Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Izvorni znanstveni članak:

Tarannum F. Subhani1, Mohammad A. Nasar2, Abdalla Jarrari2, Vivian D’Souza1, Mohammad A. Naseer3, Faiyaz Shakeel4*. 5’-nucleotidase, oxidative stress and antioxidant status in alcohol consumers and cirrhotic patient.Biochemia Medica 2009;19(3):277-86.
 
1Katedra za biokemiju, Medicinski koledž u Kasturbi, Sveučilište Manipal, Mangalore, Indija
2Katedra za biokemiju, Medicinski fakultet, Medicinsko sveučilište Al-Arab, Benghazi, Libija
3Odjel za farmacutsku kemiju, Jamia Hamdard, New Delhi, Indija
4Katedra za farmaceutiku, Farmaceutski fakultet, Medicinsko sveučilište Al-Arab, Benghazi, Libija
 
Corresponding author*: faiyazs [at] fastmail [dot] fm
 
Sažetak
 
Uvod: Cilj istraživanja bio je izmjeriti aktivnost enzima 5’-nukleotidaza kod bolesnika s cirozom jetre i osoba koje uzimaju alkohol. U istraživanju se ispitivao i oksidacijski stres, antioksidansi te njihova povezanost s 5’-nukleotidazom.
Materijali i metode: Istraživanje je provedeno u tri skupine po 25 ispitanika jednake dobi i spola: I. skupina (kontrolni ispitanici), II. skupina (osobe koje uzimaju alkohol, tj. konzumenti alkohola) i III. skupina (bolesnici s cirozom jetre). Uzorci krvi prikupljeni od ispitanika centrifugirani su kako bi se odvojila plazma za analizu 5’-nukleotidaze. Odvojene stanice su tri puta isprane 0,9-postotnom hladnom fiziološkom otopinom i upotrebljene za analizu glutationa, malondialdehida i superoksid-dismutaze.
Rezultati: Aktivnost 5’-nukleotidaze u serumu bila je statistički značajno povišena kod skupine bolesnika s cirozom i skupine konzumenata alkohola. Koncentracije malondialdehida bile su također statistički značajno povišene kod bolesnika s cirozom jetre i konzumenata alkohola. Koncentracije glutationa i superoksid-dismutaze bile su statistički značajno snižene u obje skupine.
Zaključak: Iz ovih rezultata može se zaključiti da je aktivnost 5’-nukleotidaze u serumu dosljedno viša kod bolesnika s cirozom jetre i osoba koje uzimaju alkohol. Zapažena razlika mogla bi ukazivati na opseg oštećenja jetre, oštećenja hepatobilijarnog sustava i opstrukcije jetre.
Ključne riječi: konzumenti alkohola; učinci antioksidansa; 5’-nukleotidaza; oksidacijski stres
 
Pristiglo: 5. svibnja 2009.
Prihvaćeno: 3. kolovoza 2009.
 
Uvod
 
5’-Nukleotidaza (5’-NT) je unutarstanični membranski glikoprotein koji je prisutan kao ektoenzim kod mnogih vrsta stanica sisavaca, a hidrolizira 5’-nukleotide do njihovih odgovarajućih nukleozida (1). Određuje ga se kao pokazatelja oštećenja jetre koje je primarno rezultat inteferencije s izlučivanjem žuči (2). Aktivnost enzima povećava se kod jetrenih bolesti uključujući cirozu jetre, kronični alkoholizam, novotvorine jetre i žučnih kanala, dobroćudnu bolest bilijarnog sustava, no svoju najvišu vrijednost doseže u jetrenoj opstrukcije (3,4). Dijagnostička vrijednost 5’-NT pokazala se boljom od one jetrenih enzima, naročito kod metastaza u jetri. Pojačana aktivnost 5’-NT izmjerena je kod 92% bolesnika s opstrukcijskom žuticom, 70% bolesnika s parenhimskom bolešću jetre i 81% bolesnika s metastazama u jetri (5,6). Također se izvještavalo da je aktivnost 5’-NT u serumu klinički korisna za postavljanje diferencijalne dijagnoze hepatobilijarnih i koštanih bolesti, budući da se aktivnost enzima pojačava samo kod hepatobilijarnih bolesti (7).
Iako određivanje samo oksidacijskih ili antioksidacijskih sastavnica može pružiti podatak o oksidacijskom stresu, određivanje oksidansa zajedno s antioksidansima je u ovom kontekstu korisnije (8,9). Istraživanja su ukazala na pojavu slobodnih radikala kisika u ranom stadiju fibroze i ciroze jetre (10). Kod bolesnika oboljelih od ciroze jetre uslijed uzroka koji nisu vezani uz alkohol ili zbog pretjeranog uzimanja alkohola bilježi se smanjena koncentracija antioksidansa kao što su glutation (GSH) i superoksid-dismutaza (SOD) i povećana koncentracija proizvoda lipidne peroksidacije kao što je malondialdehid (MDA) (11-19). Nastanak jetrene fibroze kod ciroze jetre izazvane alkoholom zamršen je proces koji, čini se, uključuje metaboličke proizvode oksidacije etanola; indukciju citokroma P450, pojačan oksidacijski stres, oslabljenu antioksidacijsku obranu, lipidna peroksidaciju, stvaranje aldehidnih proizvoda, učinke mitogenskih i fibrogenskih citokina i složene interakcije između jetrenih parenhimskih i ne-parenhimskih stanica s jetrenim zvjezdastim stanicama (Ito stanice, jetreni lipociti ili stanice koje pohranjuju masti) koje danas su prepoznate kao primarni izvori izvanstaničnog matriksa (20,21).
Postoje dokazi da je bolesna jetra kod bolesnika s kolestatskom bolešću jetre izložena oksidacijskom stresu povezanom s povećanom lipidnom peroksidacijom koja uključuje unutarorgansko stvaranje reaktivnih kisikovih spojeva (engl. reactive oxygen species, ROS), pričem je moguće da posreduju endotoksini, žučne kiseline i nakupljanje razgradnih produkata lipidne peroksidacije, kao što su lipidni peroksidi i MDA (20,22). Alkohol pospješuje stvaranje ROS i/ili utječe na normalan tjelesni obrambeni sustav koji brani organizam od tih spojeva (23). Istraživanja pokazuju da su slobodni kisikovi radikali nađeni i u ranom stadiju razvoja fibroze i ciroze jetre (10).
Ovo je istraživanje provedeno kako bi se izmjerila aktivnost enzima 5’-NT kod bolesnika s cirozom jetre i osoba koje uzimaju alkohol. U istraživanje su uključeni i oksidacijski stres, antioksidansi i njihova povezanost s 5’-NT.
 
Materijali i metode
Ispitanici
Istraživanje je provedeno u 3 skupine od po 25 ispitanika u dobi od 35-70 godina. U svakoj je skupini bilo 13 muškaraca i 12 žena:
I. skupina (kontrolna skupina): zdravi ispitanici, raspon dobi od 35 do 70 godina (medijan: 55, interkvartilni raspon (engl. interquartile range, IQR): 45-60) bez ikakve bolesti jetre u anamnezi, nisu uzimali alkohol niti ga uzimaju sada;
II. skupina (skupina konzumenata alkohola): raspon dobi od 35 do 70 godina (medijan: 55, IQR: 45-60) s povijesti uzimanja alkohola kroz 10 godina ili više, ali bez jetrenih ili hepatobilijarnih poremećaja u anamnezi. Ispitanici ove skupine su tijekom istraživanja uzimali 6250-7500 mg alkohola na dan. Ispitanici iz ove skupine s poviješću alkoholizma odabrani su osobnim kontaktom preko poznatih osoba koje uzimaju alkohol.
III. skupina (skupina bolesnika s cirozom jetre): raspon dobi od 35 do 70 godina (medijan: 55, IQR: 45-60) s dijagnozom ciroze jetre s ili sa žuticom i uzimanjem alkohola ili hepatotoksičnih lijekova u anamnezi. Bolesnici s cirozom jetre su se liječili u slijedećim bolnicama u Mangaloreu: Okružna bolnica Wenlock; Bolnica K.M.C, Attavar; Bolnica K.M.C., okrug Ambedkar; A.J. Institut za medicinske znanosti, Kuntikana; Bolnica Yenepoya, Kodialbail.
Pri izboru ispitanika za istraživanje vodilo se računa o tome da se iz istraživanja isključe pušači, osobe s navikom žvakanja duhana, osobe s upalnim bolestima, kao što su tuberkuloza, reumatoidni artritis, šećerna bolest i maligne bolesti, jer sve ove bolesti u velikoj mjeri doprinose oštećenju uslijed oksidativnog stresa. Iz istraživanja su isključeni i ispitanici s bilo kojom bolešću kostiju ili s bilo kojim kliničkim stanjem koje bi moglo biti povezano s pojačanjem aktivnosti 5’-nukleotidaze.
Institucionalni klinički etički odbor Medicinskog koledža u Kastrubi, Mangalore, Indija odobrio je ovo istraživanje te su tijekom istraživanja poštovane etičke smjernice Odbora.
Uzorci
Uzorci od 2 mL venske krvi sakupljeni su u obične bočice kako bi se odvojio serum za analizu 5’-NT. Iz medijalne kubitalne vene ili bazilične vene uzeto je 5 mL krvi i stavljeno u odvojenu epruvetu s EDTA pod strogim aseptičnim uvjetima. Od toga se 0,2 mL pune krvi rabilo za određivanje glutationa; ostatak uzorka se 10 minuta centrifugirao na 3000 okr./min unutar 3 sata od uzimanja krvi. Plazma se odbacila. Sediment se rabio za pripremu suspenzije eritrocita i za određivanje koncentracije MDA i aktivnosti SOD.
Metode
Priprema suspenzije eritrocita
Odvojeni sediment tri puta je ispran hladnom 0,9-postotnom fiziološkom otopinom, nakon čega je suspendiran u jednakom volumenu iste fiziološke otopine. Otopina je pohranjena kao 50% suspenzija stanica na 4-5 °C tijekom 24 sata, a nakon toga se rabila u testovima za određivanje koncentracije MDA i aktivnosti SOD.
Određivanje aktivnosti 5’-nukleotidaze
Aktivnost enzima 5’-NT u serumu određena je slijedećom metodom (5). U dvjema epruvetama mjerilo se slijedeće:
- Ukupna aktivnost: dodano je 0,2 mL seruma, 0,1 mL 0,02 M manganova sulfata i 1,5 mL 40 mM barbiton pufera, pH 7,5.
- Aktivnost tkivno nespecifične alkalne fosfataze: dodano je 0,2 mL seruma, 0,1 mL 0,02 M manganova sulfata, 1,3 mL 40 mM barbiton pufera, pH 7,5 i 0,2 mL 0,1 M niklovog klorida.
- Obje epruvete su zagrijane na 37 °C te je u svaku dodano 0,2 mL 10 mM adenozin 5’-fosfata te su 30 minuta inkubirane na 37 °C. Nakon toga je dodano 2 mL 10-postotne triklorooctene kiseline (TCA), dobro promiješano, ostavljeno kratko da odstoji i onda centrifugirano. Uzeto je 2 mL nadtaloga (0,1 mL seruma) kako bi se odredila koncentracija anorganskog fosfora. Kao slijepa proba rabio se 1 mL vode, a kao standard 1 mL fosfatnog standarda (stock otopina sa 6 mmol/L), svakome je dodan 1 mL TCA. U sve četiri epruvete dodano je 2M octenog pufera, pH 4,0; 0,5 mL 5-postotnog amonijevog molibdata i 0,5 mL metola (2 g metola i 10 g natrijevog sulfita u vodi otopljenog do 100 mL), promiješano, ostavljeno da odstoji 10 minuta i tada se vrijednost očitala crvenim filtrom ili na 680 nm. Koeficijent varijacije (% CV) ove metode bio je 1,96.
Malondialdehid (MDA)
Lipidna peroksidacija eritrocita ispitana je putem određivanja reakcijskih proizvoda tiobarbiturne kiseline (TBA). Slijedili smo metodu prema Stocku i Dormandyju s određenim izmjenama (24). Jedan mL suspenzije eritrocita dodan je u 8,5 mL 0,9-postotne fiziološke otopine i dobro promiješano. Nakon toga je dodano 0,44 M H2O2. Iz smjese je odmah izdvojeno 2,5 mL alikvota, čemu je dodan 1 mL 28-postotne TCA u 0,1 M natrijevog metaarsenita. To je dobro promiješano i ostavljeno da stoji 10 minuta, nakon čega je centrifugirano. Uzeto je 3 mL nadtaloga, čemu je dodan 1 mL jednopostotne TBA u 50 mM NaoH. To je tada stavljeno na 15 minuta u kipuću vodenu kupku te nakon toga odmah ohlađeno pod mlazom tekuće vode. Apsorbancija ružičastog kromogena očitana je na spektrofotometru na 535 nm. Vrijednosti su izražene kao nmol/dL eritrocita, uzimajući koeficijent molarne apsorbancije kao 1,56 x 105. CV ove metode bio je 1,88%.
Glutation (GSH)
Koncentracija glutationa u punoj krvi izmjerena je metodom prema Beutleru i sur. (25). 1,8 mL destilirane vode dodano je u 0,2 mL pune krvi i promiješano; dodano je 3 mL precipitirane otopine, pomiješano i ostavljeno da stoji 10 minuta na sobnoj temperaturi. Ta je smjesa tada centrifugirana. U 2 mL nadtaloga dodano je 8 mL fosfatne otopine (0,4 M) i 1 mL DTNB reagensa. Apsorbancija je očitana na 412 mn. CV za tu metodu iznosio je 1,91%.
Superoksid-dismutaza (SOD)
Za određivanje aktivnosti SOD slijedili smo metodu prema Fridovichu (26). Metoda se temelji na inhibiciji redukcije NBT (engl. nitroblue tetrazolium) radikalima superoksida nastalih iluminacijom riboflavina u prisutnosti kisika i donora elektrona. Kao temelj za određivanje aktivnosti SOD rabio se metionin. CV za ovu metodu iznosio je 1,75%.
Priprema hemolizata
Hemolizat je pripremljen prema metodi McCorda i Fridovicha (27). U 1 mL eritrocita (ispranih 0,9-postotnom fiziološkom otopinom) dodan je 1 mL deionizirane vode kako bi se lizirale stanice. Tome se dodalo 0,5 mL destiliranog etanola i 0,3 mL kloroforma te se dobro promiješalo i ostavilo 15 min da odstoji. Nakon toga je dodano 0,2 mL H2O i centrifugirano na 4 °C. Aktivnost SOD je vidljiva u nadtalogu, te se on rabio za test određivanja aktivnosti SOD, nakon što je razrijeđen kalij-fosfat puferom (pH 7,8; 0,05 M). 0,1 mL hemolizata razrjeđen je s 1,9 mL kalij-fosfat pufera. Tako konačno razrijeđeni hemolizat rabio se u niže opisanom postupku.
Uzete su četiri epruvete i svaka je označena jednom naljepnicom: test, kontrola, slijepa proba, slijepa kontrola. U epruvetu test je dodano 2,9 mL reakcijske smjese s NTB koja je sadržavala 149 mg metionina, 4,93 mL NTB (1 mg/mL), 0,63 mL riboflavina (1 mg/mL); ova smjesa se pomiješala s kalij-fosfat puferom (pH 7,8/0,05 M) do količine od 100 mL te je dodano 0,1 mL razrijeđenog hemolizata. U epruvetu slijepa proba dodano je 2,9 mL iste reakcijske smjese bez NTB i 0,1 mL razrijeđenog hemolizata.
U epruvetu kontrola dodano je 2,9 mL iste reakcijske smjese s NTB i 0,1 mL kalij-fosfat pufera (pH 7,8/0,05 M).
U epruvetu slijepa kontrola dodano je 2,9 mL iste reakcijske smjese bez NTB i 0,1 mL kalij-fosfat pufera (pH 7,8/0,05 M). Svaka od ovih smjesa tada je stavljena u odgovarajuću kivetu od 10 mL. Kivete su stavljene na 10 minuta u kutiju obloženu aluminijskom folijom s fluorescentnom lampom od 15W. Apsorbancija za sve četiri kivete izmjerena je u spektrofotometrom na 560 nm.
Određivanje koncentracije hemoglobina
Koncentracija hemoglobina u eritrocitima određena je cijanmethemoglobin metodom (28). Hemoglobin je tretiran reagensom koji sadrži kalijev heksacijanoferat, kalijev cijanid i kalijev dihidrogenfosfat (Drabkinsov reagens). Heksacijanoferat oksidira hemoglobin do methemoglobina koji se uz cijanid pretvara u cijanmethemoglobin. Apsorbancija je izmjerena u spektorfotometru na 540 nm. CV ove metode bio je 1,65%.
Statistička analiza
Svi biokemijski parametri među skupinama uspoređeni su Kruskal Wallisovim testom, a podaci su obrađeni statističkim programom SPSS Version 11 (statistički programski paket za društvene znanosti). Vrijednost P < 0,05 smatrala se statistički značajnom.
 
Rezultati
 
Aktivnost 5’-NT u serumu u ovom je istraživanju bila najveća kod skupine bolesnika oboljelih od ciroze jetre, nešto niža kod skupine konzumenata alkohola, a najniža kod kontrolne skupine (tablica 1.). Pokazana je statistički značajna razlika u koncentraciji parametara između sve tri skupine (P < 0,05) (tablica 1.). Izgleda da su najviše vrijednosti aktivnosti 5’-NT u serumu kod skupine bolesnika s cirozom jetre ukazivale na veću osjetljivost testa na jetrenu opstrukciju ili oštećenje jetrenih stanica (2). Budući da je 5’-NT enzim kojega ima u obilju prvenstveno u jetri, moguće je da na njega utječu i manja područja opstrukcije.
Koncentracija MDA u eritrocitima u ovom istraživanju bila je najviša kod skupine bolesnika s cirozom jetre. Koncentracija MDA kod skupine konzumenata alkohola bila je relativno niža, a najniža je bila kod kontrolne skupine. Pokazana je statistički značajna razlika u koncentraciji parametara između sve tri skupine (P < 0,05).
Koncentracija glutationa u krvi u ovom je istraživanju bila najviša kod kontrolne skupine, relativno niža kod skupine konzumenata alkohola, a najniža kod skupine bolesnika s cirozom jetre, kako je prikazano u tablici 1. Pokazana je statistički značajna razlika u koncentraciji parametara između sve tri skupine (P < 0,05).
Aktivnost SOD u eritrocitima bila je također najviša kod kontrolne skupine, relativno niža kod skupine konzumenata alkohola, a najniža kod skupine bolesnika s cirozom jetre, kako je prikazano u tablici 1. Pokazana je statistički značajna razlika u koncentraciji parametara između sve tri skupine (P < 0,05).
 
Tablica 1. Aktivnost 5’-nukleotidaze (5’NT), koncentracija malondialdehida (MDA) i glutationa te aktivnost superoksid dismutaze (SOD) kod kontrolne skupine, skupine konzumenata alkohola i skupine bolesnika s cirozom jetre.
 
 
Rasprava
 
U ovom su istraživanju uspoređene vrijednosti aktivnosti 5’-NT u serumu, koncentracije proizvoda lipidne peroksidacije i koncentracije antioksidansa između tri skupine ispitanika: skupine bolesnika s cirozom jetre, skupine osoba koje uzimaju alkohol i skupine zdravih ispitanika koji su predstavljali kontrolnu skupinu, ujednačene prema dobi.
Visoka aktivnost 5’-NT u serumu kod skupine bolesnika s cirozom jetre ukazuje na unutarjetrenu opstrukciju žučnih kanalića uslijed fibroze kao rezultata oštećenja jetrenih stanica. Relativno visoka aktivnost kod skupine osoba koje konzumiraju alkohol može se objasniti prethodnom tvrdnjom da katabolizam viših nukleinskih kiselina kod kroničnog trovanja alkoholom dovodi do povećanja aktivnosti ovoga enzima, budući da je on povezan s razgradnjom nukleinskih kiselina, poglavito mRNA. Kronični alkoholizam uzrokuje čitav niz bolesti jetre i drugih organa, što ovisi o količini unesenog alkohola i trajanju unosa alkohola. Učinak alkohola na jetru proteže se od masnih promjena do hepatitisa i ciroze, te će stoga i aktivnost 5’-NT imati raspon koji odgovara oštećenju jetrenih stanica i membrana žučnih vodova, što rezultira umjerenom opstrukcijom jetre. Kod alkoholizma je aktivnost enzima 5’-NT povišena.
Važna je i činjenica da pojačane aktivnosti 5’-NT u serumu, povezane s visokom vjerojatnošću prisutnosti bolesti jetre, potvrđuju kako je svako pojačanje aktivnosti 5’-NT visoko specifično za hepatobilijarne bolesti (1-2). Više koncentracije MDA kod bolesnika s cirozom i osoba koje uzimaju alkohol ukazuju na viši oksidacijski stres kod bolesnika s cirozom jetre i osoba koje uzimaju alkohol (23). Ovi su rezultati sukladni rezultatima nekoliko istraživanja koja su potvrdila uključenost slobodnih radikala u patogenezu oštećenja jetre u slučajevima ciroze jetre i kroničnog alkoholizma (29-31). Glutation ima veliko značenje u redukciji vodikovog peroksida i organskih peroksida (npr. lipidnih peroksida), u reakciji koju katalizira selen koji sadrži GHS-peroksidazu te drugi proteini koji također pokazuju aktivnost GSH-S-tranferaze (32). To je značajan endogeni antioksidans koji proizvodi stanica, a koji izravno sudjeluje u neutralizaciji slobodnih radikala, reaktivnih kisikovih spojeva i sadrži egzogene antioksidanse kao što su vitamini C i E, te ima ulogu u detoksikaciji mnogih ksenobiotika (23).
SOD ima ulogu u uklanjanju vodikovog peroksida (H2O2) koji se stvara u eritrocitima i zbog toga je dokazano da su hemoglobin i SOD u uskoj vezi u eritrocitima. Smanjena koncentracija GSH i slaba aktivnost SOD u staničnim i izvanstaničnim tekućinama smanjuje njen kapacitet hvatanja slobodnih radikala kisika (engl. oxygen derived free radical, ODFR) te čini tkiva podložnijima oštećenjima što ih uzrokuju ODFR (33). Slaba aktivnost GSH i SOD kod bolesnika s cirozom jetre i osoba koje uzimaju alkohol ukazuje na viši oksidacijski stres kod ovih skupina (30).
Viša koncentracija lipidnih peroksida (MDA) i niža koncentracija antioksidansa (GSH i SOD) u eritrocitima bolesnika s cirozom ukazuje na promijenjen oksidacijski i antioksidacijski status (30). Smanjena koncentracija GSH čini stanice podložnijima oksidacijskom stresu.
Naši rezultati pokazuju da je antioksidacijska obrana kod ciroze jetre smanjena, što je povezano sa smanjenjem koncentracije glutationa i aktivnošću antioksidacijskog enzima SOD (18,19). Poznato je da alkohol smanjuje koncentraciju GSH, osobito u mitohondrijima kojima je obično svojstvena visoka koncentracija GSH, potrebna kako bi se uklonili reaktivni kisikovi spojevi proizvedeni tijekom aktivnosti u respiracijskom lancu.
Snižena koncentracija glutationa kod bolesnika s cirozom i u skupini konzumenata alkohola u skladu je s ostalim izvješćima (19). Do smanjenja koncentracije glutationa može doći uslijed (i) njegove funkcije u hvatanju slobodnih radikala, (ii) njegovog sudjelovanja u održavanju ne-GSH proteina sulfhidrila u reduciranom stanju, (iii) njegovog djelovanja kao kofaktora za glutation-S-transferazu (GST) tijekom detoksikacije ksenobiotika uključujući alkohol, (iv) oksidacije glutationa pomoću glutation peroksidaze za detoksikaciju hidrogen peroksida i/ili lipidnih peroksida, (v) supresije sinteze glutationa etanolom. Veći stupanj sniženja koncentracije GSH kod bolesnika s cirozom jetre koji uzimaju alkohol može biti rezultat sinergijskog djelovanja alkohola i ciroze jetre.
Najniža koncentracija glutationa izmjerena je kod skupine bolesnika s cirozom jetre, što ukazuje na to da je glutationski antioksidacijski sustav neuravnotežen kod ciroze jetre, a ti podaci podupiru hipotezu da oksidacijski stres ima važnu ulogu u razvoju ciroze jetre (19). Slaba aktivnost SOD izmjerena kod bolesnika s cirozom jetre i konzumenata alkohola ukazuju na oksidacijski stres koji bi mogao biti odgovoran za najveće uništenje arhitekture jetre. Znatno slabija aktivnost SOD izmjerena kod bolesnika s cirozom jetre ukazuje na to da je oksidacijski stres snažniji kod bolesnika s cirozom jetre nego kod osoba koje uzimaju alkohol, budući da je ciroza jetre čest ishod čitavog niza kroničnih bolesti jetre (22).
Značajno povišenje koncentracije MDA kod bolesnika s cirozom jetre i konzumenata alkohola ukazuje na to da su ove skupine podložnije oksidacijskom stresu. Snižena koncentracija GSH i smanjena aktivnost SOD u ovom istraživanju ukazuju na to da s povišenjem oksidacijskog stresa dolazi do proporcionalnog slabljenja antioksidacijskog obrambenog sustava kod bolesnika s cirozom jetre i osoba koje uzimaju alkohol.
Iz ovih rezultata možemo zaključiti da aktivnost 5’-NT dosljedno raste kod bolesnika s cirozom jetre i osoba koje uzimaju alkohol ovisno o veličini oštećenja na jetri te da se kod bolesnika s cirozom jetre i osoba koje uzimaju alkohol povećava oksidacijski stres, a smanjuje antioksidacijski status, no da je opseg oksidacijskog stresa veći kod bolesnika s cirozom jetre nego kod osoba koje uzimaju alkohol.
 
Zaključak
 
U ovom smo istraživanju pokušali odrediti opseg aktivnosti 5’-NT u serumu skupine bolesnika s cirozom jetra i skupine osoba koje uzimaju alkohol u usporedbi s kontrolnom skupinom zdravih ispitanika. Ovim smo istraživanjem također pokušali odrediti opseg oksidacijskog stresa i antioksidacijskog statusa kod bolesnika s cirozom jetre i osoba koje uzimaju alkohol.
Iz naših se rezultata može zaključiti da je aktivnost 5’-NT u serumu dosljedno viša kod skupine bolesnika s cirozom jetre i osoba koje uzimaju alkohol, sukladno veličini oštećenja jetre, oštećenju hepatobilijarnog sustava i opstrukciji jetre. Također možemo zaključiti da se povećao oksidacijski stres i smanjio antioksidacijski status kod obje promatrane skupine, bolesnika s cirozom jetre i osoba koje uzimaju alkohol, no opseg oksidacijskog stresa je veći kod bolesnika s cirozom jetre nego u osoba koje uzimaju alkohol s ili bez hepatobilijarnih bolesti u anamnezi. Parametri lipidne peroksidacije i antioksidacijske obrane mogli bi biti korisni biljezi kod promatranja bolesnika s hepatobilijarnim bolesima.
 
Zahvala
 
Autori zahvaljuju Medicinskom fakultetu Kasturba u Mangaloreu na osiguranju prostora i opreme potrebnih za provođenje ovoga istraživanja.
 
Literatura
1.     Pagani F, Panteghini M. 5’-Nucleotidase in the detection of increased activity of the liver form of alkaline phosphatase in serum. Clin Chem 2001;47:2046-8.
2.     Smith K, Varon HH, Race GJ, Paulson DL, Urschel HC, Mallams JT. Serum 5’-nucleotidase in patients with tumor in the liver. Cancer 1996;19:1281-5.
3.     Al-Mudhaffar SA, Saadalla V. Kinetics of 5-nucleotidase in sera of liver cirrhotic and normal Iraqi individuals. Biochem Exp Biol 1978;14:339-45.
4.     Dinkov L, Krainikova M, Brailski KH. Serum 5’-nucleotidase activity in chronic hepatobiliary diseases. Vutr Boles 1979;18:39-46.
5.     Belfield A, Goldberg DM. Application of a continuous spectrophotometric assay for 5’-nucleotidase activity in normal subjects and patients with liver and bone disease. Clin Chem 1969;15:931-9.
6.     Rathnakumar G, Raste AS. Can 5’-nucleotidase estimation be a predictor of liver metastases? Ind J Cancer 2000;37:23-6.
7.     Storz G, Imlay JA. Oxidative stress. Curr Opin Microbiol 1999;2:188-94.
8.     Wachstein M, Meisel E. Enzymatic histochemistry of ethionine induced liver cirrhosis and hepatoma. J Histochem Cytochem 1959;7:189-95.
9.     Weinberger B, Watorek K, Strauss R, Witz G, Hiatt M, Hegyi T. Association of lipid peroxidation with hepatocellular injury in preterm infants. Crit Care 2000;6:521-5.
10.   Natarajan SK, Thomas S, Ramamoorthy P, Basivireddy J, Pulimood AB, Ramachandran A, et al. Oxidative stress in the development of liver cirrhosis. J Gast Hepatol 2006;21:947-57.
11.   Muller G, Rahfeld B, Jannasch M. Malondialdehyde concentration in blood plasma of patients with liver diseases. Z Gesamte Inn Med 1992;47:263-5.
12.   Loguercio C, Girolamo VD, Cuomo A, Argenzio F, Iannotta C, Disalvo D, et al. Determination of plasma γ-glutathione-S-transferases in chronic alcohol abusers: relationship with alcohol intake and liver involvement. Alcohol Alcohol 1998;33:366-72.
13.   Bleich S, Spilker K, Kurth C, Degner D, Quintela-Schneider M, Javaheripour K, et al. Oxidative stress and an altered methionine metabolism in alcoholism. Neurosci Lett 2000;293:171-4.
14.   Yamamoto Y, Yamashita S, Fujisawa A, Kokura S, Yoshikawa T. Oxidative stress in patients with hepatitis, cirrhosis and hepatoma evaluated by plasma antioxidants. Biochem Biophys Res Commun 1998;247:166-70.
15.   Par A, Roth E, Rumi G, Kovacs Z, Nemes J, Mozsik G. Oxidative stress and antioxidant defense in alcohol liver disease and chronic hepatitis C. Orv Hetil 2000;141:1655-9.
16.   Purucker E, Wernze W, Krandik G. Glutathione in plasma, liver, and kidney in the development of CCL4-induced cirrhosis of the rat. Res Exp Med 1995;195:193-9.
17.   Purucker E, Winograd R, Roeb E, Matern S. Glutathione status in liver and plasma during development of biliary cirrhosis after bile duct ligation. Res Exp Med 1998;198:167-74.
18.   Czezot H, Scibior D, Skrzycki M, Podsaid M. Activity of antioxidant enzymes in patients with liver cirrhosis. Wiad Lek 2006;59:762-6.
19.   Czezot H, Scibior D, Skrzycki M, Podsaid M. Glutathione and GSH-dependent enzymes in patients with liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Acta Biochim Pol 2006;53:237-42.
20.   Kaplan MM, Gershwin ME. Primary biliary cirrhosis. N Engl J Med 2005;353:1261-73.
21.   Tsukamoto H, Horne W, Kamimura S, Niemela O, Parkkila S, Yia-Herttuala S, et al. Experimental liver cirrhosis induced by alcohol and iron. J Clin Invest 1995;96:620-30.
22.   Casteele MV, Vanpelt JF, Nevens F, Fevery J, Reichen J. Low NO bioavailability in CCL4 cirrhotic rat livers might result from low NO synthesis combined with decreased superoxide dismutase activity allowing superoxide-mediated NO breakdown: A comparison of two portal hypertensive rat models with heal controls. Comp Hepatol 2003;2:E2.
23.   Huang MC, Chen CH, Peng FC, Tang SH, Chen CC. Alterations in oxidative stress status during early alcohol withdrawal in alcohol patients. J Formos Med Assoc 2009;108:560-9.
24.   Stocks J, Dormandy TL. The auto-oxidation of human red cell lipids induced by hydrogen peroxide. Br J Hematol 1971;20:95-111.
25.   Beutler E, Duron O, Kelly BM. Improved method for the determination of blood glutathione. J Lab Clin Med 1963;61:883-7.
26.   Fridovich I. Superoxide dismutase. Annu Rev Biochem 1975;44:147-59.
27.   McCord JM, Fridovich I. Superoxide dismutase: an enzyme function for erythrocuperin (hemocuperin). J Biol Chem 1969;244:6049-55.
28.   Drabkin DL, Austin JM. Spectrophotometric constants for common haemoglobin derivatives in human, dog and rabbit blood. J Biol Chem 1932;98:719-33.
29.   Baginski ES, Marie SS, Epstein E, Zak B. Simple, direct determination of serum 5’-nucleotidase. Ann Clin Lab Sci 1977;7:469-78.
30.   Wu D, Cedarbaum AI. Oxidative stress and alcohol liver disease. Semin Liver Dis 2009;29:141-54.
31.   Ljubuncic P, Tanne A, Bomzon A. Evidence of a systematic phenomenon for oxidative stress in cholestatic liver disease. Gut 2000;47:710-6.
32.   Meister A. Selective modification of glutathione metabolism. Science 1983;220:472-7.
33.   Gupta VK, Mallika V, Gupta Y, Srivastava DK. Oxygen derived free radicals in clinical context. Ind J Clin Biochem 1992;7:3-10.