Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

 Pregledni članak

 

Andrea Tešija-Kuna, Marijana Žirović. Antitijela na citrulinirane proteine/peptide u reumatoidnom artritisu: što smo dosad naučili? Biochemia Medica 2008;18(3):275-90.
Klinički zavod za kemiju, Klinička bolnica “Sestre milosrdnice”, Zagreb
 *Adresa za dopisivanje: andrea [dot] kuna [at] gmail [dot] com
 
Sažetak
Reumatoidni artritis (RA) najčešća je upalna sistemska autoimuna bolest s progresivnim propadanjem zglobova, ali i višestrukim organskim oštećenjem koje rezultira smanjenjem kvalitete života i povećanjem smrtnosti. Iako je etiologija RA još uvijek nerazjašnjena, značajan napredak postignut je u razumijevanju patofiziologije, što je s jedne strane dovelo do identifikacije novih terapijskih ciljeva, a s druge do otkrića antigena koje prepoznaju antitijela specifična za RA. Glavna odrednica ciljnih antigena je citrulin pa se čini da je posttranslacijska enzimska citrulinacija proteina u sinovijalnom tkivu ključna karika autoimunog procesa u RA. Ubikvitarnost citruliniranih proteina u fiziološkim i patološkim stanjima govori u prilog tome da autoimuni odgovor specifičan za RA pokreće interakcija procesa citruliniranja i još nedefiniranih genetskih čimbenika te čimbenika okoliša.
Ovaj rad daje pregled dosadašnjih saznanja o mehanizmu autoimune reakcije usmjerene na citrulinirane proteine, kao i o kliničkom značenju određivanja ovih antitijela u RA.
Ključne riječi: reumatoidni artritis, citrulinacija, peptidilarginin deiminaza, anti-CCP antitijela, anti-MCV antitijela
Pristiglo: 23. lipnja 2008.                                                                                                      Prihvaćeno: 3. rujna 2008.
 
 
Uvod
Reumatoidni artritis (RA) s učestalošću od 0,5% do 1% u općoj populaciji najčešća je sistemska autoimuna bolest. Obilježena kroničnom upalom s posljedičnim ireverzibilnim oštećenjem zglobova, ali i drugih organskih sustava, ova bolest značajno utječe na kvalitetu života i time predstavlja nezanemarivi socioekonomski problem. S obzirom na nedavnu spoznaju da ireverzibilna oštećenja zglobova nastaju tijekom prve dvije godine od pojave simptoma, moderni terapijski pristup RA pretpostavlja primjenu agresivne antireumatske terapije već u prvim mjesecima bolesti. Zbog potencijalno toksičnih lijekova koji mogu izazvati vrlo opasne nuspojave neophodan je visokospecifičan biljeg koji bi identificirao bolesnike s RA prije pojave zglobnih oštećenja, a u kojih bi korist od primjene takve terapije nadvladala potencijalne rizike. Kriteriji Američkog reumatološkog društva (engl. American Rheumatism Association, ARA) za dijagnozu RA (1) koji se, uz iznimku reumatoidnog faktora (RF), prvenstveno zasnivaju na kliničkim pokazateljima, nedovoljno su osjetljivi upravo u toj kritičnoj, ranoj fazi bolesti. Godine nakon otkrića biljega RF, koji je pokazao prihvatljivu osjetljivost, ali nedovoljnu specifičnost za RA, obilježila su nastojanja za identifikacijom drugih, specifičnijih antitijela. Većina opisanih antitijela nisu pokazala dijagnostičku superiornost u odnosu na RF, sve do nedavnog otkrića obitelji antitijela usmjerenih na citrulinirane epitope na peptidima/proteinima (ACPA) koja su se pokazala specifičnim dijagnostičkim, ali i prognostičkim biljegom RA.
 
Citrulinacija – ključni proces u autoimunom odgovoru u RA
Danas je poznato da su antitijela iz obitelji ACPA odavno identificirana u serumu bolesnika s RA, ali nedovoljno poznavanje strukture antigenskih determinanata rezultiralo je testovima nezadovoljavajućih dijagnostičkih značajka. Tako povijest ACPA datira još od 1964. godine kada su Nienhuis i Mandema (2) metodom indirektne imunofluorescencije (IIF) otkrili antitijela u serumu bolesnika s RA koja se vežu na komponente keratohijalinih granula koje okružuju jezgru humanih epitelnih stanica sluznice usne šupljine, dajući znakovitu perinuklearnu fluorescenciju. S obzirom na tip fluorescencije, ova antitijela dobila su naziv antiperinuklearni faktor (APF). Prema rezultatima ispitivanja koja su uslijedila nakon ovoga otkrića, antitijela APF prisutna su u 49–91% bolesnika s RA sa specifičnošću od 73–99% (3). Međutim, unatoč visokoj specifičnosti, određivanje ovih antitijela nije zaživjelo u rutini iz dva razloga. Prvi je ograničena dostupnost odgovarajućeg supstrata, jer se u svega oko 5% davatelja mogu naći epitelne stanice dovoljno diferencirane da sadrže perinuklearni faktor. Drugi razlog su negativne osobine metode IIF, kao što su nestandardiziranost i iskustvo neophodno za pravilnu interpretaciju.
Godine 1979. Young i sur (4) su metodom IIF identificirali antitijela čiji se ciljni antigen nalazi u filamentima rožnatog sloja epitela štakorskog jednjaka. Pretpostavljajući da je ciljni antigen keratin, ova antitijela su nazvali antikeratinska antitijela (AKA). Osjetljivost AKA za RA kreće se od 36% do 59%, a specifičnost od 88% do 99% (3). Autoimuno podrijetlo ovih antitijela dokazano je njihovim vezanjem i za tada još nepoznatu sastavnicu u rožnatom sloju humanog epidermisa. Nekoliko argumenata podupiralo je hipotezu da su antitijela AKA i APF iz iste obitelji: 1) ciljni antigen za oba antitijela eksprimiran je u epitelu istog histološkog tipa (epitel štakorskog jednjaka, humani epidermis, kao i epitel sluznice usne šupljine spadaju u skvamozni epitel sa sličnim putovima završne diferencijacije), 2) njihova prisutnost i titar koreliraju međusobno, s RF te s težinom i aktivnosti bolesti, 3) i jedno i drugo antitijelo su uglavnom izotipa IgG, 4) oba su visoko specifična za RA, 5) njihova učestalost neovisna je o spolu i dobi, 6) oba antitijela su prisutna u ranoj fazi bolesti i mogu prethoditi pojavi simptoma. Godine 1993. Simon i sur. (5) identificirali su protein veličine 40 kDa ekstrahiran iz humanog epidermisa i specifično obilježen serumom bolesnika s RA na Western blotu, kao kiselo/neutralnu izoformu filagrina. Dvije godine kasnije, Sebbag i sur. (6) su utvrdili da je frakcija IgG, pročišćena iz seruma bolesnika s RA imunoadsorpcijom upotrebom spomenutog 40 kDa proteina, reaktivna i u testu AKA i u testu APF te time potvrdili da ova antitijela prepoznaju isti antigen. Identificirani ciljni antigen bio je, dakle, filagrin, protein koji sudjeluje u agregaciji citokeratinskih filamenata tijekom orožnjavanja epidermisa. Ovim otkrićem uveden je novi naziv za obitelj antitijela koja uključuje AKA i APF, antifilagrinska antitijela (AFA). Filagrin se sintetizira u stratumu granulosumu kao fosforilirani prekursor, profilagrin (200–400 kDa), koji se nakuplja u citoplazmatskim organelama specifičnim za keratinocite, keratohijalinim granulama. Tijekom završne diferencijacije epidermnih keratinocita molekule profilagrina se defosforiliraju i proteolitički cijepaju u funkcionalne filagrinske jedinice. Kako filagrin sadrži 10–12% bazične aminokiseline histidina, postavilo se pitanje podrijetla kisele, odnosno neutralne izoforme filagrina koju prepoznaju AFA. Bazične molekule filagrina, oslobođene proteolizom prekursora profilagrina, posttranslacijski se modificiraju enzimom peptidilarginin deiminazom (PAD), pri čemu se 20% argininskih ostataka deiminira (ovisno o Ca++ ionima) u aminokiselinu citrulin (Slika 1).
 
 
 
Slika 1. Deiminacija peptidilarginina u peptidilcitrulin djelovanjem peptidilarginin deiminaze (PAD), ovisno o Ca++ ionima.
 
Postupkom citruliniranja od bazične nastaje neutralna, odnosno kisela izoforma filagrina koja ima manji afinitet za citokeratinske filamente. Godine 1998. Schellekens i sur. (7) uspješno su identificirali citrulin kao glavnu antigensku odrednicu upotrebom citruliniranih peptida sintetiziranih prema karboksi-terminalnom kraju molekule profilagrina. Samo godinu dana kasnije ovo otkriće potvrdili su Girbal-Neuhauser i sur. (8) pokazavši da antitijela specifična za RA prepoznaju rekombinantne filagrinske fragmente nakon enzimatske deiminacije in vitro.
 
Citrulinirani proteini u reumatoidnom sinovijalnom tkivu
Kako je ekspresija (pro)filagrina ograničena isključivo na skvamozni epitel i ne nalazi se u sinovijalnom tkivu, pretpostavlja se da deiminacija različitih proteina u upaljenom sinovijalnom tkivu aktivira imunu reakciju, a citrulinirani (pro)filagrin je samo križno-reaktivni supstrat (9). U prilog ovoj hipotezi govori nalaz Masson-Bessierea i sur. (10) koji su otkrili 7,5 puta veći udio AFA u ukupnoj koncentraciji IgG u ekstraktu reumatoidnog sinovijalnog tkiva u odnosu na pripadajući serum. Ovaj nalaz upućuje na zaključak da su u sinovijalnom tkivu bolesnika s RA prisutne AFA-secernirajuće plazma stanice, a lokalno izlučena antitijela potom difundiraju u cirkulaciju. Isti autori sugeriraju deiminirane oblike α- i β-lanaca fibrina koji se odlažu u reumatoidnoj sinovijalnoj membrani kao glavne ciljne antigene za AFA (11). Međutim, nedavno istraživanje pokazalo je da prisutnost citruliniranog fibrina nije specifična za reumatoidno sinovijalno tkivo, nego se nalazi i u upaljenom sinovijalnom tkivu spondiloartropatija (psorijatični artritis, ankilozni spondilitis, reaktivni artritis) i osteoartritisa. Deiminacija fibrina, dakle, predstavlja nespecifičan fenomen vezan za sinovitis, koji nužno ne inducira autoimuni odgovor sa stvaranjem antitijela AFA (12). Među ostalim citruliniranim sinovijalnim proteinima identificirani su humani kolagen tipa I. (13), vimentin (14) i fibronektin (15). Nadalje, Kinloch i sur. (16) su dokazali reaktivnost 46% seruma RA s in vitro citruliniranom α-enolazom iz lizata promijelocitne stanične linije koja se diferencira u stanice monocitnog i granulocitnog fenotipa kakve prevladavaju u upaljenom sinovijalnom tkivu. Iako je prisutnost -enolaze dokazana u sinovijalnom tkivu, nije potvrđena njena in vivo citrulinacija. Imajući na umu da je za vezanje AFA kritičan citrulin vezan za neutralne aminokiseline kao što su glicin, serin ili treonin, Pratesi i sur. (17) ispitali su hipotezu može li deiminacija Epstein-Barrovog nuklearnog antigena 1 (EBNA-1) koji sadrži 6 ponavljajućih arginin-glicin sekvenca, a često se povezuje s RA, stvoriti epitope koje prepoznaju AFA. Antitijela specifična za ovu sekvencu EBNA-1 otkrivena su u 50% seruma RA i u < 5% seruma kontrolnih ispitanika, ali nije još dokazana prisutnost deiminiranog EBNA-1 u reumatoidnom sinovijalnom tkivu. Konačno, iako prisutnost citruliniranih histona u upaljenom sinovijalnom tkivu nije dokazana, ovi proteini čine se nezanemarivim potencijalnim antigenima s obzirom na to da je njihova citrulinacija opisana ex vivo tijekom apoptoze granulocita (18). U upaljenom sinovijalnom tkivu prisutan je velik broj granulocita čiji je životni vijek oko 3 dana pa će i velik broj odjednom biti podvrgnut apoptozi. Pri tome dolazi do citruliniranja histona koji mogu potaknuti lokalni imuni odgovor.
Ako se deiminacija proteina događa lokalno, u sinovijalnom tkivu, mora biti prisutan i enzim PAD. Ovaj enzim je ubikvitaran u tkivima sisavaca i do danas je identificirano 5 izoforma s tkivno-specifičnom ekspresijom. PAD2 i PAD4 su, između ostalih tkiva, eksprimirani i u hematopoetskim stanicama (19) i stoga su od posebnog interesa, jer ove stanice infiltriraju upaljeno reumatoidno sinovijalno tkivo. Chapuy-Regaud i sur. (20) dokazali su ekspresiju ove dvije izoforme u sinovijalnoj membrani bolesnika s RA.
 
Mehanizam RA-specifičnog imunog odgovora na citrulinirane antigene
Izoforme enzima PAD prisutne su u raznim tkivima pa je tako proces citrulinacije dio normalnih fizioloških procesa, kao što je već opisana završna diferencijacija epidermnih keratinocita ili diferencijacija mijelinske ovojnice tijekom razvoja središnjeg živčanog sustava (21). Osim u reumatoidnom sinovijalnom tkivu, ekspresija citruliniranih proteina otkrivena je i u sinovijalnom tkivu bolesnika s osteoartritisom, reaktivnim artritisom i drugim artropatijama (22). Nadalje, citrulinirani proteini otkriveni su u neurodegenerativnim bolestima kao što su Alzheimerova bolest (23) i multipla skleroza (24), ali i u mišićima bolesnika s polimiozitisom, crijevu oboljelih od ulceroznog kolitisa i Crohnove bolesti te kronično upaljenim tonzilama (25). Čini se da je poveznica procesa citrulinacije i navedenih bolesti upala. Međutim, u navedenim slučajevima prisutnost citruliniranih antigena nije povezana s istodobnom prisutnošću autoantitijela, što znači da citrulinirani proteini, čak ni u upalnom okolišu, nisu dostatni za aktivaciju specifične imune reakcije. Kako onda objasniti prisutnost ovih visoko specifičnih autoantitijela u RA? Tri su predložena mehanizma koji bi mogli biti uključeni u RA-specifičan imuni odgovor na ubikvitarne antigene kao što su citrulinirani proteini: 1) poznato je da imuni odgovor ne određuje samo prisutnost, nego i količina prisutnog antigena, što bi značilo da u reumatoidnom sinovijumu dolazi do pretjerane ekspresije citruliniranih antigena, 2) nenormalan humoralni imuni odgovor na uobičajeno prisutne citrulinirane proteine u upaljenom tkivu, 3) prisutnost RA-specifičnih citruliniranih epitopa specifičnih za RA (26). Čini se da bi određeni genetski čimbenici mogli biti odgovorni za prva dva mehanizma. Suzuki i sur. (27) otkrili su povezanost polimorfizama gena PADI4 koji kodira enzim PAD4 i RA u japanskoj populaciji. Pokazalo se da ovi polimorfizmi dovode do mRNA trostruko veće stabilnosti, što pak upućuje na povećanu sintezu enzima PAD4 u osoba s ovim haplotipom. Ovaj enzim prisutan je u jezgri granulocita i monocita koji u velikom broju infiltriraju upaljeno reumatoidno sinovijalno tkivo pa će povećana razina enzima PAD4 u ovim stanicama imati kumulacijski učinak na konačnu količinu citruliniranih proteina. Dakle, velika količina citruliniranih antigena prezentira se imunom sustavu, što može dovesti do gubitka tolerancije na vlastite antigene. Ipak, povezanost polimorfizama PADI4s RA treba uzeti s rezervom, jer nije potvrđena i u drugim populacijama (28). Drugi mehanizam koji bi mogao biti odgovoran za povećanu ekspresiju citruliniranih antigena je neučinkovito uklanjanje mrtvih stanica. Unutarstanična koncentracija Ca++ iona preniska je za aktivaciju enzima PAD i on se nalazi u neaktivnom stanju. Tek kad se naruši homeostaza Ca++ iona, što se događa npr. pri završnoj diferencijaciji epitelnih stanica, dolazi do njegove aktivacije. Tijekom stanične smrti dolazi do narušavanja integriteta stanične membrane, što može imati dvojak učinak: influks Ca++ iona iz izvanstaničnog prostora i aktivaciju unutarstaničnog enzima PAD ili pak istjecanje enzima PAD u izvanstanični prostor s posljedičnim opsežnim citruliniranjem proteina. U stanjima u kojima prevladava neučinkovito uklanjanje mrtvih stanica (zbog masivne stanične smrti ili neučinkovitog mehanizma uklanjanja), kao što je to slučaj u RA, velika količina citruliniranih proteina izložit će se imunom sustavu koji će ih prepoznati kao strane antigene (26). Slijedeći genetski čimbenik koji može utjecati na abnormalan humoralni odgovor na uobičajeno prisutne citrulinirane proteine su RA-rizični HLA-DR aleli, prvenstveno HLA-DRB1*0401 i HLA-DRB1*0404. Naime, nedavno istraživanje je pokazalo da se citrulinirani peptidi derivirani iz vimentina, ali ne i oni koji na istoj poziciji imaju arginin, s visokim afinitetom vežu za molekulu HLA- DRB1*0401 (29). Ova interakcija mogla bi biti osnova za citrulin specifičnog imunog odgovora, jer su u pokusu s HLA-DRB1*0401 transgeničnim mišem isti autori dokazali kako stimulacija citruliniranim peptidima, ali ne i argininskom varijantom peptida, potiče proliferaciju i aktivaciju T limfocita. Međutim, odsutnost ACPA antitijela u HLA-DRB1*0401 pozitivnih bolesnika sa spondiloartritisom i psorijatičnim artritisom, u čijoj sinovijalnoj membrani je otkrivena prisutnost deiminiranog fibrina, upućuje na zaključak da samo RA-rizičan haplotip nije dostatan za ACPA specifičan imuni odgovor (12). Nadalje, potencijalni genetski čimbenik koji bi mogao sudjelovati u RA-specifičnom imunom odgovoru na citrulinirane proteine je polimorfizam gena za citokine koji imaju važnu ulogu u upalnom procesu znakovitom za RA. Jedan od takvih polimorfizama je –2849 A/G u promotorskoj regiji gena za IL-10 koji je odgovoran za povećanu proizvodnju IL-10. Ovaj interleukin, uz brojne protuupalne učinke, djeluje i proupalno u smislu da stimulira proliferaciju i diferencijaciju B limfocita s posljedičnom proizvodnjom antitijela. Pokazalo se da ACPA pozitivni bolesnici s RA s haplotipom koji rezultira visokom koncentracijom IL-10 imaju viši titar antitijela i teže erozivne promjene u odnosu na ACPA pozitivne bolesnike s RA bez ovog haplotipa (30). Viši titar antitijela stvoren lokalno dovodi i do stvaranja više imunokompleksa koji se posredstvom Fc receptora vežu za makrofage koji se potom aktiviraju i izlučuju veću količinu proupalnih citokina. Različiti polimorfizmi citokina i njihovih receptora povezuju se s RA (31). Ovi genetski čimbenici uzrokuju otpuštanje veće količine citokina nakon stimulacije ili uzrokuju veću osjetljivost stanica na citokine. Kako su citokini ključne molekule u upalnom odgovoru koji uključuje influks velikog broja upalnih stanica iz cirkulacije i njihovu aktivaciju, time se nastavlja ciklus koji vodi u kroničnu upalu znakovitu za RA. Uz nabrojene genetske čimbenike koji mogu doprinjeti RA-specifičnom imunom odgovoru na ubikvitarne citrulinirane proteine, danas se sve više zastupa i hipoteza o postojanju RA-specifičnih unutarstaničnih citruliniranih epitopa. Imunohistokemijskom metodom, upotrebom mišjeg monoklonskog antitijela, u reumatoidnom sinovijumu su otkriveni unutarstanični citrulinirani proteini koji su, za razliku od izvanstaničnih, specifični za RA. Ovi proteini pokazuju kolokalizaciju s enzimom PAD2 koji je značajno jače eksprimiran u sinovijalnom tkivu kod RA u odnosu na sinovijalno tkivo kontrolnih ispitanika. Nadalje, utvrđena je korelacija ekspresije unutarstaničnih citruliniranih proteina s lokalnom i sistemskom razinom ACPA antitijela (32). Biokemijski identitet ovih deiminiranih unutarstaničnih proteina još je u fazi ispitivanja.
 
Metode određivanja ACPA i njihovo kliničko značenje
U testovima ELISA za određivanje ovih antitijela rabe se sintetski citrulinirani peptidi ili citrulinirani proteini prisutnost kojih je dokazana u ekstraktu sinovijalnog tkiva. U izboru proteinskog supstrata prednost imaju oni bogati argininom kao što su fibrinogen i vimentin. Nakon in vitro citruliniranja ovi će proteini imati više različitih epitopa koje čine citrulin, ali i susjedne aminokiseline čime se, usporedbom sa sintetskim peptidima, teoretski povećava osjetljivost na poliklonski imuni odgovor. Međutim, s druge strane, upotreba proteina kao supstrata ima svoje nedostatke kao što je problem standardizacije in vitro enzimskog citruliniranja te moguća reaktivnost seruma s drugim ne-citruliniranim epitopima.
 
Antitijela na cikličke citrulinirane peptide (anti-CCP)
Identifikacija filagrina kao ciljne molekule koju prepoznaju RA–specifična antitijela AKA i APF omogućila je novi metodološki pristup otkrivanju ovih antitijela specifičnih za RA. Prve metode koje su se upotrebljavale bile su metode imunoblot, nešto kasnije i metode ELISA, u kojima je kao antigeni supstrat upotrebljen filagrin ekstrahiran iz humanog epidermisa (33,34). Međutim, pokazalo se da je gotovo nemoguće prirediti standardizirani supstrat s filagrinom kao antigenom. Razlog tome je činjenica da je gotovo 30–40% aminokiselinskih ostataka na molekuli filagrina promjenjivo i da je citrulinacija argininskih ostataka samo djelomična, pa ove izoforme obilježava velika heterogenost u naboju. Ovaj problem odnosi se i na in vitro enzimatski deiminirane bakterijski eksprimirane rekombinantne filagrinske fragmente. Suprotno heterogenom prirodnom supstratu, sintetski peptidi imaju više značajka idealnog antigenog supstrata. Peptidi prethodno definirane sekvence mogu se sintetizirati u velikim količinama s visokim stupnjem čistoće, a njihova mala veličina smanjuje mogućnost nespecifičnih interakcija koje se događaju s drugim sastavnicama u serumu. Ipak, upotreba linearnih sintetskih peptida (sintetiziranih prema molekuli profilagrina) kao supstrata u testu ELISA bila je razočaravajuća, jer se zadovoljavajuća osjetljivost postigla tek upotrebom više različitih sintetskih peptida, što je bilo tehnički prezahtjevno (35). Jedan od problema s upotrebom linearnih peptida kao supstrata je u tome što se standardnim postupkom pasivne adsorpcije ne postiže adsorpcija svih peptida na jažice pločica ELISA. Djelomično rješenje ovoga problema je kovalentno vezanje peptida na kruti nosač. Drugi problem upotrebe relativno kratkih (linearnih) peptida je u tome što oni u otopini uglavnom ne zauzimaju stabilnu konformaciju, pa stoga samo frakcija peptida zauzima konformaciju usporedivu onoj originalnog veznog mjesta na proteinskom antigenu. Ovaj učinak, nazvan “konformacijska dilucija”, ima neposredan negativni utjecaj na afinitet antitijela za peptid unatoč činjenici da peptidna sekvenca obuhvaća potpunu antigensku odrednicu. Način da se riješi ovaj problem je omogućiti da peptidi vezani na jažice zauzmu konformaciju koja pogoduje vezanju antitijela, odnosno koja će što više oponašati konformaciju originalnog veznog mjesta na proteinu. Imajući na umu da peptidi često zauzimaju β-konformaciju u kompleksu Ag-At, kao i činjenicu da cistinom premošteni ciklički peptidi oponašaju β-konformaciju originalne antigenske determinante i povećavaju afinitet vezanja za antitijelo, Schellekens i sur. (35) su upotrijebili cikličke peptide formirane supstitucijom serinskih ostataka s cisteinom koji je potom oksidiran u cistin. Tako je stvorena prva generacija testova ELISA s cikličkim citruliniranim peptidima (CCP1) kao antigenim supstratom. Medijan osjetljivosti dobiven u istraživanjima u kojima se rabio test CCP1 bio je 54% (raspon od 41% do 68%), a specifičnosti 97% (raspon od 90% do 99%) (36). Nekoliko godina poslije osjetljivost testa poboljšana je na način da je biblioteka citruliniranih peptida pretraživana pomoću “poola” seruma bolesnika s RA, što je rezultiralo identifikacijom brojnih visoko reaktivnih peptida koji se trenutno rabe u testovima ELISA druge generacije (CCP2) (37). Godine 2005. na tržištu se pojavila i treća generacija testa anti-CCP (CCP3) u kojem su uključeni dodatni citrulinirani epitopi te verzija testa s istodobnim otkrivanjem IgG i IgA anti-CCP antitijela (CCP 3.1), što bi trebalo poboljšati osjetljivost. Iako su neki autori (38,39) utvrdili poboljšanje osjetljivosti za oko 5% u odnosu na CCP2, rezultati drugih istraživanja pokazali su podjednaku dijagnostičku učinkovitost testova CCP2 i CCP3 (40,41).
 
Dijagnostička točnost testa anti-CCP2 u RA
Od 2003. godine objavljena su brojna istraživanja koja su se bavila ispitivanjem dijagnostičke točnosti testa anti-CCP2 za RA. Dobiveni rezultati pokazuju značajnu varijabilnost, što se pripisuje razlikama u značajkama ispitivanih skupina bolesnika s RA s jedne strane, odnosno heterogenosti skupina kontrolnih ispitanika s druge strane. Tako se osjetljivost anti-CCP2 u ispitanika s uznapredovalim RA kreće od 64% do čak 96%, dok se u onih s ranim RA ili još nediferenciranim artritisom kreće u rasponu od 14,4% do 83,5% (42). Na specifičnost testa odražava se pak izbor kontrolne skupine. Vrlo često su se u kontrolne skupine uključivali zdravi ispitanici, što precjenjuje specifičnost testa. Isti učinak se postiže s kontrolnom skupinom koju čine ispitanici s istom bolešću. Stvarna dijagnostička svojstva nekog testa proizaći će samo iz istraživanja u kojem su uključeni bolesnici koji predstavljaju stvarnu populaciju na kojoj će se test primjenjivati u kliničkoj praksi. Stoga, uzimajući u obzir samo istraživanja u kojima kontrolna skupina najviše odgovara ovoj pretpostavci, specifičnost anti-CCP2 za RA kreće se od 90,4% do 97,3% (42). Uz one s RA, anti-CCP antitijela nađena su i u oko 9% bolesnika sa sistemskim eritematoznim lupusom (SLE), 5% bolesnika sa Sjögrenovim sindromom, 8% onih s psorijatičnim artritisom te u 2–5% bolesnika s juvenilnim idiopatskim artritisom (36).
 
Prediktivna vrijednost testa anti-CCP2 za razvoj RA
Rantapaa-Dahlqvist i sur. utvrdili su prisutnost anti-CCP antitijela, kao što je to slučaj i s RF, mnogo godina prije pojave prvih simptoma RA. Retrospektivnom analizom krvi dobrovoljnih davalaca identificirali su 83 bolesnika u kojih se naknadno razvio RA. Anti-CCP antitijela predstavljaju prediktivni biljeg koji je pozitivan i 1,5 godinu prije prvog posjeta liječniku. Osjetljivost anti-CCP antitijela pokazuje u posljednjih 9 godina tendenciju porasta s 4% na 52% (43). Za podskupinu iz iste kohorte, 2 godine prije pojave simptoma su anti-CCP antitijela pokazala veću prediktivnu vrijednost u odnosu na RF i antigene HLA-DRB1 lokusa za razvoj RA, s omjerom vjerojatnosti (engl. odds ratio, OR) od 15,9 (44). Prediktivna vrijednost anti-CCP antitijela za RA potvrđena je i u longitudinalnim istraživanjima na kohortama ispitanika s nespecifičnim ranim upalnim artritisom (nediferencirani artritis). U istraživanju van Gaalena i sur., nakon prve godine je kriterije ARA za dijagnozu RA zadovoljilo 75% bolesnika koji su bili anti-CCP pozitivni u početku, a nakon 3 godine čak 93% (OR 38,6 u odnosu na 9,8 za RF). Među bolesnicima koji su bili anti-CCP negativni u početku, samo ih je 25% dijagnosticirano kao RA nakon 3 godine (45). U drugom istraživanju, bolesnici sa sinovitisom u trajanju ≤3 mjeseca praćeni su 18 mjeseci i pritom se pokazalo da kombinacija anti-CCP i RF ima pozitivnu prediktivnu vrijednost (PPV) od 58% i negativnu prediktivnu vrijednost (NPV) od 88% za dijagnozu RA (46). Iz navedenih rezultata može se zaključiti da je pojava anti-CCP, kao i RF, dio vrlo ranog procesa u razvoju RA. Kliničko značenje prediktivne vrijednosti ovih antitijela za razvoj RA prvenstveno je u skraćenju vremena od pojave prvih simptoma sinovitisa do terapijske intervencije.
 
Prognostička vrijednost testa anti-CCP2 u RA
Već se upotrebom testova anti-CCP prve generacije ukazalo na potencijal ovih antitijela u predviđanju erozivne progresije RA. Sve je veći broj istraživanja koja to potvrđuju i upotrebom testova druge generacije. U okviru švedskog istraživanja (TIRA projekt) je 242 bolesnika s ranim RA (trajanje bolesti ≤ 1 god.) praćeno tijekom 3 godine redovitim mjerenjem laboratorijskih (sedimentacija eritrocita (SE) i C-reaktivni protein (CRP)) i kliničkih pokazatelja aktivnosti bolesti (DAS28, engl. 28 joint disease activity score; broj otečenih zglobova; liječnikova globalna procjena aktivnosti bolesti; procjena funkcionalne sposobnosti pomoću HAQ, engl. Health Assessment Questionnaire) te RF (izotipa IgM i IgA) i anti-CCP. Iako je dijagnostička osjetljivost anti-CCP i RF bila podjednaka, pozitivna anti-CCP antitijela pri dijagnozi pokazala su se boljim predskazateljem aktivnosti bolesti u slijedeće 3 godine. Anti-CCP pozitivan status ostao je gotovo nepromijenjen tijekom 3 godine, neovisno o primijenjenoj antireumatskoj terapiji (47). U drugom istraživanju, Forslind i sur. su ispitivali prediktivnu vrijednost više čimbenika, uključujući i anti-CCP antitijela, za radiološki mjerenu progresiju zglobnog oštećenja metodom po Larsenu u 379 bolesnika s ranim RA tijekom 2 godine. Bolesnici s pozitivnim anti-CCP antitijelima imali su značajno veće oštećenje zglobova i na početku i na kraju praćenja u odnosu na one s negativnim anti-CCP antitijelima. Isti trend u odnosu na anti-CCP status pokazali su i laboratorijski i klinički pokazatelji aktivnosti bolesti (48). Logističkom regresijskom analizom najvažnijim varijablama u predviđanju progresije zglobnog oštećenja pokazali su se stupanj oštećenja zglobova po Larsenu, anti-CCP i SE izmjereni u početku. Ovaj model omogućuje ispravnu klasifikaciju u smislu progresije oštećenja u 75% slučajeva. Rönnelind i sur. su praćenjem 279 bolesnika s ranim RA potvrdili da prisutnost anti-CCP antitijela u početku predskazuje nepovoljan tijek bolesti kroz 5 godina i progresivnije oštećenje zglobova tijekom 2 godine (49). Treba naglasiti da je rezultat ovoga istraživanja pokazao kako promjene u koncentraciji anti-CCP antitijela ne odražavaju aktivnost bolesti. U nedavno objavljenom istraživanju su se anti-CCP, IgM-RF, SE i ženski spol pokazali neovisnim prediktorima progresije zglobnog oštećenja tijekom 10 godina, pri čemu su se pozitivna anti-CCP antitijela pokazala najjačim prediktorom (50).
Prediktivna vrijednost anti-CCP antitijela komplementirana drugim varijablama kao što su SE, radiološki procijenjeno oštećenje zglobova, RA-rizični HLA-aleli ili RF, omogućuje vrlo ranu identifikaciju bolesnika s visokim rizikom za razvoj progresivnog erozivnog artritisa u kojih je indicirana agresivna antireumatska terapija.
 
Antitijela na citrulinirani vimentin (anti-CV) i mutirani citrulinirani vimentin (anti-MCV)
Prije nešto više od desetljeća, Despres i sur. (51) opisali su nova antitijela u serumu bolesnika s RA koja su nazvali Sa-antitijela po prezimenu bolesnika kod kojeg su prvi put identificirana (Savoie). Sa-antitijela prepoznaju proteinsku vrpcu od 50 kDa na imunoblotu ekstrakta humane slezene, odnosno 2 vrpce (50 i 55 kDa) na imunoblotu ekstrakta humane placente. Ova antitijela nalaze se u 21%–43% bolesnika s RA uz vrlo visoku specifičnost od 92%–100% (52). Godine 2004. Vossenaar i sur. (14) su sekvencioniranjem Sa antigena pročišćenog iz ekstrakta placente otkrili nekoliko peptidnih sekvenca koje odgovaraju sekvencama vimentina. Western blot analizom isti autori potvrdili su vezanje anti-Sa antitijela na citrulinirani rekombinantni vimentin, ali ne i za nemodificirani vimentin, što upućuje na to da je prisutnost citrulina bitna za autoantigeničnost Sa. Ovim otkrićem su Sa-antitijela, identificirana kao antitijela na citrulinirani vimentin (anti-CV), ubrojena u veliku obitelj antitijela na citrulinirane proteine. Polimerizirane molekule vimentina čine strukturu intermedijarnih filamenata, glavne sastavnice citoskeleta u mezenhimskim stanicama (hondrociti, sinovijalni fibroblasti) i makrofazima pa je stoga očekivana njegova prisutnost u sinovijalnom tkivu. Intermedijarni filamenti, zajedno s aktinskim mikrofilamentima i mikrotubulima, tvore mrežu odgovornu za mehanički integritet stanice i uključeni su u kritične procese kao što je dioba stanice i pokretljivost. Polimerizacija slobodnih podjedinica vimentina u filamente je reverzibilni proces u kojem dolazi do defosforilacije (53). In vivo, vimentin obično nije u citruliniranom obliku, ali je dokazano da se deiminacija argininskih ostataka na molekuli vimentina događa u makrofazima tijekom apoptoze (54). Kako je poznato da in vitro deiminacija amino-terminalne domene molekule vimentina uzrokuje nestabilnost mreže intermedijarnih filamenata, pretpostavlja se da bi citrulinacija vimentina in vivo mogla biti uključena u kolabiranje citoskeleta tijekom apoptoze kad se filamenti vimentina odlažu u perinuklearne agregate. U stanjima praćenim nedostatnim uklanjanjem apoptotičnog materijala, kao što je to slučaj u RA, citrulinirani vimentin se izlaže imunokompetentnim stanicama koje reagiraju stvaranjem autoantitijela. Međutim, kako citrulinacija per se nije dovoljna za pokretanje ovakve imune reakcije, pretpostavilo se da upalni mikrookoliš u kojem prevladavaju reaktivni radikali kisika i dušika, u sinovijalnim fibroblastima i makrofazima može izazvati mutacije gena za vimentin i tako stvoriti nove antigene. Iz fibroblasta i sinovijalne tekućine bolesnika s RA pročišćene su izoforme vimentina karakterizirane LC/MS spektroskopijom i identificirane mutacije kao i citrulinacija. Rekombinantne mutirane izoforme vimentina, eksprimirane su u E. coli, a pročišćeni protein citruliniran in vitro i iskorišten kao antigen u ELISA testu za određivanje IgG antitijela na mutirani citrulinirani vimentin (anti-MCV).
 
Dijagnostička točnost i prognostička vrijednost anti-MCV antitijela u RA
Unatoč očekivanju da bi primjena citruliniranog proteina kao ciljnog antigena umjesto sintetskih peptida mogla povećati osjetljivost testa za otkrivanje ACPA antitijela, rezultati dosadašnjih istraživanja ukazuju na podjednaku dijagnostička točnost testova anti-MCV i anti-CCP2. Dejaco i sur. su usporedbom 164 bolesnika s RA i kontrolne skupine bolesnika s drugim upalnim i neupalnim reumatskim bolestima utvrdili osjetljivost testa anti-MCV od 69,5% i specifičnost 90,8%, u odnosu na test anti-CCP2 čija je osjetljivost bila 70,1% i specifičnost 98,7% (55). U drugom istraživanju su anti-MCV antitijela pokazala 9% veću osjetljivost u odnosu na anti-CCP2 antitijela i 4% veću u odnosu na RF, međutim, ukupna dijagnostička točnost prema ROC analizi bila je nešto niža od anti-CCP2, ali ne značajno. Iako su ova antitijela značajno međusobno korelirala, što upućuje na brojne zajedničke epitope, prisutnost samo jednog antitijela u oko 12% bolesnika navodi na zaključak da citrulinirani antigeni u oba testa sadrže i jedinstvene epitope koje prepoznaje samo jedno ili drugo antitijelo. Stoga autori predlažu kombinirano određivanje anti-CCP2 i anti-MCV u svrhu poboljšanja dijagnostičke učinkovitosti (56). Mathsson i sur. određivali su anti-CCP i anti-MCV antitijela u 273 bolesnika s ranim RA u trenutku pojave simptoma, te nakon 3 mjeseca i 1 godine, a za 72 bolesnika određivanje anti-CCP i anti-MCV antitijela nastavljeno je tijekom 2, 3 i 5 godina (57). Osjetljivost anti-MCV antitijela u ovom istraživanju bila je značajno viša (70,7%) u odnosu na anti-CCP2 (57,9%) uz podjednaku specifičnost (95% vs. 96%). Međutim, treba napomenuti da se dobivena dijagnostička točnost odnosi na usporedbu bolesnika s ranim RA i zdravih ispitanika. Pozitivna anti-MCV antitijela pri pojavi prvih simptoma pokazala su se podjednako dobrim predskazateljem progresivnog erozivnog artritisa kao i anti-CCP antitijela. Čini se pak da su anti-MCV antitijela osjetljiviji pokazatelj aktivnosti bolesti. Naime, promjene u koncentraciji anti-MCV antitijela tijekom 1 godine pokazale su snažniju korelaciju s promjenama laboratorijskih (SE i CRP) i kliničkih pokazatelja aktivnosti bolesti (DAS28, HAQ, liječnikova procjena aktivnosti bolesti, broj otečenih zglobova). U nedavno objavljenom radu Innala i sur. potvrdili su bolju povezanost anti-MCV antitijela s težim tijekom bolesti u odnosu na anti-CCP antitijela određena testovima druge i treće generacije, uz podjednaku prediktivnu vrijednost za progresiju radiološki procijenjenog zglobnog oštećenja (58).
Na osnovi rezultata dosadašnjih istraživanja čini se da anti-MCV antitijela nisu donijela značajan doprinos u dijagnostičkom smislu, međutim, klinička važnost njihovog određivanja u ranom RA leži u prognostičkoj vrijednosti za teži tijek bolesti.
 
Zaključak
Moderni terapijski pristup RA koji podrazumijeva ranu primjenu agresivnih antireumatika u svrhu sprječavanja ireverzibilnih zglobnih oštećenja nameće potrebu za ranom potvrdom dijagnoze, kao i prognoze tijeka bolesti. Dosadašnji dijagnostički pristup koji se zasniva na kliničkim parametrima i RF kao jedinom serološkom biljegu pokazao se nedovoljno osjetljivim i specifičnim u kritičnoj, ranoj fazi bolesti. Otkriće citrulina kao glavne odrednice ciljnih antigena visoko specifičnih antitijela u RA označilo je početak nove ere u dijagnozi RA. Upotreba sintetskih cikličkih citruliniranih peptida (CCP) kao antigena u testovima ELISA povećala je osjetljivost ovih antitijela za RA. Nadalje, ova visoko specifična antitijela pokazala su se i vrijednim prognostičkim biljegom. Ubikvitarnost citruliniranih proteina u fiziološkim i patološkim stanjima, kao i prisutnost antitijela na citrulinirane proteine mnogo godina prije pojave simptoma RA govori u prilog tome da citruliniranje per se nije dostatno za razvoj RA. Stoga je razumijevanje mehanizma za RA specifičnog imunog odgovora na citrulinirane proteine u žarištu istraživanja posljednjih nekoliko godina. Jedan od najvažnijih ciljeva u tim istraživanjima je identifikacija citruliniranih proteina kao potencijalnih antigena u upaljenom sinovijalnom tkivu. Do danas su identificirani brojni proteini kao potencijalni nativni antigeni, kao što su citrulinirani vimentin, fibrin i histoni. Prema najnovijim saznanjima, čini se da su za indukciju imunog odgovora prije odgovorni točno određeni citrulinirani epitopi negoli sama prisutnost citruliniranih proteina, pa je definiranje ovih epitopa glavni izazov u daljnjim istraživanjima.
 
Literatura
1.    Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, McShane DJ, Fries JF, Cooper NS, et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988;31:315-24.
2.    Nienhuis RLF, Mandema E. A new serum factor in patients with rheumatoid arthritis: the perinuclear factor. Ann Rheum Dis 1964;23:302-5.
3.    van Boekel MAM, Vossenaar ER, van den Hoogen FHJ, van Venrooij WJ. Auto-antibody systems in rheumatoid arthritis: specificity, sensitivity and diagnostic value. Arthritis Res 2002;4:87-93.
4.    Young BJJ, Mallya RK, Leslie RDG, Clark CJM, Hamblin TJ. Anti-keratin antibodies in rheumatoid arthritis. Br Med J 1979;2:97-9.
5.    Simon M, Girbal E, Sebbag M, Gomes-Daudrix V, Vincent C, Salam G, Serre G. The cytokeratin filament-aggregating protein filaggrin is the target of the so-called „antikeratin antibodies“, autoantibodies specific for rheumatoid arthritis. J Clin Invest 1993;92:1387-93.
6.    Sebbag M, Simon M, Vincent C, Masson-Bessiere C, Girbal E, Durieux JJ, Serre G. The antiperinuclear factor and the so-called antikeratin antibodies are the same rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest 1995;95:2672-9.
7.    Schellekens GA, de Jong BAW, van den Hoogen FHJ, van de Putte LBA, van Venrooij WJ. Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest 1998;101:273-81.
8.    Girbal-Neuhauser E, Durieux JJ, Arnaud M, Dalbon P, Sebbag M, Vincent C, et al. The epitopes targeted by the rheumatoid arthritis-associated antifilaggrin autoantibodies are posttranslationally generated on various sites of (pro)filaggrin by deimination of arginine residues. J Immunol 1999;162:585-94.
9.    Cantaert T, De Rycke L, Bongartz T, Matteson EL, Tak PP, Nicholas AP, Baeten D. Citrullinated proteins in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2006;54:3381-9.
10. Masson-Bessiere C, Sebbag M, Durieux JJ, Nogueira L, Vincent C, Girbal-Neuhauser E, et al. In the rheumatoid pannus, anti-filaggrin autoantibodies are produced by local plasma cells and constitute a higher proportion of IgG than in synovial fluid and serum. Clin Exp Immunol 2000;119:544-52.
11. Masson-Bessiere C, Sebbag M, Girbal-Neuhauser E, Nogueira L, Vincent C, Senshu T, Serre G. The major synovial targets of the rheumatoid arthritis-specific antifilaggrin autoantibodies are deiminated forms of the alpha- and beta-chains of fibrin. J Immunol 2001;166:4177-84.
12. Chapuy-Regaud S, Sebbag M, Baeten D, Clavel C, Foulquier C, De Keyser F, Serre G. Fibrin deimination in synovial tissue is not specific for rheumatoid arthritis but commonly occurs during synovitides. J Immunol 2005;174:5057-64.
13. Suzuki A, Yamad R, Ohtake-Yamanaka M, Okazaki Y, Sawada T, Yamamoto K. Anti-citrullinated collagen type I antibody is a target of autoimmunity in rheumatoid arthritis. Biochem Biophys Res Commun 2005;333:418-26.
14. Vossenaar ER, Despres N, Lapointe E, van der Heijden A, Lora M, Senshu T, et al. Rheumatoid arthritis specific anti-Sa antibodies target citrullinated vimentin. Arthritis Res Ther 2004;6:R142-50.
15. Chang X, Yamada R, Suzuki A, Kochi Y, Sawada T, Yamamoto K. Citrullination of fibronectin in rheumatoid arthritis synovial tissue. Rheumatology 2005;44:1374-82.
16. Kinloch A, Tatzer V, Wait R, Peston D, Lundberg K, Donatien P, et al. Identification of citrullinated α-enolase as a candidate autoantigen in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 2005;7:R1421-9.
17. Pratesi F, Tommasi C, Anzilotti C, Chimenti D, Migliorini P. Deiminated Epstein-Barr virus nuclear antigen 1 is a target of anti-citrullinated protein antibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2006;54:733-41.
18. Nakashima K, Hagiwara T, Yamada M. Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J Biol Chem 2002;277:49562-8.
19. Vossenaar ER, Zendman AJW, van Venrooij WJ, Pruijn G. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. BioEssays 2003;25:1106-18.
20. Chapuy-Regaud S, Sebbag M, Nachat R, Baeten D, Foulquier V, Simon M, et al. Peptidylarginine deiminase isoforms expressed in the synovial membrane of rheumatoid arthritis patients. Arthritis Res Ther 2003;5(Suppl 1):5. Abstract from 23rd European Workshop for Rheumatology Research.
21. Nicholas AP, Whitaker JN. Preparation of a monoclonal antibody to citrullinated epitopes: its characterization and some applications to immunohistochemistry in human brain. Glia 2002;37:328-36.
22. Smeets TJ, Vossenaar ER, vanVenrooij WJ, Tak PP. Is expression of intracellular citrullinated proteins in synovial tissue specific for rheumatoid arthritis? Comment on the article by Baeten et al. Arthritis Rheum 2002;46:2824-6.
23. Ishigami A, Ohsawa T, Hiratsuka M, Taguchi H, Kobayashi S, Saito Y, et al. Abnormal accumulation of citrullinated proteins catalyzed by peptidylarginine deiminase in hippocampal extracts from patients with Alzheimer’s disease. J Neurosci Res 2005;80:120-8.
24. Nicholas AP, Sambandam T, Echols JD, Tourtellotte WW. Increased citrullinated glial fibrillary acidic protein in secondary progressive multiple sclerosis. J Comp Neurol 2004;473:128-36.
25. Makrygiannakis D, af Klint E, Lundberg IE, Lofberg R, Ulfgren AK, Klareskog L, Catrina AI. Citrullination is an inflammation-dependent process. Ann Rheum Dis 2006;65:1219-22.
26. Vossenaar ER, Zedman AJW, van Venrooij WJ. Citrullination, a possible functional link between susceptibility genes and rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 2004;6:1-5.
27. Suzuki A, Yamada R, Chang X, Tokuhiro S, Sawada T, Suzuki M, et al. Functional haplotypes of PADI4, encoding citrullinating enzyme peptidylarginine deiminase 4, are associated with rheumatoid arthritis. Nat Genet 2003;34:395-402.
28. Migliorini P, Pratesi F, Tommasi C, Anzilotti C. The immune response to citrullinated antigens in autoimmune diseases. Autoimmun Rev 2005;4:561-4.
29. Hill JA, Southwood S, Sette A, Jevnikar AM, Bell DA, Cairns E. Cutting edge: the conversion of arginine to citrulline allows for a high-affinity peptide interaction with the rheumatoid arthritis-associated HLA-DRB1*0401 MHC class II molecule. J Immunol 2003;171:538-41.
30. Lard LR, van Gaalen FA, Schonkeren JJM, Pieterman EJ, Stoeken G, Vos K, et al. Association of the -2849 interleukin-10 promoter polymorphism with autoantibody production and joint destruction in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2003;47:1841-8.
31. Klareskog L, Lorentzen J, Padykov L, Alfredsson L. Genes and environment in arthritis: can RA be prevented? Arthritis Res 2002;4(Suppl 3):S31-S36.
32. De Rycke L, Nicholas A P, Cantaert T, Kruithof E, Echols J D, Vandekerckhove B, et al. Synovial intracellular citrullinated proteins colocalizing with peptidyl arginine deiminase as pathophysiologically relevant antigenic determinants of rheumatoid arthritis-specific humoral autoimmunity. Arthritis Rheum 2005;52:2323-30.
33. Slack SL, Mannik M, Dale BA. Diagnostic value of antibodies to filaggrin in rheumatoid arthritis. J Rheumatol 1998;25:847-51.
34. Palouso T, Lukka M, Alenius H, Kalkkinen N, Aho K, Kurki P, et al. Purification of filaggrin from human epidermis and measurement of antifilaggrin autoantibodies in sera from patients with rheumatoid arthritis by an enzyme-linked immunosorbent assay. Int Arch Allergy Immunol 1998;115:294-302.
35. Schellekens GA, Visser H, de Jong BA, van den Hoogen FH, Hazes JM, Breedveld FC, van Venrooij WJ. The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide.Arthritis Rheum 2000;43:155-63.
36. Avouac J, Gossec L, Dougados M. Diagnostic and predictive value of anti-cyclic citrullinated protein antibodies in rheumatoid arthritis: a systematic literature review. Ann Rheum Dis 2006;65:845-51.
37. Nijenhuis S, Zendman AJ, Vossenaar ER, Pruijn GJ, vanVenrooij WJ. Autoantibodies to citrullinated proteins in rheumatoid arthritis: clinical performance and biochemical aspects of an RA-specific marker. Clin Chim Acta 2004;350:17-34.
38. Burlingame RW. QUANTA LiteTM CCP 3.1 IgG/IgA ELISA. INOVA Newsletter 2007;2:4-5.
39. Vieira LMEA. Rheumatoid arthritis diagnosis: a comparative study of second and third generation anti-cyclic citrullinated peptide (CCP) antibody ELISAs. INOVA Newsletter 2007;2:8-9.
40. Lutteri L, Malaise M, Chapelle JP. Comparison of second- and third-generation anti-cyclic citrullinated peptide antibodies assays for detecting rheumatoid arthritis. Clin Chim Acta 2007;386:76-81.
41. Caro-Oleas JL, Fernandez-Suarez A, Cesteros SR, Porrino C, Nunez-Roldan A, Wichmann Schlipf I. Diagnostic usefulness of a third-generation anti-cyclic citrulline antibody test in patients with recent-onset polyarthritis. Clin Chem Lab Med 2007;45:1396-401.
42. Riedmann JP, Munoz S, Kavanaugh A. The use of second generation anti-CCP antibody (anti-CCP2) testing in rheumatoid arthritis – a systematic review. Clin Exp Rheumatol 2005;23(Suppl. 39):S69-76.
43. Rantapaa-Dahlqvist S, de Jong BA, Berglin E, Hallmans G, Wadell G, Stenlund H, et al. Antibodies against cyclic citrullinated peptide and IgA rheumatoid factor predict the development of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2003;48:2741-9.
44. Berglin E, Padyukov L, Sundin U, Hallmans G, Stenlund H, Van Venrooij WJ. A combination of autoantibodies to cyclic citrullinated peptide (CCP) and HLA-DRB1 locus antigens is strongly associated with future onset of rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 2004;6:R303-8.
45. Van Gaalen FA, Linn-Rasker SP, van Venrooij WJ, de Jong BAW, Breedveld FC, Verweij CL, et al. Autoantibodies to cyclic citrullinated peptides predict progression to rheumatoid arthritis in patients with undifferentiated arthritis. Arthritis Rheum 2004;50:709-15.
46. Raza K, Breese M, Nightingale P, Kumar K, Potter T, Carruthers DM, et al. Predictive value of antibodies to cyclic citrullinated peptide in patients with very early inflammatory arthritis. J Rheumatol 2005;32:231-8.
47. Kastbom A, Strandberg G, Lindroos A, Skogh T. Anti-CCP antibody test predicts the disease course during 3 years in early rheumatoid arthritis (the Swedish TIRA project). Ann Rheum Dis 2004;63:1085-9.
48. Forslind K, Ahlmen M, Eberhardt K, Hafström I, Svensson B, for the BARFOT study group. Prediction of radiological outcome in early rheumatoid arthritis in clinical practice: role of antibodies to citrullinated peptides (anti-CCP). Ann Rheum Dis 2004;63:1090-5.
49. Rönnelid J, Wick MC, Lampa J, Lindblad S, Nordmark B, Klareskog L, van Vollenhoven RF. Longitudinal analysis of citrullinated protein/peptide antibodies (anti-CP) during 5 year follow up in early rheumatoid arthritis: anti-CP status predicts worse disease activity and greater radiological progression. Ann Rheum Dis 2005;64:1744-9.
50. Syversen SW, Gaarder PI, Goll GL, Odegard S, Haavardsholm EA, Mowinckel P, et al. High anti-cyclic citrullinated peptide levels and an algorithm of four variables predict radiographic progression in patients with rheumatoid arthritis: results from a 10-year longitudinal study. Ann Rheum Dis 2008;67:212-7.
51. Despres N, Boire G, Lopez-Longo FJ, Menard HA. The Sa system: a novel antigen-antibody system specific for rheumatoid arthritis. J Rheumatol 1994;21:1027-33.
52. Menard HA, Lapointe E, Rochdi MD, Zhou ZJ. Insights into rheumatoid arthritis derived from the Sa immune system. Arthritis Res 2000;2:429-32.
53. Strelkov SV, Herrmann H, Aebi U. Molecular architecture of intermediate filaments. Bioassays 2003;25:243-51.
54. Vossenar ER, Radstake TR, van der Heijden A, van Mansum MA, Dieteren C, de Rooij DJ, et al. Expression and activity of citrullinating peptidylarginine deiminase enzymes in monocytes and macrophages. Ann Rheum Dis 2004;63:373-81.
55. Dejaco C, Klotz W, Larcher H, Duftner C, Schirmer M, Herold M. Diagnostic value of antibodies against a modified citrullinated vimentin in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 2006;8:R119.
56. Soos L, Szekanecz Z, Szabo Z, Fekete A, Zeher M, Horvath IF, et al. Clinical evaluation of anti-mutated citrullinated vimentin by ELISA in rheumatoid arthritis. J Rheumatol 2007;34:1658-63.
57. Mathsson L, Mullazehi M, Wick MC, Sjöberg O, van Vollenhoven R, Klareskog L, Rönnelid J. Antibodies against citrullinated vimentin in rheumatoid arthritis. Higher sensitivity and extended prognostic value concerning future radiographic progression as compared with antibodies against cyclic citrullinated peptides. Arthritis Rheum 2008;58:36-45.
58. Innala L, Kokkonen H, Eriksson C, Jiddell E, Berglin E, Rantapaa-Dahlqvist S. Antibodies against mutated citrullinated vimentin are a better predictor of disease activity at 24 months in early rheumatoid arthritis than antibodies against cyclic citrullinated peptides. J Rheumatol 2008;35:1-7.