Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Original professional article

 

Andrea Čipak1*, Patrik Stanić1, Koraljka Đurić2, Tihana Serdar3, Ernest Suchanek4. Analiza građe spermija prema kriterijima SZO i striktnim kriterijima: usporedba dviju metoda i unutarlaboratorijska varijabilnost. Biochemia Medica 2009;19(1):87-94.
 
1Klinika za ženske bolesti i porode, Klinički bolnički centar “Zagreb”, Zagreb
2Medicinsko biokemijski laboratorij, Poliklinika “Sunce”, Zagreb
3Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinička bolnica Dubrava, Zagreb
4Fertility Clinic, Tawam Hospital, Johns Hopkins Medicine, Al Ain, Abu Dhabi, U.A.E.
Corresponding author*: andrea [dot] cipak [at] gmail [dot] com
 
Sažetak
 
Uvod: Analiza građe spermija jedan je od najvažnijih koraka u procjeni muškog partnera kod neplodnih parova. Međutim, značajne međulaboratorijske i unutarlaboratorijske varijacije mogu uzrokovati poteškoće u tumačenju rezultata, pogrešne dijagnoze te mogu dovesti do zabuna. Stoga je neophodno ove varijacije svesti na najmanju moguću mjeru kako bi se uklonile posljedične greške i osigurala međulaboratorijska i unutarlaboratorijska ponovljivost.
Materijali i metode: Uzorci sjemena dobiveni su od 49 uzastopnih muškaraca koji su dolazili u androloški laboratorij radi procjene plodnosti. Usporedili smo dva kriterija za analizu građe spermija: 1) razmaz sjemena pripremljen pomoću boje Giemsa koji smo analizirali prema kriterijima Svjetske zdravstvene organizacije (SZO) i 2) razmaz sjemena pripremljen bojom Spermac koji smo analizirali prema striktnim kriterijima. Također smo proveli i unutarlaboratorijsku usporedbu analize građe spermija.
Rezultati: Dijagnosticiranje teratozoospermije prema kriterijima SZO i prema striktnim kriterijima bilo je podudarno kod 45 od 49 ispitanika. Mjera sukladnosti među promatranjima bila je slična i kod kriterija SZO i kod striktnih kriterija (kapa = 0,700 za SZO kriterij; kapa = 0,715 za striktni kriterij).
Zaključci: Analize građe spermija prema kriterijima SZO i striktnim kriterijima podudaraju se u postavljanju dijagnoze teratozoospermije i može se postići dobra razina sukladnosti među promatračima nakon odgovarajućeg osposobljavanja, pažljivog pregleda razmaza i poštivanja klasifikacijskih sustava.
Ključne riječi: spermiji; neplodnost; muškarac; razlike među ispitivačima
 
Pristiglo: 23. listopada 2008.                                                                                                 Prihvaćeno: 8. prosinca 2008.
 
Uvod
 
Analiza građe spermija, sastavnica analize sjemena, jedan je od najvažnijih koraka u procjeni muškog partnera kod neplodnih parova. Svjetska zdravstvena organizacija (SZO) dosada je objavila nekoliko priručnika s ciljem standardizacije postupaka analize sjemena te su kriteriji SZO postali najšire prihvaćeni u pretragama građe spermija u androloškim laboratorijima diljem svijeta (1,2). Nadalje, Menkveld i sur. su 1990. godine pokazali da analiza građe spermija prema strožim kriterijima, takozvanim Tygerbergovim ili striktnim kriterijima, povećava objektivnost i smanjuje unutarlaboratorijsku varijabilnost (3). Međutim, zbog različitih klasifikacijskih sustava, značajne među- i unutarlaboratorijske varijacije i dalje su prisutne zbog mnoštva čimbenika, kao što su tehnike pripreme razmaza, tumačenje rezultata i iskustvo laboratorijskih tehničara (4). Takve varijacije mogu uzrokovati poteškoće kod tumačenja rezultata, pogrešnu dijagnozu te naposljetku dovesti do zabuna. Stoga ih je neophodno svesti na najmanju moguću mjeru, radi uklanjanja posljedičnih pogrešaka i osiguranja unutar- i međulaboratorijske ponovljivosti.
Cilj ovoga istraživanja bio je usporediti dva kriterija analize građe spermija: 1) razmaz sjemena pripremljen pomoću boje Giemsa i analiziran prema kriterijima SZO te 2) razmaz sjemena pripremljen pomoću boje Spermac i analiziran prema striktnim kriterijima. Također smo željeli provesti unutarlaboratorijsku usporedbu analize građe spermija. Prema našim saznanjima, ovo je prvo takvo izvješće usporedbe metoda i unutarlaboratorijskih varijacija provedeno u Hrvatskoj.
 
Materijali i metode
Ispitanici
Uzorci sjemena dobiveni su od 49 uzastopnih muškaraca uključenih u istraživanje, životne dobi između 18 i 50 godina. Ispitanici su dolazili u Androloški laboratorij Klinike za ženske bolesti i porode, Kliničkog bolničkog centra „Zagreb“ u Zagrebu, radi procjene plodnosti, u razdoblju od svibnja do srpnja 2007. Svi su sudionici prije analize najmanje 2 dana apstinirali od spolnih odnosa, odnosno ejakulacije.
Kriteriji
Prema kriterijima SZO (1) normozoospermija definira ejakulat s koncentracijom spermija većom od 20 x 106 spermija/mL, progresivne pokretljivosti spermija > 50% ili barem 25% spermija s linearno progresivnom pokretljivošću i ≥ 30% spermija s normalnom građom. Međutim, ovi se kriteriji mogu koristiti samo kada se analiza sjemena izvodi na 37 °C. Temperatura jako utječe na pokretljivost spermija te bi se ona uvijek trebala analizirati pri kontroliranim temperaturnim uvjetima (5). Budući da se analiza pokretljivosti spermija u Androloškom laboratoriju Klinike za ženske bolesti i porode izvodila na sobnoj temperaturi (22 °C), morali smo prilagoditi kriterije pokretljivosti spermija. Prema tim prilagođenim kriterijima, astenozoospermija je prisutna ukoliko je nađeno < 40% spermija s progresivnom pokretljivošću u uzorku sjemena (5). Teratozoospermija dijagnosticira ejakulat s < 30% normalno građenih spermija prema kriterijima SZO ili < 15% prema striktnim kriterijima. Oligozoospermija definira ejakulat s koncentracijom spermija < 20 x 106 spermija/mL. Naposljetku, oligoastenozoospermija dijagnosticira ejakulat sa smanjenom koncentracijom i pokretljivošću spermija.
Analiza pokretljivosti i koncentracije spermija
Pokretljivost i koncentracija spermija određivana je upotrebom Autosperm, Amsaten Corp. (De Pinte, Belgija) sustava za analizu ejakulata. Nakon likvefakcije 10 μL sjemena je pipetirano na predmetno stakalce i pokriveno pokrovnicom (veličina 22 x 22 mm). Analiza se izvodila na sobnoj temperaturi pri povećanju od 500 puta. Pokretljivost je izražena kao postotak pokretnih spermija:
a) spermiji s linearnom i progresivnom pokretljivošću (linearna brzina ≥ 22 μm/s);
b) spermiji sa sporom linearnom ili nelinearnom pokretljivošću (linearna brzina < 22 μm/s i brzina ≥ 5 μm/s);
c) na mjestu pokretni spermiji; i
d) nepokretni spermiji.
Analiza građe spermija prema kriterijima SZO
Nakon likvefakcije, napravio se razmaz od 10 µL sjemena na predmetnom stakalcu i ostavio na sobnoj temperaturi da se osuši. Razmazi su tada obojani bojom Giemsa i građa spermija je određivana prema kriterijima SZO (1). Dva su različita promatrača prebrojala 200 stanica po razmazu, koristeći svjetlosnu mikroskopiju pri povećanju od 1000 puta i uljnu imerziju. Prema kriterijima SZO normalno građen spermij ima glavu ovalnog oblika i akrosom koji pokriva 40–70% područja glave. Normalni spermij nema nepravilnosti u vratu, srednjem dijelu i repu, niti ostatna tjelešca veća od 50% veličine glave.
Kvantifikacija leukocita i stanica spermatogenske loze
Leukociti i stanice spermatogenetske loze (okrugle spermatide, spermatociti i spermatogonije) analizirani su bojanjem predmetnih stakalaca bojom Giemsa i kvantificirani Autosperm, Amsaten Corp. (De Pinte, Belgija) sustavom za analizu ejakulata.
Analiza građe spermija prema striktnim kriterijima
Nakon likvefakcije, a prije bojanja alikvot sjemena ispran je sredstvom Quinn’s Sperm Washing Medium, SAGE (SAD) i centrifugiran 10 minuta na 300 g. Odvojen je supernatant, a talogu je dodano 0,5 mL Quinn sredstva za ispiranje spermija. Napravljen je razmaz od 10 µL ispranog sjemena na predmetnom stakalcu koji se zatim fiksirao i sušio na zraku. Razmazi su tada isprani destiliranom vodom i obojani bojom Spermac, FertiPro (Beernem, Belgija). Nakon bojanja razmazi su isprani destiliranom vodom. Dva su različita promatrača brojala 200 stanica po razmazu koristeći se mikroskopom s povećanjem od 1000 puta i uljnom imerzijom. Za procjenu građe korišteni su striktni kriteriji prema kojima je spermij normalno građen ako ima ovalnu glavu duljine 4,0–5,0 µm i širine 2,5–3,5 µm, što se mjerilo okularnim mikrometrom. Omjer duljine prema širini trebao bi iznositi 1,50–1,75. Normalni spermij ima dobro izražen akrosom, koji pokriva 40–70% glave. Srednji dio je tanak, tanji od 1 µm, i otprilike 1,5 puta dulji od glave. Ostatna tjelešca, ukoliko su prisutna, ne bi trebala biti veća od polovine širine glave. Rep je tanak, uniforman, nesavijen i otprilike 45 µm dugačak. Prema ovom klasifikacijskom sustavu svi se granični oblici smatraju nepravilnima (3).
Indeks teratozoospermije
Indeks teratozoospermije (engl. teratozoospermia index, TZI) definira se kao broj anomalija po nepravilnom spermiju. Svi spermiji nepravilnog oblika mogu imati jednu do četiri nepravilnosti, uključujući anomalije glave, vrata/srednjeg dijela i repa ili prisutnost ostatnih tjelešaca (1). Klasifikacija spermija za TZI izvodi se na laboratorijskom brojaču. Spermiji se klasificiraju kao normalni i abnormalni te se svrstavaju u specifične skupine (nepravilnosti glave, vrata/srednjeg dijela i repa ili skupina ostatnih tjelešaca). Ukupne vrijednosti pronađenih nepravilnosti se tada zbroje i podijele s brojem nepravilnih spermija.
Test vitalnosti pomoću eozina
Vitalnost se utvrđivala bojenjem razmaza pomoću eozina (1). Vitalni spermiji imaju intaktnu staničnu membranu, ne boje se te ostaju bijeli u razmazu, dok eozin prodire kroz oštećenu staničnu membranu spermija koji nisu vitalni. Razmazi su ostavljeni da se osuše na zraku, a procjena je izvršena brojanjem crveno obojanih i neobojanih spermija pomoću svjetlosne mikroskopije kod povećanja od 400 puta. Izbrojeno je najmanje 100 stanica. Rezultati su prikazani kao postotak eozin negativnih (neobojanih) spermija.
Statistička analiza
Rezultati su opisani aritmetičkom sredinom i standardnom devijacijom. Sve je uzorke sjemena analizirao jedan ocjenjivač. Razlike između parametara sjemena analiziranih prema kiterijima SZO i prema striktnim kriterijima ispitane su t-testom. Razlike u parametrima sjemena među različitim skupinama (normozoospermija, astenozoospermija, oligozoospermija i oligoastenozoospermija) analizirane su jednosmjernom analizom varijance ANOVA. Ocijenjena je i mjera usklađenosti promatrača za oba kriterija analize građe spermija te izračunata njena vrijednost, kapa. Rezultati su analizirani programom SSPS, SPSS Inc. (Chicago, SAD).
 
Rezultati
 
U Tablici 1. prikazana su svojstva sjemena, zajedno s dobi ispitanika i vremenom apstinencije. Ispitanici su raspoređeni u četiri skupine: skupina s dijagnozom normozoospermije, astenozoospermije, oligozoospermije i oligoastenozoospermije. Nije nađena statistički značajna razlika u dobi i duljini apstinencije između te četiri skupine. Međutim, nađena je statistički značajna razlika između skupina u koncentraciji spermija, ukupnom broju spermija, njihovoj pokretljivosti i vitalnosti (P < 0,001 za svaki od parametara). Također su se volumen sjemena te broj stanica spermatogenetske loze u sjemenu statistički značajno razlikovali između skupina (P = 0,029 i 0,024).
 
Tablica 1. Ispitanici i svojstva sjemena
 
 
Rezultati analize građe spermija i TZI prikazani su u Tablici 2. Spermiji normalne građe bili su prisutni kod 18 od 49 muškaraca prema kriterijima SZO i kod 16 od 49 prema striktnim kriterijima. Kriteriji SZO i striktni kriteriji su bili podudarni u 45 od 49 slučajeva u dijagnosticiranju teratozoospermije.
 
Tablica 2. Rezultati analize građe spermija
 
 
U ispitanika s normozoospermijom, astenozoospermijom i oligoastenozoospermijom nađeno je statistički značajno više nepravilnosti glave spermija (P = 0,001, 0,020 i 0,031), kada je građa spermija određivana prema kriterijima SZO u odnosu prema striktnim kriterijima. U skupini s oligoastenozoospermijom nađeno je statistički značajno više nepravilnosti u području vrata i srednjeg dijela spermija (P = 0,005) dok je u skupinama s normozoospermijom i astenozoospermijom nađeno statistički značajno više nepravilnosti repa spermija (P = 0,002 i 0,005) kada je građa spermija određivana prema striktnim kriterijima u odnosu prema kriterijima SZO. TZI je bio statistički značajno viši (P = 0,040) u skupini s normozoospermijom kada se građa spermija određivala prema striktnim kriterijima u odnosu prema standardima SZO.
Primijetili smo visok stupanj podudaranja između promatrača kod oba kriterija za analizu građe spermija. Mjera sukladnosti bila je slična kod kriterija SZO i striktnih kriterija (kapa = 0,700 za SZO prema 0,715 za striktne kriterije).
 
Rasprava
 
Ključni rezultat ovoga istraživanja bio je da je usporedba analize građe spermija prema kriterijima SZO i striktnim kriterijima pokazala maksimalnu podudarnost u dijagnosticiranju teratozoospermije. Također, unutarlaboratorijska usporedba je pokazala dobru mjeru sukladnosti za oba kriterija procjene građe spermija.
Mnogi su autori istraživali utjecaj tehnika pripreme i kriterija procjene na objektivnost analize građe spermija i unutarlaboratorijsku varijabilnost. Međutim, zbog različito ustrojenih istraživanja nije jednostavno usporediti rezultate dosada objavljene u literaturi. Godine 1993. Meschede i sur. su istraživali utjecaj triju različitih tehnika pripreme razmaza: Papanicolau, Shorr bojanje i protokol „wet preparations“ na rezultate analize građe spermija (6). To je istraživanje pokazalo vrlo slabu povezanost između tehnika i stoga su preporučili da se u jednom laboratoriju upotrebljava samo jedna metoda kako bi se osigurala usporedivost laboratorija. Međutim, drugi su istraživači (7,8) pronašli dobru povezanost između metoda bojanja koje su rabili u svojim istraživanjima. Ova nepodudarnost objavljenih rezultata mogla bi biti posljedicom značajnih poboljšanja koja su postignuta u standardizaciji analize građe spermija kao i poboljšanja u kontroli kvalitete analize sjemena postignutih tijekom posljednjih 15 godina. Rezultati našega istraživanja sukladni su nedavno objavljenim radovima te dokazuju da se prihvatljivo podudaranje može postići kada se klasifikacijski sustavi prilagode tehnikama bojanja.
Bojanje bojom Giemsa koje se rutinski rabi u našem laboratoriju dalo je povećan broj nepravilnosti glave spermija kod skupina s normozoospermijom, astenozoospermijom i oligoastenozoospermijom kada se građa spermija određivala prema kriterijima SZO, u odnosu prema striktnim kriterijima. To bi moglo biti zbog obojenosti pozadine neispranih uzoraka i slične obojenosti različitih dijelova spermija. S druge strane, kada su uzorci bili obojani bojom Spermac, različiti dijelovi spermija su bili različito obojani, što je rezultiralo boljim vizualnim zapažanjem svih nepravilnosti spermija.
Nadalje, metoda pripreme može značajno utjecati i na TZI (6). Međutim, u našem istraživanju metoda pripreme nije utjecala na TZI. Kako je navedeno, usporedba analize građe spermija prema oba kriterija bila je podudarna u dijagnosticiranju teratozoospermije, dok je najveća nepodudarnost pri određivanju TZI bila kod skupine s normozoospermijom.
Što se naših rezultata tiče, unutarlaboratorijska usporedba otkrila je dobar stupanj mjere sukladnosti između dvoje promatrača u našem laboratoriju. Međutim, u jednom istraživanju provedenom na 54 uzoraka sjemena 8 plodnih muškaraca i 46 muškaraca smanjene plodnosti u kojem su se rabili likveficirani i oprani uzorci obojeni bojama Diff-Quik i Papanicolau primijećen je visok stupanj mjere sukladnosti između dvoje promatrača (međupromatračka varijabilnost za likveficiran i opran uzorak iznosila je 0,82 za Diff-Quick i 0,93 za Papanicolau) (9). Od to dvoje promatrača jedan je bio iskusan znanstvenik s više od 5 godina iskustva, dok je drugi bio znanstvenik s manje od dvije godine iskustva. Praktično iskustvo i poštivanje preporučenih metodologija od ključnog su značenja u dijagnosticiranju teratozoospermije i mogu imati velik utjecaj na rezultate analize građe spermija (10). Jedan od naših promatrača se tek nedavno upoznao s analizom građe spermija. To bi mogao biti razlog nešto nižeg stupnja mjere sukladnosti. No bez obzira na to, ovaj nam slučaj pruža dobar primjer kako se nakon odgovarajućeg osposobljavanja, pažljive pripreme razmaza i poštivanja klasifikacijskih sustava mogu postići rezultati slični onima iskusnog promatrača. Mnogi su autori (3,4,10,13) proveli usporedbe rezultata između više promatrača/jednog promatrača i/ili međulaboratorijske/unutarlaboratorijske usporedbe. Nažalost, prilično je komplicirano uspoređivati njihove rezultate zbog velikih razlika u ustrojstvima istraživanja i mjerama varijabilnosti.
Temeljem naših rezultata možemo zaključiti da su analize građe spermija prema kriterijima SZO i striktnim kriterijima podudarne u postavljanju dijagnoze teratozoospermije, bez obzira na primijenjene kriterije, i da se dobra mjera sukladnosti može postići ako se prije procjene građe uzmu u obzir sve neophodne mjere predostrožnosti dobre laboratorijske prakse.
Građa spermija prihvaćena je kao parametar sjemena koji najviše korelira sa sposobnošću oplodnje in vivo (11) i in vitro (12). Međutim, u tijeku je rasprava o pouzdanosti rezultata analize sjemena (13). To tek ukazuje na potrebu za standardizacijom i kontinuiranim praćenjem kvalitete. Nadamo se da će ovo istraživanje potaknuti ostale androloške laboratorije u Hrvatskoj na analizu svoje mjere usklađenosti. To bi mogla biti dobra inicijativa za standardizaciju analize građe spermija na razini Republike Hrvatske.
 
Zahvala
 
Ovo je istraživanje provedeno uz potporu Ministarstva znanosti, obrazovanja i športa Republike Hrvatske. Broj projekta: 108-1080399-0384.
 
Literatura/References
 
 1.   World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Semen-Cervical Mucus Interaction. 3rd edition. Cambridge: Cambridge University Press; 1992.
 2.   World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Semen-Cervical Mucus Interaction. 4th edition. Cambridge: Cambridge University Press; 1999.
 3.   Menkveld R, Stander FSH, Kotze TJVW, Kruger TF, van Zyl JA. The evaluation of morphological characteristics of human spermatozoa according to stricter criteria. Hum Reprod 1990;5:586-92.
 4.   Coetzee K, Kruger TF, Lombard CJ, Shaughnessy D, Oehringer S, Özgür K, et al. Assessment of interlaboratory and intralaboratory sperm morphology readings with the use of a Hamilton Thorne Research integrated visual optical system semen analyzer. Fertil Steril 1999;71:80-4.
 5.   Jeyendran RS. Protocols for Semen Analysis in Clinical Diagnosis. London: Parthenon Publishing Group; 2003. pp. 31-32.
 6.   Meschede D, Keck C, Zander M, Cooper TG, Yeung CH, Nieschlag E. Influence of three different preparation techniques on the results of human sperm morphology analysis. Int J Androl 1993;16:362-9.
 7.   Menkveld R, Lacquet FA, Kruger TF, Lombard CJ, Sanchez Sarmiento CA, de Villiers A. Effects of different staining and washing procedures on the results of human sperm morphology evaluation by manual and computerised methods. Andrologia 1997;29:1-7.
 8.   Henkel R, Schreiber G, Sturmhoefel A, Hipler UC, Zermann DH, Menkveld R. Comparison of three staining methods for the morphological evaluation of human spermatozoa. Fertil Steril 2008;89:449-55.
 9.   Barroso G, Mercan R, Ozgur K, Morshedi M, Kolm P, Coetzee K, et al. Intra- and inter-laboratory variability in the assessment of sperm morphology by strict criteria: impact of semen preparation, staining techniques and manual versus computerized analysis. Hum Reprod 1999;14:2036-40.
10.   Eustache F, Auger J. Inter-individual variability in the morphological assessment of human sperm: effect of the level of experience and the use of standard methods. Hum Reprod 2003;18:1018-22.
11.   Guzick DS, Overstreet JW, Factor-Litvak P, Brazil CK, Nakajima ST, Coutifaris C, et al. Sperm morphology, motility and concentration in fertile and infertile men. N Engl J Med 2001;345:1388-93.
12.   Kruger TF, Acosta AA, Simmons KF, Swanson RJ, Matta JF, Oehringer S. Predictive value of abnormal sperm morphology in in vitro fertilization. Fertil Steril 1988;49:112-7.
13.   Brooks AK. How reliable are results from the semen analysis? Fertil Steril 2004;82:41-4.