Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Pregledni članak

 

Ivana Čepelak1*, Dubravka Čvorišćec2. Biokemijski biljezi pregradnje kostiju – pregled. Biochemia Medica 2009;19(1):17-35.
 
1Zavod za medicinsku biokemiju i hematologiju Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb
2Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu i KBC Zagreb, Zagreb
 
Corresponding author*: icepelak [at] yahoo [dot] com
 
Sažetak
 
Danas je u upotrebi niz biokemijskih biljega pregradnje kostiju, uključujući biljege izgradnje i razgradnje kostiju. Oni pružaju klinički korisne dokaze normalnih i patoloških procesa, koji odražavaju aktivnosti koštanih stanica u skeletu. Biološki biljezi pregradnje kostiju mogu se koristiti za praćenje učinaka terapije kod bolesnika s nekom od bolesti kostiju te za moguće smanjenje potrebe čestog mjerenja gustoće koštane mase (denzitometrije).
Ključne riječi: biljezi izgradnje kostiju; biljezi razgradnje kostiju; osteoporoza
 
Pristiglo: 26. lipnja 2008.                                                                                                         Prihvaćeno: 8. prosinca 2008.
 
Uvod
 
Usporedno s povećanim razumijevanjem biokemijskih procesa u kostima te izolacijom i karakterizacijom staničnih sastojaka skeletnog matriksa, povećava se i broj novih, biokemijskih potencijalnih biljega izgradnje i razgradnje kostiju. Općenito se dijele na:
a) enzimske biljege izgradnje (vezane uz aktivnost osteoblasta) i razgradnje kostiju (vezane uz aktivnost osteoklasta);
b) proteine koštanog matriksa i razgradne produkte organskoga skeletnog matriksa koji se otpuštaju u cirkulaciju za vrijeme izgradnje ili razgradnje kostiju; te
c) biljege anorganskoga koštanog matriksa (kalcij i fosfor, koji prije svega odražavaju homeostazu kalcija/fosfora i koji u ovom pregledu neće biti razmatrani).
U tablicama 1. i 2. prikazani su do sada otkriveni biljezi izgradnje i razgradnje kostiju skupine a) i b) od kojih će neki biti podrobnije razmotreni. Opisano je njihovo tkivno podrijetlo, fiziološki uzorak u kojem se mjeri njihova koncentracija/aktivnost te trenutno raspoložive analitičke metode (1,2). U tekstu će se raspravljati o biljezima na čijoj se standardizaciji više radi, odnosno onima koji su u rezultatima dosadašnjih ispitivanja pokazali veću kliničku valjanost, te naglasiti nedostatke nekih, donedavno više korištenih biljega.
 
Tablica 1. Biljezi izgradnje kostiju
 
 
Tablica 2. Biljezi razgradnje kostiju
 
Koje je općenito značenje biokemijskih biljega koštane pregradnje?
Poznata temeljna prednost biokemijskih biljega u odnosu na mjerenje mineralnog sadržaja kosti i statičku histomorfometrijsku analizu biopsije kosti jest činjenica da njihovom uporabom dobivamo informaciju o statusu koštane pregradnje. Biokemijski su biljezi uz to i neinvazivna pretraga u usporedbi sa statičkom histomorfometrijskom analizom.
Informacija o dinamičkom stanju metabolizma kostiju mogla bi ranije ukazati na neke patološke promjene u kostima, odnosno na rizik nastanka nekih bolesti kostiju. Mjerenjem koncentracije/aktivnosti biokemijskih biljega moguće je nadalje dobiti bržu informaciju o terapijskom odgovoru u odnosu na mjerenje koštane mase. Značajne promjene biokemijskih biljega mogu se, naime, otkriti već nakon 1-3 mjeseca djelotvorne terapije, dok se promjena koštane mase može odgovarajuće procijeniti tek nakon 1. ili 2. godine (3,4). Potrebu za pronalaženjem specifičnih biokemijskih biljega naglašava i primjena novih, vrlo učinkovitih lijekova, koji snažno djeluju na metabolizam kostiju. Zajedno s mjerenjem koštane mase pokazuju se korisnima i u prognozi bolesti. Nedvojbeno je do sada pokazano da su neki od biljega ili kombinacije biljega, navedeni u tablicama 1. i 2. korisni u populacijskim i epidemiološkim ispitivanjima te praćenju učinka antiresorpcijske terapije. Međutim, s obzirom na neprestani razvoj novih, specifičnijih postupaka za njihovo mjerenje, konačna procjena njihove kliničke korisnosti u obradi bolesnika još je uvijek u tijeku. Preporuke su stoga i nadalje da se maksimalna pažnja posveti pitanju trebaju li se i kako uopće koristiti biljezi, te standardizaciji predanalitičkih i analitičkih postupaka mjerenja koštanih biljega.
Na koji način treba procijeniti kliničku valjanost biljega?
Općenito, biokemičari i kliničari trebaju se upitati: koji biokemijski biljeg koštane pregradnje mjeriti, kako i kada ga mjeriti, kako prikupiti uzorak i kako interpretirati dobiveni rezultat. Važni kriteriji u kritičkoj prosudbi potrebe mjerenja nekog od biljega izgradnje ili razgradnje kostiju su:
Biološki čimbenici (kao što su tkivna specifičnost, učinak promjene funkcije jetre ili bubrega na klirens biljega, biološki ritam biljega zbog standardizacije vremena uzimanja fiziološkog uzorka, imobilizacija i dr.);
Predanalitički čimbenici (način pohranjivanja uzorka, odnosno vrijeme i temperatura, zamrzavanje i odmrzavanje uzorka, utjecaj antikoagulanta i dr.);
Analitička specifičnost i točnost (mikroheterogenost biljega, kao npr. stupanj glikozilacije ALP, razgradivost biljega na više različitih fragmenata kao u slučaju osteokalcina, netočnost metoda zbog neusklađenih kalibracija, specifičnost protutijela i npr. inhibitori enzimskih aktivnosti);
Dijagnostička valjanost (odnosno postoje li razlike između biljega s obzirom na njihovu dijagnostičku osjetljivost i specifičnost) (1,5).
U ovom kontekstu, pregled koštanih biljega koji slijedi treba čitatelju omogućiti procjenu moguće dijagnostičke vrijednosti pojedinih biljega koji su prema znanstveno-stručnoj literaturi prošli djelomičnu evaluaciju Šalkalna fosfataza (engl. alkaline phosphatase, ALP); koštana alkalna fosfataze (engl. bone alkaline phosphatase, B-ALP), osteokalcin (engl. osteocalcin, OC), C-terminalni propeptid prokolagena tipa I (engl. carboxy-terminal type I procollagen propeptide, PICP), piridinolin (engl. pyridinoline, PYD) i deoksipiridinolin (engl. deoxypyridinoline, DPD), C-terminalni telopeptid kolagena (engl. C-telopeptide of type I collagen, CTX) i N-terminalni telopeptid kolagena (engl. N-telopeptide of type I collagen, NTX)Ć te nedostataka i ograničenja pojedinih postupaka njihova mjerenja. Neki od gore navedenih čimbenika prosudbe koštanih biljega prikazani su u tablici 3. (1,2).
 
Tablica 3. Predanalitičke i biološke značajke koštanih biljega
 
Biljezi izgradnje kostiju
Biljezi izgradnje kostiju su izravni ili neizravni produkti ili enzimi aktivnih osteoblasta, njihova koncentracija ili aktivnost mjeri se u serumu ili plazmi i općenito imaju umjereno izraženu biološku varijabilnost. Najčešće se mjeri aktivnost ukupne ALP, aktivnost ili masa B-ALP, te koncentracija OC i PICP.
Alkalna fosfataza (ALP)
Precizna fiziološka funkcija ALP još uvijek je nejasna, ali se pretpostavlja njena uloga u stvaranju osteoida i mineralizaciji kostiju. Fiziološki oblici kodirani su s 4 genska lokusa, tri tkivno specifična i jedan tkivno nespecifičan. Koštani i jetreni oblici ALP, koji su najzastupljeniji u serumu, nastaju posttranslacijskim modifikacijama, točnije različitim stupnjem glikozilacije tkivno nespecifičnog genskog produkta (različiti udio sijalinske kiseline i vezanih šećernih ostataka). Kao ekto-enzim tetramerna ALP je specifično, preko C-terminalnog glikan-fosfatidil sidra vezana na membrane osteoblasta. U cirkulaciji se nalazi uglavnom dimerna ALP, ali se mogu naći i tetramerni oblici vezani na membranu. Ispitivanjima in vitro ustanovljeno je nekoliko daljnjih oblika B-ALP koji nastaju djelovanjem proteaza te fosfolipaza C i D (1,2,6,7). U serumu odraslih zdravih osoba oko 50% ukupne aktivnosti ALP podrijetlom je iz jetre te oko 50% iz kostiju, dok u serumu djece i adolescenata prevladava B-ALP. Vrijednosti ukupne ALP veće su u muškaraca nego u žena, pretpostavlja se zbog suprimirajućeg učinka estrogena na metabolizam kostiju, a povećavaju se linearno s godinama u oba spola. Žene koje uzimaju kontraceptive imaju 13% manju aktivnost B-ALP. Nedostatak cinka i magnezija, koji je moguć kod parenteralne prehrane bez mikroelemenata, smanjuje aktivnost ALP u serumu. Ukupna aktivnost ALP u serumu stabilna je 7 dana na sobnoj temperaturi. Opetovano peterostruko zamrzavanje i odmrzavanje uzorka ne utječe na aktivnost B-ALP (7).
Postupci razlikovanja i mjerenja aktivnosti/koncentracije dva najzastupljenija izoenzimska oblika ALP (jetreni i koštani) koriste razlike fizikalno-kemijskih svojstava pojedinog izoblika (toplinska denaturacija, elektroforeza, precipitacija, selektivna inhibicija, HPLC i imunokemijski postupci).
Imunokemijskim postupcima moguće je mjeriti masene koncentracije B-ALP uz primjenu dva monoklonska protutijela prema B-ALP te aktivnosti nakon imunoadsorpcije na mikrotitarskim pločicama. Oba postupka pokazuju križnu reaktivnost od 14–20% s jetrenim oblikom ALP. Međutim, ustanovljeno je da u bolesnika s hepatobilijarnim bolestima, B-ALP ostaje unutar referentnog intervala ako ukupna aktivnost ALP u serumu ne prelazi gornju granicu referentnog intervala više od dva puta.
U precipitacijskom postupku ugljikohidratni (oligosaharidni) dio B-ALP, bogat N-acetilglukozaminom i N-acetil-neuraminskom kiselinom, precipitira s lektinima pšeničnih klica, dok jetrena ALP ne precipitira i mjeri se u supernatantu. Ovim postupkom dobivaju se lažno povećani rezultati kod bolesnika s hepatobilijarnim bolestima. Naime, bilijarna ALP može biti također precipitirana s lektinom (što se sprječava dodavanjem Tritona X100 u reagens), a zbog povećane propusnosti stanica jetre glikozilirani dio jetrenog oblika ALP može biti izmijenjen. S obzirom da priprema lektina može značajno varirati od bočice do bočice, B-ALP zapravo nije uvijek precipitirana u potpunosti pa je potrebna standardizacija ovog postupka prema referentnoj metodi. Odnos aktivnosti i mase B-ALP (procijenjen precipitacijom s lektinom i s IRMA), kao i aktivacijska energija (reakcija katalizirana s B-ALP) variraju ovisno o ispitanoj skupini bolesnika, vjerojatno opet uključujući različiti stupanj glikozilacije enzimske molekule.
Postupak sekvencijske denaturacije toplinom koštanog izoenzima (56 °C) više se gotovo ne koristi.
Iako su elektroforetski postupci za razdvajanje izooblika ALP na različitim nosačima robusni i zahtijevaju iskustvo, zbog ostalih prednosti su i nadalje postupci izbora. Naime, primjenom elektroforetskog postupka moguće je otkriti i ostale izooblike ALP te uz glavni koštani oblik i njegove varijante (otkrivajući i oblik koji nosi sidro). Kada aktivnost B-ALP prelazi 50% ukupne aktivnosti enzima u serumu, potrebna je obrada uzorka s neuraminidazom koja uklanja sijalinsku kiselinu s B-ALP, ili aplikacija uzorka na drugi gel koji sadrži lektin (precipitira B-ALP). U metaboličkim bolestima kostiju primjenom HPLC izmjerene su tri vršne vrijednosti B-ALP (1,2,6,7).
U slučajevima kada je bolest jetre isključena, ukupna aktivnost ALP ima kliničku vrijednost, odnosno daje dobru informaciju o izgradnji kosti i broju aktivnih osteoblasta. Brojnim ispitivanjima (transplantacija koštane srži, karcinom prostate s metastazama u kostima, žene u postmenopauzi, praćenje antiresorpcijske terapije i dr.) ustanovljeno je da mjerenje B-ALP ima veću diskriminirajuću vrijednost od ukupne aktivnosti ALP, čime je naglašena viša dijagnostička specifičnost mjerenja B-ALP. Može se, dakle, zaključiti da mjerenje B-ALP bolje razlikuje između „normalnog” i „patološkog” stanja na gornjoj granici referentnog intervala, pa tako povećava dijagnostičku specifičnost za otkrivanje bolesti kostiju. Zbog križne reaktivnosti u imunokemijskim postupcima i njihove nepreciznosti u donjoj polovini referentnog intervala, elektroforeza ostaje zlatni standard za otkrivanje smanjene koncentracije/aktivnosti B-ALP i za potvrdu povećane B-ALP u slučajevima težih bolesti jetre (6,8,9,10).
Osteokalcin (OC)
Osteokalcin (engl. osteocalcin, OC) ili koštani Gla (engl. glutamic acid, Gla) protein glavni je nekolageni protein koštanog matriksa, koji primarno sintetitiziraju osteoblasti te odontoblasti i hipertrofični hondrociti. Neznatna količina OC može se osloboditi tijekom razgradnje kostiju, što se može izmjeriti nekim metodama, stoga bi ga se moglo nazvati i biljegom koštane pregradnje. Sadrži 49 aminokiselina (5,8 kDa) od kojih su tri gama-karboksi-glutaminske kiseline (postranslacijska, o vitaminu K ovisna enzimska karboksilacija) na pozicijama 17, 21 i 24, a odgovorne su za Ca-vezujuća svojstva ovog proteina. Točna uloga ovog proteina još uvijek nije sasvim jasna. Raspravlja se najviše o njegovoj ulozi u procesu mineralizacije kostiju, o ulozi glasnika za kalcitriol u razgradnji kostiju, te ulozi inhibitora leukocitne esteraze i aktivnosti faktora rasta. Poslije sinteze, koju značajno stimulira kalcitriol, otpušta se i ugrađuje u izvanstanični koštani matriks (>80%). Jedan dio (10-30%) novosintetiziranog OC otpušta se u cirkulaciju gdje se njegova koncentracija može mjeriti imunokemijski (odražava, dakle, sintezu OC u osteoblastima i izgradnju kosti). Ustanovljena je značajna heterogenost cirkulirajuće frakcije OC, budući da podliježe proteolitičkom cjepanju u jetri, bubrezima, plazmi, kao i u samim kostima. Dva su glavna mjesta enzimskog cijepanja „intaktne” molekule, a nastali poznati fragmenti u cirkulaciji su fragmenti 1-19, 20-43, 44-49, 1-43 i 20-49. U naizgled zdravih osoba cirkulirajuća frakcija „intaktnog” OC predstavlja samo 36% ukupnog imunoreaktivnog OC, N-terminalni/srednji regionalni fragment (1-43) 30%, a drugi fragmenti prisutni su u zanemarivim koncentracijama (1,2). Klinička su istraživanja pokazala da nedostatak vitamina K može dovesti do poremećaja karboksilacije OC, što rezultira nerazmjernim povećanjem koncentracije cirkulirajućeg oblika OC u cirkulaciji (11).
Budući da se vrlo brzo izlučuje kroz bubrege, poluživot cirkulirajućeg OC je oko 4-5 minuta (OC i njegovi fragmenti se nakupljaju i povećava im se koncentracija u serumu kada je promijenjena funkcija bubrega). Cirkulirajući OC pokazuje cirkadijalni ritam s najvećim vrijednostima noću i rano ujutro i najnižim tijekom prijepodneva, a razlike su do 50%. Žene koje uzimaju oralne kontraceptive imaju 24% niže vrijednosti cirkulirajućeg OC. S druge strane, ustanovljeno je da vrijednosti OC nisu pod utjecajem menstruacijskog ciklusa ili uzimanja kalcija s hranom. Zanimljivo je da je OC jedini biljeg izgradnje kostiju čije vrijednosti pokazuju značajno povećanje nakon dužeg boravka u krevetu, što je vjerojatno zbog oslobađanja OC inkorporiranog u kostima iz mjesta razgradnje. Također su samo vrijednosti OC, dakle ne B-ALP i PICP, povećane kod osoba sa značajnom fizičkom aktivnošću. U usporedbi s B-ALP, opisane su značajne analitičke i biološke varijacije OC. Vrijednosti OC više su kod djece nego kod odraslih osoba, posebno za vrijeme razdoblja intenzivnog rasta, više su kod muškaraca nego kod žena dok su kod žena značajno više za vrijeme menopauze (2,6,11). Koncentracija cirkulirajućeg OC u uzajamnoj je vezi s gustoćom koštane mase na vratu femura (13) te je nezavisan pretkazatelj prijeloma kuka kod populacije starijih žena (14).
Koncentracija imunoreaktivnog OC u biološkim tekućinama mjeri se imunokemijskim postupcima (RIA, ELISA, IRMA, ECLIA). Trenutno raspoloživi postupci mjerenja cirkulirajućeg OC razlikuju se s obzirom na princip mjerenja (kompeticijsko, imunometrijsko), izvor (poliklonska, monoklonska) i specifičnost protutijela (npr. za „intaktnu” molekulu ili različite fragmente), te izvor kalibratora (goveđi/humani). Različita specifičnost protutijela za fragmente OC u ovim postupcima rezultira velikom različitošću koncentracija imunoreaktivnog OC (ovo je posebno važno u bolestima kod kojih je zapaženo nakupljanje raznih fragmenata, kao što su kronične bolesti bubrega i Pagetova bolest). U ispitivanjima usporedivosti postupaka opažena je slaba korelacija. Najčešće se raspoloživim postupcima mjeri 1-43 fragment (N-terminal/MID fragment; dijelom ga mogu stvarati i aktivni osteoblasti), produkt proteolitičke razgradnje intaktnog OC. Premda se malo zna o funkciji ovog fragmenta, njegovo mjerenje dijelom uklanja problem predanalitičke nestabilnosti. Zabilježen je, naime, gubitak imunoreaktivnosti već nakon 1 sata stajanja uzorka na sobnoj temperaturi. Stoga je brza obrada uzorka nakon uzorkovanja neophodna za sve trenutno raspoložive postupke.
Uzorak u kojem se mjeri koncentracija OC u pravilu je serum, iako se za neke postupke može koristiti i plazma. Zbog dokazane nestabilnosti, odnosno djelovanja proteaza preporuča se uzorak odmah spremiti na led; može se dodati npr. inhibitor aprotinin, čime se stabilnost može očuvati 5 sati na sobnoj temperaturi. Serum odvojen od stanica unutar 1. sata nakon uzorkovanja može se odmah zamrznuti, ali se opetovano odmrzavanje i zamrzavanje ne preporuča. Hemoliza može utjecati na mjerenje koncentracije OC zbog povećanog otpuštanja proteaza iz eritrocita (2,7,12). Antikoagulansi (ako se koristi krvna plazma) s oksalatima i fluoridima mogu smanjiti koncentraciju OC. Pretpostavlja se da razlog tome nije interferencija u imunokemijskom postupku, nego veća hemoliza koju uzrokuju ovi antikoagulansi u odnosu na druge. Nadalje je ustanovljeno da stabilnost OC ovisi izrazito o analitičkoj specifičnosti primijenjenog postupka. Imunometrijska mjerenja specifično mjere intaktni OC, koji je sklon brzoj proteolitičkoj razgradnji u serumu. Ovim postupcima izmjerene su niže vrijednosti (10%) OC 1-49 i OC 1-43 za vrijeme pohranjivanja 7 dana na +4°C.
Povećane vrijednosti OC opisane su u bolesnika s povećanom izgradnjom kostiju - hiperparatiroidizam, Pagetova bolest, značajna osteoporozna pregradnja, hipertiroidizam, bubrežna osteodistrofija, frakture i akromegalija. U žena u kasnijoj postmenopauzalnoj fazi isto dijagnostičko značenje ima mjerenje OC 1-49 i omjera OC 1-49/OC 1-43. Zanimljivo je da je u bolesnika s osteoporozom korelacija OC i B-ALP niska, dok u primarnom hiperparatiroidizmu koncentracije OC i B-ALP pokazuju usporedivu diskriminirajuću vrijednost (9). Kod bolesnika s tumorom i metastazama u kostima i onih s Pagetovom bolešću, mjerenje OC manje je važno od mjerenja B-ALP u smislu dijagnostičke osjetljivosti. Suprotno tome, mjerenje OC je značajnije od mjerenja B-ALP u praćenju bolesnika na kortikosteroidnoj terapiji. Kod bolesnika s kroničnim bolestima bubrega korisnost OC je znatno smanjena, jer je pod utjecajem funkcije bubrega. Smanjene vrijednosti OC nađene su u hipoparatiroidizmu, hipotiroidizmu, nedostatku hormona rasta, za vrijeme nadomjesne estrogenske terapije, te terapije s glukokortikoidima, bifosfonatima i kalcitoninom. U tablici 4. prikazana su klinička stanja povezana s promjenama B-ALP i OC u serumu. Za odgovarajuće tumačenje podataka koncentracije OC važno je temelji li se primijenjen mjerni postupak ili ne na reakciji s fragmentima OC otpuštenima iz koštanog matriksa za vrijeme razgradnje. Samo u slučaju izostanka reakcije s navedenim fragmentima opravdano je tražiti opetovano mjerenje biljega izgradnje kostiju (OC 1-43 je fragment koji se vjerojatno ne otpušta iz kosti za vrijeme razgradnje, već samo iz novosintetiziranog OC). Mjerenje specifičnog fragmenta OC obećava budući da su određivanja intaktne molekule podložnija predanalitičkoj nestabilnosti.
 
Tablica 4. Klinička stanja povezana s promjenama vrijednosti B-ALP i OC u serumu
 
Propeptidi prokolagena tipa I (PINP, PICP)
Kolagen tipa I je glavni protein koštanog matriksa (> 90% sadržaja matriksa) te u manjoj mjeri kože, dentina, tetiva, korneje i brojnih drugih tkiva. Sintetizira se u osteoblastima u obliku prethodničke molekule prokolagena I koja sadrži N- i C-terminalnu trimernu produženu domenu Šdva identična polipeptidna lanca (alfa1 I) i jedan (alfa2 I)] poznatu kao propeptid (PINP i PICP). Karakteristike dva navedena propeptida prikazane su u tablici 5. (1).
 
Tablica 5. Usporedba propeptida prokolagena tipa I
 
 
Prokolagen je stoga 50% duža molekula od konačnog proteina, a njegova funkcija je sprječavanje prijevremene agregacije molekule kolagena u fibrile unutar stanice. Prije sazrijevanja kolagenskih fibrila, ovi tzv. C- i N-propeptidi cijepaju se s prokolagena tipa I specifičnim izvanstaničnim tkivnim endopeptidazama. C-terminalni propeptid prokolagena tipa I (PICP) je glikoprotein koji sadrži dva polipeptidna lanca (alfa1 I) od 246 i jedan polipeptidni lanac (alfa2 I) od 247 aminokiselinskih ostataka, s među- i unutarstaničnim disulfidnim vezama (115 kDa) (1,6,12,15). Ugljikohidratna komponenta C-terminalnog propeptida sadrži ostatke N-acetilglukozamina i manoze. PICP se metabolizira preko manoza-6-P receptora na endotelnim stanicama jetre (poluživot 6-8 minuta), a PINP pomoću receptora čistača. Svaka disfunkcija jetre može rezultirati promjenom jetrenog klirensa PICP, odnosno povećanim koncentracijama u cirkulaciji. Suprotno tome, djelovanje proupalnih citokina, koji reguliraju endocitozu preko sinusoidalnih stanica, može rezultirati smanjenim vrijednostima PICP. Opisan je također značajan genetski utjecaj na vrijednosti PICP, zatim diurnalni ritam s amplitudom od 20% (veće vrijednosti noću i niže u popodnevnim satima) i relativna stabilnost u uzorku (15 dana na +4 ºC, nekoliko mjeseci na -20ºC). PICP nije, dakle, ugrađen u koštani matriks, ali se otpušta u cirkulaciju gdje se može odrediti raznim imunokemijskim postupcima (RIA, ELISA). Smatra se da je stvaranje PICP u drugim tkivima puno sporije, pa se podrazumijeva da malo pridonosi cirkulirajućem poolu, iako ovaj podatak nije sasvim jasan.
U primarnom hiperparatiroidizmu su vrijednosti PICP unutar granica vrijednosti zdravih osoba (dok su npr. vrijednosti ALP i OC povećane). Kod bolesnika s osteomalacijom koji su primali vitamin D zabilježene su povećane vrijednosti kao i nakon paratireoidektomije. Smanjene vrijednosti PICP zabilježene su u bolesnika s osteogenesis imperfecta te u osoba na glukokortikoidnoj terapiji (1,2). Općenito, temeljem ispitivanja na raznim kliničkim modelima čini se da je PICP manje osjetljiv i specifičan od B-ALP i OC zbog relativne nespecifičnosti za kost i različitog klirensa.
Biljezi razgradnje kostiju
Osim TR-ACP (engl. tartrate-resistant acid phosphatase, tartarat rezistentna kisela fosfataza), biljezi razgradnje su razgradni produkti koštanog kolagena. Kako se izlučuju mokraćom, donedavno su se i određivali uglavnom u mokraći, uzorku uz koji je vezana značajna varijabilnost rezultata. Stoga je glavni znanstveni i komercijalni interes usmjeren na postavljanje i procjenu postupaka za njihovo mjerenje u serumu.
Poprečne veze kolagena
Serijom intra- i intermolekularnih kovalentnih veza (poprečnih veza), između terminalnoga nehelikalnog dijela jedne molekule kolagena i helikalnog dijela druge molekule kolagena, u koštanom se matriksu stabilizira molekula zrelog kolagena tipa I. Poprečne veze, u obliku 3-hidroksipiridinskog prstena, nastaju deaminacijom ε-aminoskupine lizina ili hidroksilizina, uz katalitičko djelovanje enzima lizil-oksidaze. Dvije su nereducibilne poprečne veze identificirane u mokraći ljudi: deoksipiridinolin (engl. deoxypyridinoline, DPD) koji nastaje reakcijom pokrajnjih lanaca dvije molekule hidroksilizina i jedne molekule lizina, te piridinolin (engl. pyridinoline, PYD) koji nastaje reakcijom pokrajnjih lanaca tri molekule hidroksilizina (oba spoja posjeduju prirodnu imunogenost i fluorescenciju) (2,6,7,12,16). DPD je nađen većinom u kostima, manje u dentinu, dok je PYD lokaliziran u kolagenskim fibrilama kosti i hrskavice te u manjoj mjeri u drugim tkivima (tetive, ligamenti, stjenke krvnih žila). Budući da kost ima najintenzivniju pregradnju, smatra se da je najvažniji izvor DPD i PYD. Kada se matriks kolagena proteolitički razgrađuje, obje vrste poprečnih veza otpuštaju se u cirkulaciju, a budući da su male molekulske mase, izlučuju se mokraćom gdje im se može mjeriti koncentracija. Oba tipa poprečnih veza izlučuju se kao slobodni (40%) i peptidno vezani (60%) aminokiselinski derivati. Opisani su neki biološki čimbenici koji mogu utjecati na vrijednosti DPD i PYD: cirkadijalni ritam naznačava maksimalne vrijednosti između 5 i 8 sati, a minimalne između 17 i 20 sati; menopauza, osteopenija ili duži boravak u krevetu nemaju utjecaja na vrijednosti; praćenjem u periodu od 15 mjeseci zabilježena je intraindividualna varijabilnost između 20 i 30%; kod muškaraca je visok linearni odnos između starosne dobi i izlučivanja ovih spojeva mokraćom, dok kod žena tako jasna ovisnost nije zabilježena; za vrijeme trudnoće povećava se vrijednost oko 91% od prvog trimestra do poroda. DPD se smatra specifičnijim biljegom razgradnje, budući da nastaje za vrijeme sazrijevanja kolagena (ne biosinteze, dakle pojavljuje se samo kao razgradni produkt zrelog matriksa), ne metabolizira se prije izlučivanja u mokraći. Njegov je glavni izvor kost i ne apsorbira se iz hrane (1,2,16,17).
Metode za mjerenje koncentracije DPD i PYD su HPLC i fluorometrijsko kvantificiranje te imunokemijski postupci. S ELISA tehnikom je moguće specifično mjeriti slobodni, nevezani i na peptid vezani oblik DPD. Tako dobivene vrijednosti DPD i PYD pokazuju visoku korelaciju (R > 0,95) s vrijednostima dobivenim s HPLC, metodom koja se smatra zlatnim standardom. Kao uzorak preporuča se druga jutarnja mokraća (između 8 i 10 sati) poslije 12-satnog posta. Izlaganjem uzorka UV svjetlu dolazi do brze razgradnje (t1/2 < 30 sekundi) obje poprečne veze, dok normalno dnevno svjetlo ne pokazuje tako izrazit učinak. Stabilnost biljega na -20 °C je 10-20 godina. Nije zabilježen niti značajniji pad vrijednosti ako se uzorci spreme na temperaturu nižu od 20 °C u periodu od 6 tjedana. Opetovano zamrzavanje i odmrzavanje uzorka ne utječe na vrijednosti DPD i PYD. U tablici 6. prikazane su prednosti i nedostatci poprečnih veza kolagena kao biljega razgradnje kostiju.
 
Tablica 6. Prednosti i nedostatci poprečnih veza kolagena
 
 
Bolesnici s neliječenim primarnim hiperparatiroidizmom pokazuju značajno povećane koncentracije poprečnih veza kolagena, koje koreliraju s ukupnom aktivnošću ALP i koncentracijom PTH. Bolesnici s tumorom sa i bez metastaza u kostima mogu se razlikovati istodobnim mjerenjem B-ALP i imunoreaktivnog PYD s točnošću od 0,89 (analiza ROC). Bolesnici s nedostatkom vitamina D pokazuju trostruko povećanje koncentracije poprečnih veza kolagena. Usporedba vrijednosti PYD i DPD između premenopauzalnih zdravih žena i postmenopauzalnih (osteopeničnih) žena pokazuje povećanje izlučivanja poprečnih veza kolagena mokraćom i do 105%. Izlučivanje PYD mokraćom povećano je kod 40% bolesnika s Pagetovom bolešću, dok je npr. ukupna aktivnost ALP unutar referentnog intervala. Povećane vrijednosti PYD u serumu ustanovljene su i kod bolesnika s bubrežnom osteodistrofijom te koreliraju s histomorfometrijskim pokazateljima razgradnje kostiju.
Hidroksiprolin (OHP)
S obzirom na karakteristike novijih specifičnijih biljega razgradnje kostiju, mjerenje tradicionalno korištenoga biokemijskog biljega hidroksiprolina (engl. hidroxyproline, OHP) ne preporučuje se zbog sljedećih nedostataka: OHP je nađen i u kolagenima drugih tkiva, u C1q, elastinu i acetilkolinesterazama; nije specifičan biljeg razgradnje budući da se otpušta i za vrijeme izvanstaničnog metabolizma novosintetiziranog (pro)kolagena; 90% OHP oksidacijom se metabolizira u jetri; izlučivanje OHP u mokraći izrazito je ovisno sadržaju kolagena u prehrani.
Telopeptidi kolagena tipa I (CTX, NTX)
Teorijska osnova za mjerenje telopeptidnih regija kolagena, umjesto poprečnih veza kolagena je činjenica da poprečno vezanje uvijek uključuje specifičnu domenu molekule, tzv. C- ili N-terminalni telopeptid. Kad se kolagen tipa I razgrađuje osteoklastima, N- i C-terminalni telopeptidni fragmenti, još uvijek pričvršćeni poprečnim vezama na helikalni fragment susjedne molekule, otpuštaju se u cirkulaciju i uklanjaju kroz bubrege (1,6,7,18,19). Pri tome se stvara višak razgradnih telopeptidnih produkata, budući da se cijepanje polipeptidnih lanaca može dogoditi na nekoliko mjesta unutar telopeptida. Telopeptidi mogu ili ne moraju biti poprečno vezani, može postojati nekoliko tipova poprečnog povezivanja, jedan ili više telopeptidnih lanaca može biti promijenjen beta-izomerizacijom, a i telopeptidi mogu biti već poprečno povezani na helikalnu kolagensku regiju. Za neke od razgradnih produkata postavljeni su i mjerni postupci. Postoji imunokemijski postupak za mjerenje C-terminalnog telopeptida kolagena (engl. C-telopeptide of type I collagen, CTX) u mokraći, točnije razgradnog produkta C-telopeptida koji koristi monoklonska protutijela protiv sintetskog oktapeptida koji sadrži poprečno vezano mjesto (Glu-Lys-Ala-His-beta-Asp-Gly-Gly-Arg), nazvano beta-CTX ili beta CrossLaps).
Koncentracije u mokraći povećane su u više od 1/3 žena u ranoj postmenopauzi. Nakon hormonske nadomjesne terapije vrijednosti se značajno smanjuju (do 61%). Moguće je i mjerenje neizomeriziranog oktapeptida u mokraći(alfa-CTX) te istodobno mjerenje alfa/beta CTX, kao indeksa pregradnje kostiju (indeks je povećan u Pagetovoj bolesti, a smanjen nakon terapije s bifosfonatima). Druga metoda je imunokemijski postupak za mjerenje CTX u serumu koji koristi monoklonska protutijela specifična za izomerizirani oblik sekvence (EKAHD-beta-GGR) iz alfa-1 lanca humanog kolagena tipa I (2,6,7). No, lipemičan serum može interferirati u ovom postupku, pohranjivanje uzorka na sobnoj ili temperaturi od +4 °C prate smanjene vrijednosti do 13%, a opetovano zamrzavanje i odmrzavanje rezultira smanjenom koncentracijom (10%). Prema dosadašnjim ispitivanjima koncentracije CTX pokazuju visoku specifičnost (100%) i osjetljivost (83,8%) u praćenju odgovora na antiresorpcijsku terapiju (nakon 6 mjeseci više od 92% žena na antiresorpcijskoj terapiji). Vrijednosti CTX odgovarajuće odražavaju lošu prognozu u multiplom mijelomu, a povezane su s težim radiografskim nalazima kod bolesnika s reumatoidnim artritisom. Visoke vrijednosti CTX povezane su s niskom koštanom masom kod bolesnika sa Crohnovom bolešću te pokazuju visoku učinkovitost u dijagnozi metastaza u kostima. Komercijalno je raspoloživ i mjerni postupak za N-telopeptidne fragmente kolagena (engl. N-telopeptide of type I collagen, NTX). Protutijela prepoznaju konformacijski epitop poprečno vezanog α2-N-telopeptida s određenom sekvencom (QYDGKGVG), koja je produkt osteoklastne proteolize. Opisan je cirkadijalni ritam vrijednosti, a zanimljivo je povećanje vrijednosti u zdravih žena za vrijeme folikularnog perioda i pad za vrijeme lutealne faze. Kod žena se vrijednosti povećavaju s godinama i veće su nego vrijednosti u odgovarajućoj dobnoj skupini muškaraca. Dosadašnji rezultati pokazuju da bi ovaj biljeg mogao biti značajan u procjeni razgradnje kostiju budući da izlučivanje N-terminalnog telopeptida mokraćom kod djece odražava razinu rasta, vrijednosti su značajno povećane kod bolesnica s postmenopauzalnom osteoporozom, vrijednosti izlučivanja adekvatno odražavaju supresiju pregradnje kostiju pomoću estrogenske nadomjesne terapije, kod osoba koje uzimaju bifosfonate vrijednosti mokraćnog izlučivanja N-terminalnog telopeptida odražavaju razgradnju kostiju specifičnije nego poprečne veze kolagena.
Tartarat-rezistentna kisela fosfataza (TR-ACP)
Kisele fosfataze su lizosomski enzimi raznih tkiva (trombociti, eritrociti, kost, prostata), koji hidroliziraju fosfomonoestere kod niske vrijednosti pH. U plazmi je otkriveno 5 izoenzimskih oblika enzima koji se razlikuju prema tkivnom i kromosomskom podrijetlu, kao i po molekularnoj masi te elektroforetskoj pokretljivosti. Prema elektoforetskoj pokretljivosti klasificiraju se kao izoenzimi 1-5, a prema osjetljivosti na inhibiciju s L(+)-tartaratom klasificiraju se dodatno na tartarat-osjetljive i tartarat-rezistentne oblike (6,11,20,21,22). Mjerenje ukupne aktivnosti TR-ACP u serumu kao biljega razgradnje kostiju ima dosta nedostataka (relativno mala aktivnost, prisutnost inhibitora, nestabilnost kod alkalnog pH, interferencija hemolize), stoga se ne preporuča za postavljanje dijagnoze.
TR-ACP tipa 5 stvaraju makrofagi (TR-ACP 5a; aktivnost povećana u Gaucherovoj bolesti i leukemiji vlasastih stanica) i osteoklasti (TR-ACP 5b; nema sijalinskih ostataka; aktivnost je povećana u bolestima kostiju, posebice osteopetrozi). Promjene TR-ACP tipa 5b u biti odražavaju broj aktivnih osteoklasta.
Većinom postupaka za mjerenje aktivnosti TR-ACP nije moguće razlikovati osteoklastni (izoforma 5b) oblik enzima od drugih oblika (izoforma 5a) koji se nalaze u plazmi. Nedavno postavljena dva postupka mjerenja TR-ACP 5b u fazi su evaluacije. To su kinetički postupak mjerenja u kojem se koristi inhibicija TR-ACP 5b s fluoridom, a TR-ACP 5a s heparinom te imunokemijski postupak koji koristi monoklonsko protutitijelo za TR-ACP 5b.
Aktivnost TR-ACP povećana je kod bolesnika s različitim oboljenjima (Tablica 7.), poglavito kod metastaza u kostima.
 
Tablica 7. Klinička stanja povezana s promjenama aktivnosti TR-ACP
 
 
Smatra se manje vrijednim biljegom razgradnje kostiju, posebno u praćenju bolesnika s Pagetovom bolešću koji su na terapiji bifosfonatima.
Mjerenje ukupne aktivnosti TR-ACP kao biljega razgradnje kostiju trenutno se ne preporuča zbog relativno male aktivnosti enzima i prisutnosti inhibitora u serumu, nestabilnosti pri alkalnijem pH, činjenice da je L(+) tartarat kompetitivni inhibitor i jake interferencije hemolize.
Hidroksilizin-glikozidi (Hyl-Glyc)
Galaktozil-hidroksilizin (GHL) i glukozil-galaktozil-hidroksilizin (GGHL) nastaju iz lizina za vrijeme postranslacijske faze sinteze kolagena, a otpuštaju se u cirkulaciju za vrijeme razgradnje kolagena. GHL je relativno specifičniji za razgradnju koštanog matriksa nego GGHL, a nedvojbeno više specifičan od npr. OHP. Stvarna prednost Hyl-Glyc kao biljega razgradnje je u tome što se ovi oblici ne metaboliziraju i nisu pod utjecajem čimbenika prehrane. U mokraći se mogu mjeriti metodom HPLC. Poželjno je postaviti prikladan imunokemijski postupak i svakako načiniti konačnu evaluaciju kliničke vrijednosti ovog biljega (1,6,12).
Ostali proteini koštanog matriksa
Manji je broj literaturnih podataka o dva proteina matriksa koji, kako se čini, imaju određeni potencijal kao biljezi pregradnje kosti.
Osteonektin je sekrecijski Ca-vezujući glikoprotein koji je nađen u raznim stanicama, uključujući osteoblaste, endotelne stanice i fibroblaste. Prisutan je u aktivnim osteoblastima i mladim osteocitima (ali ne i u mirnim/tihim osteocitima) pa se smatra pogodnim biljegom diferenciranja osteogenih stanica kosti, ukazujući na izgradnju kostiju. Međutim, budući da je prisutan i u većem broju vezivnih tkiva te u trombocitima, smanjena mu je uloga kao cirkulirajućeg biljega.
Koštani sijaloprotein (engl. Bone Sialoprotein, BSP) je fosforilirani glikoprotein, značajno postranslacijski modificiran, a sintetiziraju ga osteoblasti i odontoblasti. Suprotno drugim fosforiliranim glikoproteinima koštanog matriksa (osteonektin), BSP je relativno ograničen na kost. Stimulira stvaranje hidroksiapatita in vitro, a pretpostavlja se da djeluje i kao stanična adhezijska molekula omogućujući stanicama (osteoklastima) da se pričvrste na izvanstanični matriks. Za sada su raspoloživi samo preliminarni rezultati o procjeni vrijednosti ovog biljega koštane pregradnje (ELISA) kod bolesnika s ranim reumatoidnim artritisom (povećana vrijednost u serumu) kao i u sinovijalnoj tekućini bolesnika s reumatoidnim artritisom kod kojih je uznapredovao poremećaj funkcije zgloba (nađene su veće vrijednosti nego u bolesnika s očuvanom strukturom zgloba). Opažena je također povećana koncentracija cirkulirajuće frakcije u postmenopauzalnih žena u usporedbi s premenopauzalnim referentnim vrijednostima (1). Kao dobar pokazatelj mogućih fraktura i koštane mase spominje se i katepsin K, koji je cisteinska proteaza, važna u procesu razgradnje kostiju (23,24,25).
Na temelju literaturnog pregleda može se zaključiti:
Mjerenje aktivnosti B-ALP ima prednost pred mjerenjem ukupne aktivnosti ALP zbog veće dijagnostičke osjetljivosti i specifičnosti. Imunokemijski postupci za mjerenje B-ALP pokazuju križnu reaktivnost (14-20%) s jetrenom ALP. Međutim, to ne umanjuje kliničku korisnost ovog mjerenja, osim kod bolesnika s teškim oblicima bolesti jetre.
OC je protein specifičan za kost, ali pokazuje brojne nedostatke u smislu nestabilnosti u uzorku i neusklađenosti rezultata dobivenih raznim mjernim postupcima. Međutim, u nekim situacijama (kortikosteroidna osteopenija, odsutnost razorene strukture kosti), OC može poslužiti kao osjetljivi biljeg koštane pregradnje.
Izlučivanje poprečnih veza kolagena mokraćom djelomično je evaluirano u analitičkom smislu i u smislu kliničke korisnosti na temelju čega se smatra da ovaj biljeg može zamijeniti mjerenje OHP kao postupak izbora za procjenu razgradnje kosti.
Ostali razgradni produkti telopeptida kolagena tipa I (NTX, CTX) mjere se kao pokazatelji razgradnje kostiju, ali još uvijek zahtijevaju detaljnu evaluaciju, posebno u smislu njihova izvankoštanog klirensa i mogućih drugih izvora izvan kosti. Njihova klinička korisnost varira ovisno o skupini bolesnika koja se ispituje.
Mjerenje aktivnosti TR-ACP ne preporučuje se za upotrebu.
U tablici 8. sažeto je prikazana dosadašnja prosudba kliničke korisnosti biljega pregradnje kostiju.
 
Tablica 8. Kritička prosudba kliničke korisnosti biljega pregradnje kostiju
 
 
Za izbor biljega pregradnje kostiju važna je mogućnost međulaboratorijske usporedivosti rezultata i dobra definicija biljega koji će se koristiti. Bitno je uspostaviti referentne intervale, standardizirati mjerne postupke, odrediti točan koncept kvalitete osiguranja, pokušati smanjiti individualnu varijabilnost mjerenjem biljega u serumu, a ne u mokraći, automatizirati mjerne postupke odgovarajućom kalibracijom, te ustanoviti stabilnost ključnih reagensa.
S obzirom na zastupljenost osteoporoze u široj populaciji te vrste primijenjene antiresorpcijske terapije, IOF (engl. International Osteoporosis Foundation) 2000. godine objavila je preporuke o korištenju vrste (biljezi izgradnje kostiju B-ALP, OC i PINP u serumu; biljezi razgradnje kostiju NTX u mokraći, CTX u serumu i mokraći, DPD u mokraći) i broja koštanih biljega, uzorkovanju i intervalima mjerenja koncentracije biljega za vrijeme terapije te graničnim vrijednostima s obzirom na procjenu rizika nastanka prijeloma i moguće malignosti. Preporuka je koristiti jedan koštani biljeg ili jedan biljeg izgradnje i jedan biljeg razgradnje kostiju, pri čemu se prednost daje mjerenju biljega u serumu. Krv treba uzeti natašte prije 9 sati; ako se biljeg mjeri u mokraći, preporuka je koristiti prvi ili drugi jutarnji uzorak mokraće. Preporuča se mjerenje biljega izgradnje kostiju prije i nakon 6 mjeseci terapije, a biljega razgradnje kostiju prije i nakon 3 ili 6 mjeseci terapije (25).
 
Zaključak
 
Zaključno treba naglasiti da je i nadalje neosporna potreba dugotrajnih longitudinalnih ispitivanja biokemijskih biljega pregradnje kostiju na velikom broju ispitanika uz korelaciju s referentnim postupkom mjerenja koštane mase. Potrebna će nadalje biti racionalizacija korištenja biljega ili kombinacije biljega za odgovarajuću bolest kostiju kako bi se uklonili oni s niskom kliničkom korisnošću. Najveći izazov za skoru budućnost je dakako kombinacija genetičkih i biokemijskih biljega u procjeni rizika osteoporoze te ostalih bolesti kostiju.
 
Literatura
 
 1.   Seibel MJ, Woitge WH. Biochemical markers of bone metabolism - Update 1999; Part I: Basic principles. Clin Lab 1999;45:237-56.
 2.   Seibel MJ. Biochemical markers of bone turnover Part I: Biochemistry and variability. Clin Biochem Rev 2005;26:97-122.
 3.   Engler H, Koeberle D, Thuerlimann B, Senn HJ, Riesen WF. Diagnostic and prognostic value of biochemical markers in malignant bone disease: A prospective study on the effect of biphosphonate on pain intensity and progression of malignant bone disease. Clin Chem Lab Med 1998;36 879-85.
 4.   Demers LM. Clinical usefulness of markers of bone resorption and formation. Scand J Clin Lab Invest 1997;57(suppl. 227):12-20.
 5.   Withold W. Monitoring of bone turnover biological, preanalytical and technical criteria in assessment of biochemical markers. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1996;34:785-99.
 6.   Cundy T, Reid IR, Grey A. Metabolic bone disease. In: Clinical Biochemistry. Metabolic and Clinical Aspects. Marshall JW, Bangert S. 2nd ed. London, New York, Oxford: Churchill Livingstone,Elsevier Edinburgh: 2008:629-59.
 7.   Kasperk C, Ziegler R. Bone and mineral metabolism. In: Clinical Laboratory Diagnostics. Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. Thomas L. ed. Frankfurt/Main: TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, 1998:215-30.
 8.   Delmas PD. Biochemical markers of bone turnover in Paget’s disease of bone. J Bone Miner Res 1999;14:66-9.
 9.   Price CP, Thompson PW. The role of biochemical tests in the screening and monitoring of osteoporosis. Ann Clin Biochem 1995;32:244-60.
10.   Price CP, Milligan TP, Darte C. Direct comparison of performance characteristics of two immunomethods for bone isoforms of alkaline phosphatase in serum. Clin Chem 1997;43:2052-7.
11.   Lee AJ, Hodges S, Eastell R. Measurement of osteocalcin. Ann Clin Biochem 2000;37:432-46.
12.   Collins A, Cashman KD, Kiely M. Phylloquinone (vitamin K1) intakes and serum undercarboxylated osteocalcin levels in Irish postmenopausal women. Br J Nutr 2006;95:982-8.
13.   Kent NG. Markers of bone turnover. JIFCC 1997;9(1):31-4.
14.   Szulc P, Arlot M, Chapuy MC, Duboeuf F, Meuiner PJ, Delmas PD. Serum undercarboxylated osteocalcin correlates with hip bone mineral density in elderly women. J Bone Miner Res 1994;9:1591-5.
15.   Vergnaud P, Garnero P, Meunier PJ, Breart G, Kamihagi K, Delmas PD. Undercarboxylated osteocalcin measured with a specific immunoassay predicts hip fracture in elderly women: the EPIDOS Study. J Clin Endocrinol Metab 1997;82:719-24.
16.   Risteli J, Risteli L. Methods of type I procollagen domains and collagen fragments: Problems to be solved and future trends. Scand J Clin Lab Invest 1997;57(suppl. 227):105-13.
17.   James IT, Walne AJ, Perrett D. The measurement of pyridinium crosslinks: a methodological overview. Ann Clin Biochem 1996;33:397-420.
18.   Takahashi M, Kawana K, Nagano A. Biological variability of biochemical markers of bone turnover in healthy women. Endocr Res 2002;28:257-64.
19.   Christgau S, Bitsch-Jensen O, Bjarnason NH, Gamwell Henriksen E, Qvist P, Alexandersen P, Bang Henriksen D. Serum CrossLaps for monitoring the response in individuals undergoing antiresorptive therapy. Bone 2000;26:505-11.
20.   Looker AC, Bauer DC, Chesnut CH 3rd, Gundberg CM, Hochberg MC, Klee G, et al. Clinical use of biochemical markers of bone remodeling: current status and future directions. Osteoporosis Int. 2000;11: 467-80.
21.   Janckil AJ. Takahashi K, Sun SZ, Yam LT. Tartarate-resistant acid phosphatase isoform 5b as serum marker for osteoclastic activity. Clin Chem 2001;47(1):74-80.
22.   Garnero P, Buchs N, Zekri J, Rizzoli R, Coleman RE, Delmas PD. Markers of bone turnover for the managament of patients with bone metastases from prostate cancer. British J of Cancer 2000;82:858-64.
23.   Nakanishi M, Yoh K, Miura T, Ohasi T, Rai SK, Uchida K. Development of a kinetic method for band 5b tartarate-resistant acid phosphatase activity in serum. Clin Chem 2000;46:469-73.
24.   Holzer G, Noske H, Lang T, Holzer L, Willinger U. Soluble cathepsin K: A novel marker for the prediction of nontraumatic fractures? J Lab and Clin Med 2005;146:13-7.
25.   Stoch SA, Wagner JA. Cathepsin K inhibitors: A novel target for osteoporosis therapy. Clin Pharmacol and Therapeutics 2008;83:172-6.
26.   Vasikaran SD. Utility of biochemical markers of bone turnover and bone mineral density in management of osteoporosis. Crit Rev Clin Lab Sci 2008;45:221-58.
27.   Delmas PD, Eastell R, Garnero P, Seiber MJ, Stepan J. For the Committee of Scientific Advisors of the International Osteoporosis Foundation. The use of biochemical markers of bone turnover in osteoporosis. Osteoporosis Int 2000:Suppl 6:S2-17.