraći ispitanika mlađih od 16 godina povezane s trajanjem šećerne bolesti tipa 1 i glikiranoga hemoglobina (HbA1c). Mocan i sur. (16) su ispitali 54 odrasle osobe sa šećernom bolesti tipa 2 i zapazili da aktivnost NAG počinje rasti tijekom treće godine bolesti, dostiže najvišu razinu između 3.–10. godine, te ubrzano raste nakon 10. godine.
Kavukçu (17) je dokazao da je aktivnost NAG u mokraći povezana s koncentracijom glukoze u krvi, a Kordonouri i sur. (18) su ustanovili da su oni ispitanici kod kojih je šećerna bolest nastupila u djetinjstvu imali značajno više aktivnosti NAG u mokraći u usporedbi s bolesnicima kod kojih je bolest nastupila nakon 16. godine života, te su češća oštećenja tubularne funkcije u mlađoj dobi pripisali neodgovarajućoj glikemijskoj kontroli u toj populaciji.
Cilj je ovog istraživanja bio ispitati postoji li razlika u aktivnosti NAG u mokraći između djece i adolescenata sa šećernom bolesti tipa 1 i zdravih ispitanika. Nadalje, željeli smo ispitati mijenja li se aktivnost NAG u mokraći u ovisnosti o trajanja bolesti.
 
Materijali i metode
Ispitanici
Istraživanje je uključivalo 66-ero djece i adolescenata sa šećernom bolesti tipa 10 praćenih tijekom tri godine u Dječjoj bolnici Kantrida, Rijeka. Ukupno je bilo 37 muških i 29 ženskih ispitanika s medijanom dobi 14,5 (3,5–25) godina. Kontrolnu je skupinu činilo 68 ispitanika (29 muških i 39 ženskih) bez bubrežne bolesti i šećerne bolesti, s medijanom dobi 11,0 (0,5–27). Bolesnici sa šećernom bolesti podijeljeni su u četiri skupine ovisno o trajanju bolesti (Tablica 1.).
 
Tablica 1. Značajke skupina bolesnika sa šećernom bolesti
 
Tablica 2. Aktivnosti NAG u mokraći bolesnika i kontrolne skupine
Uzorci
Nasumični uzorci mokraće bez aditiva prikupljeni su od svakog ispitanika i centrifugirani 10 minuta na 800 o/min. Supernatanti su čuvani na –20 oC do određivanja aktivnosti NAG koja se provodila jednom tjedno. Aktivnost NAG je postojana tijekom 7 dana na 4 oC i –20 oC (19).
Svježi uzorci mokraće korišteni su za određivanje koncentracije kreatinina i albumina u mokraći.
Puna krv je prikupljana s EDTA kao antikoagulansom radi određivanja HbA1c.
Metode
Aktivnost NAG u mokraći određena je spektrofotometrijski komercijalnim testom (Boehringer Mannheim, Njemačka) s 3-krezolsulfonftaleinil-N-acetil-b-glukozaminidom kao supstratom (20). Koncentracija kreatinina u mokraći mjerena je izmijenjenom Jaffeovom reakcijom (21). Kako bi se smanjio učinak diureze na izmjerenu aktivnost NAG u mokraći, rezultat smo izrazili kao omjer enzimske aktivnosti i koncentracije kreatinina u mokraći (kU/mol kreatinina).
Koncentracija HbA1c određena je ionskom izmjenjivačkom kromatografijom (Bio Systems, Španjolska).
Koncentracija albumina u mokraći mjerena je radijalnom imunodifuzijom (Behring, Njemačka).
Statistička analiza
Za ispitivanje normalnosti raspodjele rabili smo Kolmogorov-Smirnovljev statistički test. Za ispitivanje razlika u aktivnosti NAG u mokraći između skupine bolesnika i kontrolne skupine rabili smo Mann-Whitney statistički test. Za usporedbu četiri dijabetičke skupine i kontrolne skupine rabljen je Kruskal-Wallisov test (P<0,05) te zatim Mann-Whitneyev test (P<0,005).
Izračunat je Spearmanov koeficijent korelacije aktivnosti NAG u mokraći u bolesnika i trajanja bolesti.
Pomoću Kruskal-Wallisovog testa uspoređene su razlike u koncentraciji albumina u mokraći i koncentracije HbA1c između četiri dijabetičke skupine (P<0,05).
Vrijednosti određivanih parametara prikazani su kao medijan (minimum-maksimum).
 
Rezultati i rasprava
 
Aktivnosti NAG u mokraći u četiri skupine dijabetičkih bolesnika te u kontrolnoj skupini navedene su u tablici 2. Statistički značajno su više vrijednosti utvrđene za sve četiri dijabetičke skupine u odnosu na kontrolnu skupinu (skupina I, P=0,001; skupine II i III, P<0,001; skupina IV, P=0,004 u usporedbi s kontrolnim ispitanicima). Najniži medijan aktivnosti NAG zabilježen je u skupini IV (0,52; 0,18–4,55 kU/mol kreatinina) u kojoj su bili bolesnici s najduljim trajanjem bolesti, a najviši medijan za NAG je utvrđen u skupini II (0,76; 0,38–1,57 kU/mol kreatinina). Međusobne razlike u izlučivanju NAG između pojedine skupine ispitanika nisu bile statistički značajne. Shema Box-Whisker prikazuje medijan, kvartile, minimum, maksimum te vrijednosti koje odskaču u svakoj skupini. Raspodjela aktivnosti NAG u mokraći u četiri podskupine bolesnika i kontrolnoj skupini prikazana je na slici 1.
 
Slika 1. Grafički prikaz aktivnosti NAG u mokraći kontrolnih ispitanika i podskupina bolesnik
 
Aktivnost NAG u mokraći u sve četiri skupine bila je statistički značajno viša u usporedbi s kontrolnim ispitanicima bez obzira na trajanje šećerne bolesti. S druge strane, međutim, nije nađena korelacija između četiri dijabetičke skupine i trajanja bolesti (r=–0,017, P=0,892).
Hsiao i sur. (22) su ispitali 31 dijete sa šećernom bolesti tipa 1 te utvrdili značajno višu aktivnost NAG u mokraći u četiri dijabetičke skupine (skupine su podijeljene na isti način kao i u našem istraživanju, tj. prema trajanju bolesti) u usporedbi s kontrolnom skupinom, no bez statistički značajne razlike između bilo koje od tih četiri skupina. Lorini i sur. (23) i Mungan i sur. (24) također nisu otkrili korelaciju između aktivnosti NAG u mokraći i trajanja šećerne bolesti tipa 1 u mladih dijabetičkih bolesnika.
NAG u mokraći je povezana s koncentracijom glukoze u krvi (17) te može odražavati metaboličku kontrolu bolesnika sa šećernom bolesti, aktivnost bolesti, te težinu bubrežnog oštećenja.
Naši su bolesnici u sve četiri dijabetičke skupine imali slične koncentracije HbA1c, što je upućivalo na slične razine glikemije. Statistički značajne razlike nije bilo između bilo koje dvije od četiri dijabetičkih skupina u glikiranom hemoglobinu (P=0,574), što je prikazano u tablici 3. Statistički značajno više aktivnosti NAG u mokraći u djece i adolescenata sa šećernom bolesti tipa 1 u usporedbi s kontrolnim ispitanicima ukazuju da su ti dijabetički bolesnici imali tubularno oštećenje koje bi moglo biti posljedica slabe kontrole glikemije (medijan koncentracija glikiranog hemoglobina bio je 8,9% ili viši u sve četiri skupine).
 
Tablica 3. Koncentracije albumina u mokraći dijabetičara
 
Nije utvrđena statistički značajna razlika u koncentraciji albumina u mokraći između pojedinih podskupina bolesnika. Tablica 4. sadrži koncentracije albumina u mokraći za četiri podskupine dijabetičkih bolesnika.
 
Tablica 4. Koncentracija glikiranog hemoglobina u podskupinama bolesnika
 
Postoji mogućnost da razlike između skupina u izlučivanju NAG u mokraći nije bilo zbog slične razine glikemije te, posljedično, sličnoga stupnja bubrežnoga oštećenja. NAG u mokraći odražava metaboličku kontrolu bolesnika sa šećernom bolesti, aktivnost bolesti, te težinu tubularnog oštećenja, a ne samo trajanje bolesti.
Kako postoje mnogi drugi čimbenici koji dodatno mogu utjecati na izlučivanje NAG u mokraći, nije moguće donositi konačne zaključke o uzročno-posljedičnoj vezi povećane aktivnosti NAG i tubularnog oštećenja u šećernoj bolesti. Te će odgovore dati neka buduća ispitivanja na većem broju ispitanika.
 
Zahvale
 
Zahvaljujemo dr.sc. Katarini Cvijović za podatke o bolesnicima sa šećernom bolesti te mr.sc. Lidiji Bilić-Zulle za vrlo korisne savjete u vezi sa statističkom obradbom.
 
Literatura
 
1.   Turecky L, Uhlikova E. Diagnostic significance of urinary enzymes in nephrology. Bratisl Lek Listy 2003;104:27-31.
2.   Nuyts GD, Yaquoob M, Nouwen EJ, et al. Human urinary intestinal alkaline phosphatase as an indicator of S3-segment-specific alterations in incipient diabetic nephropathy. Nephrol Dial Transplant 1994;9:377-81.
3.   Ishii N, Ogawa Z, Itoh H, Ikenaga H, Saruta T. Diagnostic significance of urinary enzymes for diabetes mellitus and hypertension. Enzyme Protein 1994-95;48:174-82.
4.   Hong CY, Chia KS. Markers of diabetic nephropathy. J Diabet Compl 1988;12:43-60.
5.   Hashimoto R, Adachi H, Nishida H, Tsuruta M, Nomura G. Serum N-acetyl-b-D-glucosaminidase activity in predicting the development of hypertension. Hypertension 1995;35:1311-4.
6.   Price RG. Measurement of N-acetyl-b-glucosaminidase and its isoenzymes in urine methods and clinical applications. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1992;30:693-705.
7.   Welman E, Selwyn AP, Peters TJ, Colbeck JF, Fox KM. Plasma lysosomal enzyme activity in acute myocardial infarction. Cardiovasc Res 1978;12:99-105.
8.   Belli A, Scalercio F, Martino F, et al. Evaluation of N-acetyl-beta glucosaminidase in upper and lower urinary tract infections in childhood. Clinical study of 168 children. Minerva Pediatr 1996;48:503-7.
9.   Konda R, Sakai K, Ota S, Takeda A, Orikasa S. Followup study of renal function in children with reflux nephropathy after resolution of vesicoureteral reflux. J Urol 1997;157:975-9.
10. Cárdenas A Roels H, Bernard AM, et al. Markers of early renal changes induced by industrial pollutants. I Application to workers exposed to mercury vapour. Br J Ind Med 1993;50:17-27.
11. Roels H, Bernard AM, Cárdenas A, et al. Markers of early renal changes induced by industrial pollutants. III Application to workers exposed to cadmium. Br J Ind Med 1993;50:37-48.
12. Green T, Dow J, Ong CN, et al. Biological monitoring of kidney function among workers occupationally exposed to trichloroethylene. Occup Environ Med 2004;61:312-7.
13. Ivandić M, Hofmann W, Guder WG. Development and evaluation of urine protein expert system. Clin Chem 1996;42:1214-22.
14. Jones AP; Lock S; Griffiths KD. Urinary N-acetyl-beta-glucosaminidase activity in type I diabetes mellitus. Ann Clin Biochem 1995;32:58-62.
15. Schultz CJ, Dalton RN, Neil HAW, Konopelska-Bahu T, Dunger DB. Markers of renal tubular disfuntion measured annually do not predict risk of microalbuminuria in the first few years after diagnosis of Type I diabetes. Diabetologia 2001;44:224-9.
16. Mocan Z; Erem C; Yildirim M; Telatar M; Deger O. Urinary beta 2-microglobulin levels and urinary N-acetyl-beta-D-glucosaminidase enzyme activities in early diagnosis of non-insulin-dependent diabetes mellitus nephropathy. Diabetes Res 1994;26:101-7.
17. Kavukçu S, Soylu A, Türkmen M. The clinical value of urinary N-acetyl-b-D-glucosaminidase levels in childhood age group. Acta Med Okayama 2002;56:7-11.
18. Kordonouri O, Kahl A, Jorres A, et al. The prevalence of incipient tubular dysfunction, but not of glomerular dysfunction, is increased in patients with diabetes onset in childhood. J Diabet Compl 1999;13:320-4.
19. Hofmann W, Guder G. A diagnostic programme for the quantitative analysis of proteinuria. J Clin Chem Clin Biochem 1989;27:589-600.
20. Noto A, Yasunao O, Mori S, et al. Simple, rapid spectrophotometry of urinary N-acetyl-b-D-glucosaminidase, with use of a new chromogenic substrate. Clin Chem 1983;29:1713-6.
21. Cook JGH. Creatinine assay in the presence of protein. Clin Chim Acta 1971;32:485-6.
22. Hsiao PH, Tsai WS, Tsai WY, et al. Urinary N-acetyl-b-D-glucosaminidase activity in children with insulin-dependent diabetes mellitus. Am J Nephrol 1996;16:300-303.
23. Lorini R, Scaramuzza A, Cortona L, et al. Increased urinary N-acetyl-beta-glucosaminidase (NAG) excretion in young insulin-dependent diabetic patients. Diabetes Res Clin Pract 1995;29:99-105.
24. Mungan N, Yuksel B, Bakman M, Topaloglu AK, Ozer G. Urinary N-acetyl-beta-D-glucosaminidase activity in type I diabetes mellitus. Indian Pediatrics 2003;40:410-4.

Izvorni znanstveni članak

 

Roberta Petlevski1, Dubravka Juretić1, Mirko Hadžija2, Milivoj Slijepčević2, Jana Lukač-Bajalo3. Koncentracija malondialdehida u NOD miševa tretiranih akarbozom. Biochemia Medica 2006;16(1):43-9.
1Farmaceutsko-biokemijski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zavod za medicinsku biokemiju i hematologiju, Zagreb
2Zavod za molekularnu medicinu, InstitutRuđer Bošković”, Zagreb
3Zavod za kliničku biokemiju, Farmaceutski fakultet, Sveučilište u Ljubljani, Ljubljana, Slovenija
Corresponding author: rpetlevski [at] pharma [dot] hr
 
Sažetak
 
Cilj: Malondialdehid (MDA) je jedan od toksičnih produkata lipidne peroksidacije, a koristi se u evaluaciji oksidativnog stresa tijekom šećerne bolesti. Cilj ovog rada bio je ispitati učinak akarboze (inhibitora a-glukozidaza) na koncentraciju glukoze u serumu i MDA u homogenatu jetre NOD (engl. non-obese diabetic) miševa.
Materijali i metode: U NOD miševa šećerna bolest inducirana je i.v. aplikacijom aloksan-monohidrata (75 mg/kg t. mase). NOD miševi podijeljeni su u 4 skupine (n=6): Kontrolni, zdravi NOD miševi (K), Kontrolni, zdravi NOD miševi tretirani 7 dana akarbozom (K/A), dijabetični NOD miševi (D) te dijabetični NOD miševi tretirani 7 dana akarbozom (D/A).
Koncentracija glukoze u krvi izmjerena je glukoza oksidaza-peroksidaza metodom, a koncentracija MDA u homogenatu jetre određena je upotrebom metode s tiobarbiturnom kiselinom.
Rezultati: Nakon sedmodnevnog tretmana akarbozom zabilježeno je statistički značajno smanjenje koncentracije glukoze u krvi u skupini D/A u odnosu na skupinu D (p<0.05), a isto tako je uočen i statistički značajan pad koncentracije MDA (p<0.05).
Zaključak: Ovi rezultati potvrđuju pozitivan antioksidacijski učinak akarboze što se može objasniti njezinim antihiperglikemijskim djelovanjem.
Ključne riječi: oksidativni stres, šećerna bolest, lipidna peroksidacija, akarboza
 
Pristiglo: 8. rujna 2005.                                                                                                            Prihvaćeno: 27. ožujka 2006.
 
Uvod
 
Proces lipidne peroksidacije je jedan oblik oksidativne promjene polinezasićenih masnih kiselina koji rezultira nastankom citotoksičnih produkata, a jedan od njih je malondialdehid (MDA) (1). MDA je prihvaćeni biljeg lipidne peroksidacije te se koristi u evaluaciji oksidativnog stresa (1). Mogući uzroci oksidativnog stresa u šećernoj bolesti su slijedeći: a) prekomjerno stvaranje reaktivnih kisikovih spojeva (ROS), posebno superoksid aniona (O2–) b) smanjena ekspresija/aktivacija endotelne NO sintaze c) oštećena ekspresija/aktivacija superoksid dismutaze (SOD) d) smanjena aktivnost antioksidativnih enzima: katalaze (CAT) i glutation peroksidaze (GPx) e) smanjena razina antioksidanasa: glutationa, a-tokoferola i askorbata. f) povećana neenzimska glikacija proteina i stvaranje tzv. produkata kasne glikacije (AGE) g) povećana autooksidacija glukoze h) hiperaktivnost poliolnog puta i stvaranje sorbitola.
Reaktivni kisikovi spojevi (ROS) mogu promijeniti funkciju endotela krvnih žila indirektno preko povećane produkcije produkata kasne glikacije (AGE) ili povećanjem oksidacije lipoproteina niske gustoće (LDL). Najvažniji od reaktivnih kisikovih spojeva je superoksid anion (O2–) koji uzrokuje kontrakciju glatkih mišića krvnih žila (2). Glavne posljedice oksidativnog stresa su: narušavanje strukture biomembrana, oštećenje nukleinskih kiselina, inhibicija enzima, razgradnja bjelančevina i lipidna peroksidacija. Kemijska modifikacija aminokiselina u proteinima tijekom lipidne peroksidacije rezultira formiranjem lipooksidacijskih produkata koji služe kao markeri oksidativnog stresa in vivo. Malondialdehid (MDA) i 4-hidroksinonenal (HNE) su dobro definirani oksidacijski produkti polinezasićenih masnih kiselina (3). MDA reagira s proteinima krvnih žila npr. s kolagenom i dovodi do promjena u njegovoj strukturi (4). Mnoge su studije pokazale da je njegova koncentracija znatno povišena u šećernoj bolesti (5). U radu Faure i sur. je opisano da je kontrola glikemije neophodna za smanjenje lipidne peroksidacije, odnosno koncentracije MDA (6). Akarboza je prvi lijek izbora u tretmanu šećerne bolesti tipa 2, a isto tako novija istraživanja pokazuju njen povoljan učinak na prevenciju šećerne bolesti u osoba sa oštećenom tolerancijom glukoze (7). Stoga je cilj ovog rada bio evaluirati oksidativni stres i lipidnu peroksidaciju u NOD miševa kojima je šećerna bolest izazvana aloksanom, određivanjem koncentracije MDA u homogenatu jetre jer je i jetra jedan od organa u kojem je dokazana povećana lipidna peroksidacija u tom patološkom stanju, te ispitati učinak akarboze na koncentraciju tog parametra lipidne peroksidacije.
 
Materijali i metode
Eksperimentalne životinje
U ovom radu korišteni su miševi soja NOD (engl. non-obese diabetic) u dobi od 3–4 mjeseca i tjelesne mase 23–30 g, uzgojeni u Laboratoriju za molekularnu endokrinologiju i transplataciju, Instituta “Ruđer Bošković”. Životinje su držane u metaboličkim kavezima na temperaturi od 22–24 °C u 12-satnom svjetlo/tama ciklusu te su hranjene standardnom laboratorijskom hranom (Pliva, Zagreb) i davana im je voda ad libidum.
U našem eksperimentu šećerna bolest u NOD miševa izazvana je i.v. aplikacijom aloksan-monohidrata (Sigma, St. Louis, MO) u dozi od 75 mg/kg tjelesne mase sedam dana prije početka tretmana akarbozom. Životinje su podijeljene u 4 skupine, po 6 u svakoj. Kontrolna, zdrava skupina NOD miševa (K), kontrolna, zdrava skupina NOD miševa tretirana 7 dana akarbozom u dozi od 25 mg/100 g standardne laboratorijske hrane (K/A), skupina dijabetičnih NOD miševa (D), skupina dijabetičnih NOD miševa tretirana 7 dana akarbozom u dozi od 25 mg/100 g standardne laboratorijske hrane (D/A).
Neposredno prije žrtvovanja u eter narkozi NOD miševima je izvađena venska krv u kojoj je određena koncentracija glukoze.
Priprema homogenata jetre
Nakon žrtvovanja u eter narkozi, NOD miševima je izvađena jetra te višekratno isprana u fiziološkoj otopini te držana na hladnom do obrade. Jetra je izvagana, a zatim homogenizirana pomoću Ultra-Turax homogenizatora tip TP 1812 NR 3219 (tri puta pri 13 000 rpm/30 sek.). Homogenat u koncentraciji 100 g/L načinjen je uz pomoć 0,14 M otopine KCl-a te uz stalno hlađenje u vodi s ledom. Homogenati jetre su zatim centrifugirani na 12 000 g 30 minuta pri +4°C u Eppendorf centrifugi Hettich EBA 12 R. Nakon centrifugiranja homogenati jetre su čuvani na –20°C do analize. U tako dobivenom homogenatu jetre određena je koncentracija MDA.
Određivanje koncentracije MDA
Lipidna peroksidacija određena je mjerenjem malondialdehida (MDA) u homogenatima jetre NOD miševa uz pomoć tiobarbiturne kiseline (8). Metoda se temelji na slijedećem principu: zagrijavanjem tiobarbiturne kiseline i višestruko nezasićenih masnih kiselina u kiselom mediju kao sekundarni produkt nastaje ružičasti MDA, čija se apsorbancija mjeri spektofotometrijski kod valne dužine od 532 nm. Apsolutna količina MDA očitana je iz baždarnog dijagrama koji je pripremljen iz različitih razrijeđenja matičnog standarda 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP).
Određivanje koncentracije glukoze
Glukoza u krvi NOD miševa određena je metodom glukoza oksidaza-peroksidaza (GOD-PAP) (9) reagensima tvrtke Trace. Apsorbancija uzorka očitana je prema slijepoj i standardu pri valnoj dužini od 500 nm.
Statistička metoda
Srednja vrijednost (sv) i standardna devijacija (sd) izračunate su pomoću računala korištenjem programa Excel, MicrosoftÒ. Razina značajnosti (p) izračunata je korištenjem Student-t-testa, istog programa. Statistički značajnom promjenom smatrana je promjena za koju je p<0,05.
 
Rezultati
Koncentracija glukoze u serumu NOD miševa
Tablica 1. prikazuje koncentraciju glukoze u serumu NOD miševa izmjerenu sedmog dana od početka tretmana akarbozom. Koncentracija glukoze kontrolne, zdrave skupine NOD miševa (skupina K) je 4,63 ± 0,30 mmol/L, dok je u kontrolnoj skupini s dodatkom akarboze u hrani u dozi od 25 mg/100 g standardne laboratorijske hrane (skupina K/A) izmjerena koncentracija glukoze 2,85 ± 0,42 mmol/L tj. zabilježen je njen statistički značajan hipoglikemijski učinak (p<0,001). NOD miševi sa šećernom bolesti (skupina D) imaju statistički značajno višu koncentraciju glukoze u usporedbi s kontrolnom, zdravom skupinom NOD miševa (skupina K) (p<0,01). U skupini D izmjerena koncentracija glukoze u serumu bila je 31,28 ± 4,54 mmol/L, dok je u dijabetičnih NOD miševa tretiranih akarbozom u dozi od 25 mg/100 g standardne laboratorijske hrane (skupina D/A) izmjerena koncentracija glukoze bila 16,44 ± 9,5 mmol/L što je također statistički značajno niže u usporedbi s dijabetičnom skupinom D (p<0,05).
Koncentracija MDA u homogenatu jetre NOD miševa
Koncentracija MDA mjerena je u homogenatu jetre NOD miševa i rezultati su također prikazani u tablici 1.
 
Tablica 1. Koncentracija glukoze u serumu (mmol/L) i koncentracija MDA u jetri NOD miševa (mM/g jetre)
 
Koncentracija MDA mjerena u jetri kontrolnih, zdravih NOD miševa (skupina K) bila je 13,02 ± 1,84 mM/g. U skupini zdravih NOD miševa koja je tijekom sedam dana bila tretirana akarbozom u dozi od 25 mg/100 g standardne laboratorijske hrane (skupina K/A) izmjerena je statistički značajna niža koncentracija MDA u jetri 9,25 ± 1,04 mM/g (p<0,01). Dijabetična skupina NOD miševa (skupina D) imala je statistički značajno višu koncentraciju MDA u usporedbi s kontrolnom, zdravom skupinom (p<0,05). Promjena koncentracije MDA mjerena u dijabetičnoj skupini NOD miševa tretiranoj akarbozom u dozi od 25 mg/100 g standardne laboratorijske hrane (skupina D/A) bila je statistički značajno niža u usporedbi sa skupinom D (p<0,05) (12,65 ± 5,73 mM/g vs. 24,57 ± 3,75 mM/g).
 
Rasprava
 
Oksidativni stres je karakteriziran povećanom produkcijom slobodnih radikala i/ili smanjenom aktivnosti antioksidativne obrane. U eksperimentalnom modelu šećerne bolesti, stanje oksidativnog stresa je izazvano auto-oksidacijom glukoze i glikacijom proteina (10). Oksidativnom stresu danas se posvećuje velika pažnja kao procesu koji je vjerojatno odgovoran za nastanak komplikacija u šećernoj bolesti (ateroskleroza, nefropatija, neuropatija i retinopatija) (11,12). Jedna od posljedica oksidativnog stresa je i lipidna peroksidacija. Od parametara lipidne peroksidacije mjere se: koncentracija lipidnih peroksida, koncentracija konjugiranih diena te koncentracija malondialdehida (MDA) koji je visokotoksičan konačni produkt lipidne peroksidacije vjerojatno nastao njihovim neenzimskim oksidativnim raspadom. Altomare i suradnici (13) uspoređivali su koncentracije MDA u skupinama: osoba sa šećernom bolesti sa slabo kotroliranom glikemijom, dobro kontroliranom glikemijom i usporedili rezultate sa zdravim, normoglikemičnim osobama. Njihovi rezultati pokazuju znatan porast koncentracije lipidnih peroksida u plazmi pacijenata sa slabo kontroliranom glikemijom u usporedbi s druge dvije skupine ispitanika. Pokus Armstronga i sur. (14) pokazao je da već i strogo nadziran način prehrane kod osoba sa šećernom bolesti dovodi do sniženja koncentracije MDA.
Hiperglikemija u šećernoj bolesti je primarni uzrok oksidativnom stresu i lipidnoj peroksidaciji. Ona naime uzrokuje promjene u staničnom redoks statusu preko nekoliko različitih mehanizama: mijenja regulaciju protein tirozin kinaza, mijenja regulaciju protein kinaze C, dovodi do nakupljanja sorbitola te povisuje omjer NADH/NAD+ i smanjuje omjer NADPH/NADP+ preko hiperaktivnosti sorbitol (poliolnog) puta. Posljedica svega toga je neravnoteža citosolnog redoks statusa ili to stanje se naziva i pseudohipoksija, zbog povišenog omjera NADH/NAD+ koji prikriva hipoksiju tkiva (15).
Primjena lijekova koji snizuju hiperglikemiju (posebno postprandijanu) je važna u smanjivanju komplikacija u šećernoj bolesti uzrokovanih oksidativnim stresom.
Stoga smo u ovom radu ispitali hipoglikemijski učinak akarboze i njen utjecaj na oksidativni stres, odnosno lipidnu peroksidaciju u NOD miševa. Akarboza je pseudooligosaharid dobiven kao sekundarni metabolit iz kultura Actinomycetales. Molekula akarboze se sastoji iz nezasićenog cikloheksitolskog ostatka koji je vezan za aminošećer i dva glukozna ostatka putem a-1,4 glikozidnih veza. Njen antihiperglikemijski učinak temelji se na činjenici da je ona kompetitivni inhibitor intestinalnih a-glukozidaza, koje obuhvaćaju glukoamilaze, saharaze, maltaze i a- dekstrinaze, a ti su enzimi neophodni za razgradnju škroba, saharoze i maltoze (16). Akarboza se veže na navedene a-glukozidaze s afinitetom koji je 10 000 do 100 000 puta veći od istog npr. saharoze. Inhibicija ove enzimske aktivnosti akarbozom smanjuje brzinu nastanka monosaharida i njihovu apsorpciju u tankom crijevu. I novija istraživanja potvrđuju učinak akarboze na smanjenje postprandijalne hiperglikemije u osoba s oštećenom tolerancijom glukoze i osoba s tipom 2 šećerne bolesti (17). Akarboza također smanjuje makrovaskularne komplikacije, odnosno oštećenje endotela u postprandijalnoj hiperglikemiji (18). Znanstvena istraživanja su potvrdila da je oksidativni stres uključen u patogenezu kardiovaskularnih bolesti tijekom šećerne bolesti. Međutim, još je uvijek nejasno da li oksidativni stres nestaje smanjenjem postprandijalne hiperglikemije. U radu autora Assaloni i sur. dokazano je da se kontrolom postprandijalne hiperglikemije oralnom primjenom mitiglinida smanjuje oksidativni stres i lipidna peroksidacija i na taj način spriječava nastanak kasnih dijabetičnih komplikacija (19).
U ovom radu prikazana je statistički značajno povišena koncentracija MDA u jetri (p<0,05) i glukoze u serumu (p<0,01) u NOD miševa u kojih je šećerna bolest izazvana aloksanom (D) u usporedbi s kontrolnom, zdravom skupinom (K) što potvrđuje stanje oksidativnog stresa i lipidne peroksidacije u dijabetičnoj skupini NOD miševa. Pokusom je dokazan hipoglikemijski učinak akrboze u maloj dozi (25 mg /100 g standardne laboratorijske hrane) (p<0,05), a također je zabilježen i povoljan učinak akrboze na stanje oksidativnog stresa, naime u dijabetičnih NOD miševa nakon tretmana akrbozom u trajanju od sedam dana (skupina D/A), koncentracija MDA bila je statistički značajno niža (p<0,05) u usporedbi s dijabetičnom skupinom NOD miševa (skupina D). Povoljan učinak akarboze na koncentraciju MDA može se objasniti njenim antihiperglikemijskim učinkom.
 
Literatura
 
1.   Bukan N, Sancak B, Yavuz O, Koca C, Tutken F, Ozcelikay AT, Altan N. Lipid
2.   peroxidation and scavening enzyme levels in the liver of streptozotocin-induced diabetic rats. Indian J Biochem Biophy 2003; 40(6):447-50.
3.   Bayraktutan U. Free radicals, diabetes and endothelial dysfunction. Diab Obes Metab 2002;4:224-38.
4.   Requena JR, Fu MX, Ahmed MU, Jenkins AJ, Lyons TJ, Thorpe SR. Lipoxidation products as biomarkers of oxidative damage to proteins during lipid peroxidation reactions. Nephrol Dial Transplant 1996;11 Suppl 5:48-53.
5.   Tiku ML, Allison GT, Naik K, Karry SK. Malondialdehyde oxidation of cartilage collagen by chondrocytes. Osteoarthritis Cart 2003;11(3):159-66.
6.   Slatter DA, Bolton CH, Bailey AJ. The importance of lipid-derived malondialdehyde in diabetes mellitus. Diabetologia 2000;43(5):550-7.
7.   Faure P, Corticelli M. Lipid peroxidation and trace element status in diabetic ketotic patients: Influence of insulin therapy. Clin Chem 1993;39:789-93.
8.   Van de Laar FA, Lucassen PLBJ, Akkermans RP, Van de Lisdonk EH, Ruten GEHM, Van Weel C. Alpha-glucosidase inhibitors for type 2 diabetes mellitus. Cochrane Database System Rev (2): PUB 2, 2005.
9.   Uchyjama M, Mihara M. Determination of malondialdehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Anal Biochem 1977;86:271-8.
10. Burrin JM, Price CP. Measurement of blood glucose. Ann Clin Biochem 1985;22:327-42.
11. Feillet-Coundray C, Rock E, Coundray C. Lipid peroxidation and antioxidant status in experimental diabetes. Clin Chim Acta 1999;284:31-43.
12. Maritim AC, Sanders RA, Watkins JB. Diabetes, oxidative stresss and antioxidants: a review. J Biochem Mol Toxicol 2003;17(1):24-38.
13. Baynes JW. Role of oxidative stress in development of complications in diabetes. Diabetes 1991;40:405-12.
14. Altomare E, Vendemiale K et al. Increased lipid peroxidation in Type 2 poorly controlled diabetic patients. Diabetes and Metabolisme 1992;18:246-71.
15. Armstrong AM, Chestnutt JE et al. The effect of dietary treatment of lipid peroxidation and antioxidant status in newly diagnosed non-insulin dependent diabetes. Free Rad Biol Med 1996;21:719-26.
16. Williamson JR, Chang K, Frangos M et al. Hyperglycaemic pseudohypoxia and diabetic complications. Diabetes 1993;42:801-13.
17. Clissold SP, Edwards C. Acarbose. A preliminary review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic potential. Drugs 1988;35:214-43.
18. Charpentier G, Riveline JP, Dardari D, Varround-Vial M. Should postprandial hyperglycaemia in prediabetic and type 2 diabetic patients be treated? Drugs 2006;66(3):273-86.
19. Shimabukuro M, Higa N, Chinen I, Yamakava K, Takahasu N. Effects of a single administration of acarbose on postprandial glucose excursion and endothelial dysfunction in Type 2 diabetic patients: A randomized crossover study. J Clin Endoc Metab 2006;91(3):837-42.
20. Assaloni R, Da Ros R, Quagliaro L, Piconi L, Maier A, Zuodar G, Motz E, Ceriello A. Effects of S21403 (mitiglinide) on postprandial generation of oxidative stress and inflammation in type 2 diabetic patients. Diabetologia 2005;48;1919-24.