Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Original professional article:

Adriana Unić1*, Lovorka Đerek1, Nevenka Stančin2, Tihana Serdar1, Novka Šprajc1, Željko Romić1. Comparison of two immunoassays for CA19-9, CEA and AFP tumor markers. Biochemia Medica 2010;20(1):82-9.

1Clinical Department for Laboratory Diagnosis, Dubrava University Hospital, Zagreb, Croatia

2Department of Nuclear Medicine, Dubrava University Hospital, Zagreb, Croatia

 

*Corresponding author: aunic [at] kbd [dot] hr

 

Sažetak

 

Uvod: Monoklonska antitijela koriste se za otkrivanje antigena u serumu koji su povezani sa specifičnim zloćudnim oboljenjima. Ti su tumorski biljezi najkorisniji za praćenje odgovora na terapiju i otkrivanje ranog recidiva, međutim, rezultati dobiveni različitima analizama razlikuju se te promjena metode tijekom praćenja može biti uzrokom problema. Cilj ove studije bio je provesti analitičku evaluaciju usporedivosti analiza za tumorske biljega CA19-9, CEA i AFP na dva različita automatizirana kemijska analizatora.

Materijali i metode: Koncentracije CA19-9, CEA i AFP su određene na analizatorima Vitros ECi (Ortho Clinical Diagnostics, Johnson & Johnson, Buckinghamshire, V. Britanija) i Cobas e 411 (Hitachi High Technologies Corporation, Tokyo, Japan). Korelacija među metodama ispitana je na 38 uzoraka seruma za CA19-9 i AFP te 39 uzoraka seruma za CEA.

Rezultati: Vrijednosti komercijalnih kontrolnih uzoraka bile su unutar raspona navedenih od proizvođača za sve tumorske biljege uključene u istraživanje na oba analizatora. Najveće odstupanje od deklariranih kontrolnih vrijednosti nađene su za CA19-9 na analizatoru Vitros ECi te za AFP na analizatoru Cobas e411. Visoka je korelacija utvrđena među metodama za sva tri ispitana tumorska biljega (r = 0,978 za CA19-9; r = 0,995 za CEA, te r = 0,999 za AFP). Nagib i odsječak na osi Y iznosili su 1, odnosno 0, samo za usporedbenu analizu AFP.

Zaključak: Rezultati istraživanja pokazali su najbolje podudaranje vrijednosti za AFP dobivene na dva ispitana analizatora za imunoanalize. Bez obzira na snažne korelacije, regresija po Passing-Babloku ukazala je na nižu usporedivost dviju imunoanaliza za CEA i CA19-9.

S obzirom da su rezultati studije potvrdili zapažanja iz svakodnevnog rutinskog rada, za svakoga je pacijenta od najveće važnosti da ga se prati primjenom iste imunoanalize i reagensa na istom analizatoru.

Ključne riječi: tumorski biljezi; ugljikohidratni antigen 19-9; alfa-fetoprotein; karcinoembrionalni antigen; imunoanaliza

Pristiglo: 7. listopada 2009.

Prihvaćeno: 2. prosinca 2009.

 

Uvod

 

Tumorski se biljezi koriste za procjenu rizika karcinoma, rano otkrivanje bolesti, probir, dijagnozu, prognozu i predviđanje uspješnosti terapije te otkrivanje recidiva ili praćenje napredovanja bolesti. Ne postoji, međutim, tumorski biljeg koji bi bio dovoljno specifičan i osjetljiv za probiranje zdrave populacije. Monoklonska se antitijela koriste za određivanje specifičnog antigena u serumu, kojeg stvaraju tumorske stanice ili stanice koje induciraju tumorske stanice domaćina (1).

Karcinoembrionalni antigen (CEA) je po prvi put opisan prije više od tri desetljeća kad je njegova prisutnost dokazana u fetalnom crijevnom tkivu te u tumorima probavnog sustava. CEA je nadalje otkriven u krvotoku bolesnika i prepoznat kao serumski biljeg kolorektalnog karcinoma. Iako se taj tumorski biljeg ne preporuča kao pretraga probiranja na kolorektalni karcinom, prijeoperacijska koncentracija CEA u serumu je korisna za dijagnozu i prognozu recidiva te preživljenja bolesnika s kolorektalnim karcinomom. Koncentracije CEA u serumu rastu s napredovanjem bolesti (2,3).

Ugljikohidratni antigen 19-9 (CA19-9) je najvredniji kao serumski biljeg karcinoma gušterače i žuči, no njegove se povišene koncentracije pojavljuju i u nekoliko drugih zloćudnih oboljenja probavnog sustava (npr. karcinoma želuca, jetre, dojke, pluća, te u kolorektalnim i ginekološkim karcinomima). Povišene se koncentracije mogu, međutim, pojaviti i u benignim bolestima. Koncentracije CA19-9 u serumu su povišene u 70-90% bolesnika s karcinomom gušterače te odražavaju opterećenje tumorom, a visoke koncentracije povezane su s nepovoljnim ishodom. Poslijeterapijsko praćenje koncentracija biljega pruža informaciju o odgovoru na terapiju i o recidivu (3-5).

Alfa-fetoprotein (AFP) je biljeg hepatocelularnog karcinoma. Koristi se za dijagnozu, prognozu, te otkrivanje recidiva bolesti, praćenje terapije, kao i probir populacije s visokim rizikom razvoja hepatocelularnoga zloćudnog oboljenja (1,6). Izmjerena koncentracija tumorskih biljega ovisi o njihovoj biološkoj i analitičkoj varijaciji (7,8). Uporaba reagensa različitih proizvođača može rezultirati različitim rezultatima pretraga za isti uzorak, čak i ako je metoda određivanja ista (uključujući uporabu standardiziranih antitijela). To može dovesti do pogrešnog tumačenja rezultata. Zbog tih se razloga, kod određivanja koncentracije tumorskih biljega moraju ispuniti zahtjevi kvalitete, a uz rezultate treba navesti mjernu metodu. Ako je metodu potrebno promijeniti, preporuča se istodobno mjerenje korištenjem obiju metoda (4,9,10).

Cilj ovog istraživanja bio je provesti analitičku evaluaciju usporedivosti analiza za tumorske biljege CA19-9, CEA i AFP na dva različita automatizirana kemijska analizatora. Rezultati su dobiveni na analizatorima Vitros ECi (Ortho Clinical Diagnostics, Johnson & Johnson, Buckinghamshire, V. Britanija) i Cobas e 411 (Hitachi High Technologies Corporation, Tokyo, Japan).

 

Materijali i metode

Materijali

Usporedba metoda provedena je koristeći rutinske uzorke pacijenata koji su analizirani radi standardne dijagnostičke obrade u bolnici; ispitano je 38 uzoraka seruma na CA19-9 i AFP te 39 uzoraka na CEA. Uzorci su potjecali od hospitaliziranih bolesnika s kliničkom sumnjom ili potvrđenom dijagnozom gastrointestinalnih karcinoma koji su primljeni u Klinički zavod za nuklearnu medicinu Kliničke bolnice Dubrava u razdoblju od 21. 3. do 31. 3. 2009. godine. Svaki je serum podijeljen u dva alikvota odmah nakon centrifugiranja: jedan za određivanje koncentracije biljega na analizatoru Vitros ECi u Kliničkom zavodu za nuklearnu medicinu Kliničke bolnice Dubrava, a drugi za mjerenje koncentracije biljega na analizatoru Cobas e 411 u Kliničkom zavodu za laboratorijsku dijagnostiku Kliničke bolnice Dubrava. Serumi su dobiveni nakon centrifugiranja uzoraka krvi 10 minuta na 1006 x g u centrifugi Hettich Rotina 35 R (Hettich, Tuttlingen, Njemačka). Osim analiziranja uzoraka na analizatoru Vitros ECi, dobivene su vrijednosti kontrolnih uzoraka za CEA i AFP nakon imunoanalize BioRad, Lypochek Immunoassay Plus (Bio-Rad Laboratories, Marnes-la-Coquette, France; kontrolni broj serije 40200 - razine 1, 2 i 3). Za CA19-9 korištene su kontrole Vitros Immunodiagnostic Product Oncology Controls (Ortho Clinical Diagnostics, High Wycombe, V. Britanija, kontrolni broj serije 220). Uz analizu uzoraka na analizatoru Cobas e 411 dobivene su vrijednosti kontrolnih uzoraka PreciControl Tumor Marker (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Njemačka; razine 1 i 2; kontrolni broj serije 150568).

Metode

Koncentracije tumorskih biljega u serumu i kontrolnih uzoraka određene su na analizatoru Vitros ECi kemiluminiscencijskom analizom (imunometrijskom), a na analizatoru Cobas e 411 elektrokemiluminiscencijskom analizom prema uputama proizvođača.

Kontrolni su uzorci ispitani svakog dana tijekom 10 dana koliko je trajala studija.

Analitička netočnost prikazana je kao sistemska pogreška (%), a nepreciznost iz dana u dan kao koeficijent varijacije CV (%).

Zahtjevi kvalitete (kriteriji prihvatljivosti) za sve analize postavljeni su prema Westgardovim pravilima (na temelju bioloških varijacija).

Referentni intervali koje navodi proizvođač iznosili su: 0-31,3 kIU/L za CA19-9, 0-6,5 µg/L za CEA, te 0-7 µg/L za AFP na analizatoru Cobas e 411, te 0-37 kIU/L zar CA19-9, 0-5 µg/L za CEA te 0-7,51 µg/L za AFP na analizatoru Vitros ECi.

Statistička analiza

Za kontrolne uzorke izračunata je srednja vrijednost, minimalna i maksimalna vrijednost, kao i koeficijent varijacije te sistemska pogreška.

Za ispitivane uzorke bolesnika izračunat je medijan, minimalna i maksimalna vrijednost te 95%-tni interval pouzdanosti.

Određena je korelacija između rezultata za CA19-9, CEA i AFP te izračunat Spearmanov koeficijent korelacije. Razina značajnosti postavljena je na P < 0,01. Regresija po Passing-Babloku korištena je za usporedbu metoda za svaki tumorski biljeg, uključujući i Cusumov test linearnosti. Statistička analiza provedena je pomoću programske podrške MedCalc 10.1.2.0 (MedCalc, Mariakerke, Belgium).

 

Rezultati

 

Izmjerene vrijednosti komercijalnih kontrolnih uzoraka bile su unutar raspona kojega preporuča proizvođač. Rezultati nepreciznosti iz dana u dan te sistemske pogreške bili su unutar raspona poželjnih specifikacija dobivenih prema biološkim varijacijama. Navedene i izmjerene vrijednosti kontrolnih uzoraka kao i sistemska pogreška i CV% nepreciznosti iz dana u dan prikazane su u tablicama 1. i 2.

 

Tablica 1. Usporedba izmjerenih i zadanih vrijednosti komercijalnih kontrolnih uzorkaka za CEA, AFP i CA19-9 na analizatoru Vitros ECi

 

 

Tablica 2. Usporedba izmjerenih i zadanih vrijednosti komercijalnih kontrolnih uzorkaka za CEA, AFP i CA19-9 na analizatoru Cobas e 411 s

 

Najveće je odstupanje od navedenih kontrolnih vrijednosti nađeno za CA19-9 na analizatoru Vitros ECi, te za AFP na analizatoru Cobas e 411. Ukupna opisna statistika prikazana je u Tablici 3. Koeficijenti korelacije za koncentracije tumorskih biljega dobiveni iz uzoraka ispitanih na uređajima Vitros ECi i Cobas e411 iznosili su: 0,978 za CA19-9, zatim 0,995 za CEA, te 0,999 za AFP (P < 0,001).

 

Tablica 3. Opisna statistika dobivenih vrijednosti uzoraka bolesnika za sve ispitane tumorske biljege

 

Cusumov test linearnosti koji je proveden u sklopu regresije po Passing-Babloku pokazao je da nije bilo značajnog odstupanja od linearnosti (P > 0,01). Rezultati regresije po Passing-Babloku za CEA, AFP i CA19-9 prikazani su na slikama 1., 2. i 3. te u tablici 4.

 

Slika 1. Regresija prema Passing-Babloku za CA19-9 određena na Vitros ECi i Cobas e 411

 

 

Slika 2. Regresija prema Passing-Babloku za CEA određena na Vitros ECi i Cobas e 411

 

 

Slika 3. Regresijska krivulja prema Passing-Babloku za AFP određena na Vitros ECi i Cobas e 411

 

 

Tablica 4. Podaci o regresiji prema Passing-Babloku – nagib i odsječak s 95%-tnim intervalom pouzdanosti (95% CI)

 

Rasprava

 

Cilj ovog istraživanja bio je provjeriti naše iskustvo stečeno u dnevnoj rutini o usporedivosti koncentracija tumorskih biljega dobivenih različitim metodama na različitim analizatorima. Koncentracije svih triju biljega u kontrolnim uzorcima dobivenima na oba analizatora (Vitros ECi i Cobas e 411) podudarale su s obzirom na ciljne vrijednosti koje su naveli proizvođači, no međusobno su se razlikovale. Najveće odstupanje od navedenih kontrolnih vrijednosti nađeno je za CA19-9 na analizatoru Vitros ECi te za AFP na analizatoru Cobas e411. Zanimljiva je činjenica da je najveće odstupanje od navedenih vrijednosti kod analizatora Vitros ECi bilo u normalnom te neznatno povišenom rasponu vrijednosti kontrolnih uzoraka (razine 1 i 2). To, međutim, ne uključuje CEA za koji je najveće odstupanje utvrđeno u normalnom i visokom rasponu kontrolnih uzoraka (razine 1 i 3). Važno je naglasiti da su koeficijenti korelacije za sva tri biljega pokazali visoku korelaciju njihovih specifičnih koncentracija dobivenih na oba analizatora. Podaci dobiveni korištenjem regresije po Passing-Babloku pokazali su da koncentracije CEA i CA19-9 nisu bile podudarne niti su slijedile istu linearnost (nagib i odsječak na osi Y nisu uključivali 1 ili 0), dok su koncentracije AFP dobivene na oba analizatora bile podudarne i imale istu linearnost (nagib i odsječak na osi Y uključivali su 1 ili 0). Na temelju tih podataka možemo zaključiti da nije bilo razmjerne razlike između rezultata za CEA i CA19-9. Zbog svega navedenog, usporedivost koncentracija tumorskih biljega na dva različita analizatora nije zadovoljavajuća. Koncentracije AFP dobivene na dva analizatora zadovoljile su prioritete regresije prema Passing-Babloku; nagib je bio vrlo blizu 1, a odsječak na osi Y bio je vrlo mali. Bez obzira na visoke korelacije očigledno je da postoje razlike između vrijednosti dobivenih različitim metodama na različitim analizatorima koje se ne mogu zanemariti. Za CEA i AFP dostupne su međunarodne norme SZO (CEA-IRP 73/601; AFP IRP 72/225) (4,9) koje bi trebale osigurati standardizirano i točno umjeravanje; ipak, još uvijek postoje jasne razlike među rezultatima dobivenima na dva ispitana analizatora. Prethodne studije u ovom području ukazuju da pretraga CA19-9 pokazuje značajne razlike između metoda te da se rezultati dobiveni jednom analitičkom tehnikom ne mogu prenijeti na drugu (4,11,12). Razlike između vrijednosti CEA i AFP mogu se objasniti uporabom antitijela s različitim specifičnostima. Što se tiče CA19-9, u objema metodama koristi se isto antitijelo (1116-NS-19-9), što ukazuje da su razlike među rezultatima za CA19-9 dobivene na dva različita analizatora posljedice umjeravanja i osmišljavanja metode (npr. uporabe različitih biljega). Na temelju svih prikazanih rezultata možemo zaključiti da postoje značajne razlike u koncentracijama tumorskih biljega među pojedinačnim pacijentima koje su utvrđene na različitim analizatorima i različitim metodama. S obzirom da je broj ispitanih uzoraka vrlo mali da bi se mogli donijeti bilo kakvi čvrsti zaključci, to bi se ograničenje trebalo uzeti u obzir kod tumačenja naših rezultata. Još jedno ograničenje ovog istraživanja je nedostatak osnovnih podataka o pacijentima.

Važno je pratiti vrijednosti tumorskih biljega kod svakog bolesnika primjenom istih reagensa na istom analizatoru, unatoč njihovoj usporedivosti i visokoj korelaciji (13-16). Najveći se problem pojavljuje kod dugoročnog praćenja, jer u tijeku jedne godine bolesnik može promijeniti bolnicu ili pak laboratorij može uvesti novu metodu mjerenja tumorskih biljega. U idealnom slučaju rezultati dobiveni različitim metodama mogu biti potpuno usporedivi no, kao što pokazuje ishod ove studije, to u praksi nije zabilježeno. U slučajevima kad ta usporedivost nije moguća te kad se mijenjaju metode i analizatori potrebno je definirati novu polaznu koncentraciju tumorskih biljega za praćenje svakog bolesnika.

 

Literatura

 

1. Perkins GL, Slater ED, Sanders GK, Prichard JG. Serum tumor markers. Am Fam Physician 2003;68:1075-82.

2. Chirurgiczna K, Instytutu W, Lotniczej M. CEA, CA-19-9 and IL-8, sTNFRII and sil-2R in persons at high risk of colorectal cancer. Pol Merkuriusz Lek 2003;14:327-30.

3. Kawamura YJ, Tokumitsu A, Sasaki J, Tsujinaka S, Maeda T, Mizogami K, Konishi F. Colorectal carcinoma with extremely low CA19-9. Gastroenterol Res Pract. 2009;2009:780263. Epub 2009; Aug 24.

4. Hotakainen K, Tanner P, Henrik A, Haglund C, Stenman UH. Comparison of three immunoassays for CA19-9. Clin Chim Acta 2009;400:123-7.

5. Safi F, Roscher R, Berger HG. The clinical relevance of the tumor marker CA19-9 in the diagnosing and monitoring of pancreatic carcinoma. Bull Cancer 1990;77:83-91.

6. Jingting J, Changping W, Ning X, Yibei Z, Jun W, Mei J, et al. Clinical evaluation of serum alpha-fetoprotein-IgM immune complexes on the diagnosis of primary hepatocellular carcinoma. J Clin Lab Anal 2009;23:213-8.

7. Erden G, Barazi AO, Tezcan G, Yildirimkaya MM. Biological variation and reference change values of CA 19-9, CEA, AFP in serum of healthy individuals. Scand J Clin Lab Invest 2008;68:212-8.

8. Plebani M, Giacomini A, Beghi L, de Paoli M, Roveroni G, Galeotti F, et al. Serum tumor markers in monitoring patients: interpretation of results using analytical and biological variation. Anticancer Res 1996;16:2249-52.

9. Thomas L. Clinical Laboratory Diagnostics. Xth ed. Frankfurt/Main: TH-Books Verkagsgesellschaft mbH; 1998; p. 936-94;1404-5.

10. Westgard QC: The comparison of method experiment. Availlable at: http://www.westgard.com/lesson23.htm. Acessed: May 5th 2009.

11. Pilo  A, Zuccheli GC, Cohen R, Chiesa MR, Bizollon CA. Performance of immunoassays for CA19-9, CA 15-3 and CA 125 tumor markers evaluated from an international quality assessment survey. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1996;34:145-50.

12. Stern P, Friedecky B, Bartos V, Bezdickova D, Vavrova J, Uhrova J, et al. Comparison of different immunoassays for CA 19-9. Clin Chem Lab Med 2001;39:1278-82.

13. Basuyau JP, Leroy M, Brunelle P. Determination of Tumor Markers in Serum. Pitfalls and Good Practice. Clin Chem Lab Med 2001;39:1227-33.

14. Uhl W, Chan DW, Jones K, Kelley C, Assmann G, von Eckardstein A, et al. Elecsys CEA, PSA and AFP. Clinical results of a multicentre evaluation. Wien Klin Wochenschr. 1998;110:51-61.

15. Birk B, Henne V, Hipp B, Meyer A. Cobas Core CA 19-9 II EIA: new CA 19-9 enzyme immunoassay with high correlation to radioimmunoassays. Anticancer Res 1997;17:2911-4.

16. Mader RM, Steger GG, Braun J, Rainer H. Comparison of an immunoradiometric and an immunoluminometric assay for the evaluation of the tumour associated antigens CA 19-9 and CA 125. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1994;32:85-90.