Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Izvorni stručni članak

 

Marija Miloš1, Gordana Boršo2, Dubravka Čvorišćec1. Citometrijsko razlikovanje podrijetla hematurije uporabom antitijela na glikoforin A. Biochemia Medica 2008;18(2):206-15.

1 Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu i Klinički bolnički centar Zagreb, Zagreb

2 Zavod za nefrologiju i arterijsku hipertenziju, Klinika za unutarnje bolesti, Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu i Klinički bolnički centar Zagreb, Zagreb

 

*Adresa za dopisivanje: marijamilos1 [at] yahoo [dot] com

 

Sažetak

Uvod: Laboratorijsko razlikovanje glomerularne i neglomerularne hematurije godinama se uglavnom temelji na ispitivanju morfologije eritrocita u mokraći. Za razliku od eritrocita iz donjih mokraćnih puteva koji su intaktni, pravilnih oblika, glomerularni eritrociti su manji i imaju nepravilne i složene oblike. U ovom radu je ispitana mogućnost razlikovanja podrijetla hematurije protočnom citometrijom, mjerenjem parametara ovisnih o morfološkim značajkama eritrocita u mokraći nakon obilježavanja eritrocita fluorescentnim monoklonskim antitijelima na glikoforin A.

Materijali i metode: Svježi uzorci mokraće od ukupno 31 bolesnika s dokazanim glomerularnim i 31 bolesnika s dokazanim urološkim bolestima analizirani su na protočnom citometru FACScan (Becton Dickinson, San Jose, SAD). Eritrociti su izdvojeni od ostalih stanica i nestaničnih elemenata u mokraći bojenjem fluorescentnim monoklonskim antitijelima na glikoforin A, a zatim su mjereni intenziteti rasapa svjetlosti u smjeru ulazne zrake (engl. forward scatter, FSC) i okomito na smjer ulazne zrake (engl. side scatter, SSC), te je izračunat omjer SSC/FSC. FSC je bio mjera veličine, a SSC mjera oblika eritrocita.

Rezultati: Nađena je statistički značajna razlika u izmjerenim vrijednostima FSC (P < 0,001), SSC (P = 0,016), kao i u omjeru SSC/FSC (P < 0,001) između dviju skupina bolesnika. Prema ROC analizi (engl. Receiver Operating Characteristic) dobiveni su slijedeći rezultati: za FSC (granična vrijednost za glomerularnu hematuriju FSC ≤ 49) dijagnostička osjetljivost 90,3% i specifičnost 83,9%; za SSC (granična vrijednost za glomerularnu hematuriju SSC > 73) dijagnostička osjetljivost 83,9% i specifičnost 61,3%; za omjer SSC/FSC (granična vrijednost za glomerularnu hematuriju SSC/FSC > 2,42) dijagnostička osjetljivost 83,9% i specifičnost 90,3%.

Zaključak: Opisana metoda analize eritrocita protočnom citometrijom je jednostavna, automatizirana tehnika za razlikovanja podrijetla hematurije. U odnosu na metodu ispitivanja morfologije eritrocita daje objektivnije i pouzdanije podatke, te omogućuje usmjeravanje bolesnika prema urološkoj, odnosno nefrološkoj problematici.

Ključne riječi: glomerularna hematurija, neglomerularna hematurija, protočna citometrija

Pristiglo: 12. studenog 2007.                                                                                                                      Prihvaćeno: 5. travnja 2008.

 

 

Uvod

Asimptomatska mikrohematurija je čest nalaz u općoj populaciji. Učestalost je, prema različitim ispitivanjima, od 0,19% do 16,1%, ovisno o dobi i spolu promatrane populacije, duljini praćenja i broju ispitivanja po bolesniku. Kod starijih muškaraca, koji imaju veći rizik za teže urološke bolesti, učestalost asimptomatske mikrohematurije je 21% (1). Mikrohematurija može biti posljedica benignih stanja bezopasnih za život bolesnika, ali i simptom ozbiljnih bolesti (2,3). S obzirom na to da se u 10-15% bolesnika s hematurijom nađe tumor bubrega, mokraćnog mjehura ili prostate, hematurija se mora smatrati znakom ozbiljne bolesti, dok se ne utvrdi suprotno. Mikrohematurija može biti glomerularna ili neglomerularna. Eritrociti podrijetlom iz glomerula imaju morfološki različite oblike koje nazivamo dismorfičnim eritrocitima. Manji su od eritrocita podrijetlom iz donjih mokraćnih putova, koji su morfološki slični eritrocitima iz periferne krvi (izomorfični eritrociti). Jednom otkrivena hematurija se mora potvrditi jedanput ili dvaput u kratkom razdoblju, te je potrebno odrediti njeno podrijetlo (4-7).

Morfologija eritrocita u mokraći već desetljećima ispituje se pod svjetlosnim i fazno-kontrastnim mikroskopom. Automatizirane metode (protočni citometri za analizu mokraće, mjerenje MCV na hematološkim analizatorima) daju objektivniji rezultat, ali se kao nedostatak pojavljuje interferencija tzv. urinarnog debria, tj. staničnih i nestaničnih elemenata u mokraći koji su po svojoj veličini slični eritrocitima. Mi smo u ovom radu izbjegli ovu interferenciju predhodnim obilježavanjem eritrocita fluorescentnim monoklonskim antitijelom na glikoforin A (Gly A), molekulu znakovitu za eritroidnu lozu, smještenu na vanjskoj površini stanične membrane. Nakon toga smo eritrocite analizirali na protočnom citometru mjereći parametre koji su mjera morfoloških značajka eritrocita, pa tako i mogući pokazatelji podrijetla eritrocita.

 

Materijali i metode

Ispitanici i uzorci

Ispitivanjem su obuhvaćene dvije skupine bolesnika s hematurijom koji su boravili na Zavodu za nefrologiju i hipertenziju Klinike za unutarnje bolesti KBC Zagreb, te na Klinici za urologiju KBC Zagreb (tablica 1.). Skupina 1 se sastojala od 31 bolesnika (20 muškaraca i 11 žena) kojima je biopsijom bubrega dokazana glomerularna bolest (intenzitet hematurije u sedimentu mokraće: 11 bolesnika s < 5 eritrocita po vidnom polju (veliko povećanje 400×), 11 bolesnika s 5-15 eritrocita po vidnom polju, 9 bolesnika s > 15 eritrocita po vidnom polju). Skupina 2 se sastojala od 31 bolesnika (15 muškaraca i 16 žena) s dijagnosticiranim urološkim bolestima (intenzitet hematurije u sedimentu mokraće: 8 bolesnika s < 5 eritrocita po vidnom polju, 11 bolesnika s 5-15 eritrocita po vidnom polju, 12 bolesnika s > 15 eritrocita po vidnom polju), kod kojih nije napravljena biopsija bubrega.

Svim ispitanicima su uzeti uzorci druge jutarnje mokraće koji su analizirani unutar jednog sata. Za bolesnike iz skupine 1 uzorci su uzimani prije biopsije.

Istraživanje je odobrilo bolničko etičko povjerenstvo.

 

Tablica 1. Značajke ispitivanih bolesnika

 

Priprema uzoraka

Za analizu su uzeta dva alikvota od po 10 mL mokraće i centrifugirana 10 min na 2500 okr/min. Supernatanti su odliveni, te su sedimenti dva puta isprani s 5 mL fosfatnog pufera pH 7,0 i svaki puta ponovno centrifugirani pod istim uvjetima. Nakon centrifugiranja je u jednu epruvetu dodano 10 mL antitijela na Gly A izravno vezanog na fluorescentnu boju fikoeritrin (RPE-Conjugated Monoclonal Mouse Anti-Human Glycophorin A, Dako A/S Denmark) (100 mg/L), a u drugu epruvetu koja je predstavljala negativnu kontrolu dodano je 10 mL mišjeg IgG1 izravno vezanog na fluorescentnu boju fikoeritrin (RPE-Conjugated Mouse IgG1 Negative Control for Flow Cytometry, Dako A/S Denmark) (100 mg/L). Nakon inkubacije od 10 min na sobnoj temperaturi ponovljen je postupak ispiranja s 3 mL fosfatnog pufera pH 7,0, centrifugiranja pod istim uvjetima, te odlijevanja supernatanta. Konačno su stanice resuspendirane u 500 mL fosfatnog pufera pH 7,0.

 

Analizator i metoda

Predhodno pripremljeni uzorci mokraće analizirani su na protočnom citometru FACScan u programu CellquestTM (Becton Dickinson, San Jose, SAD), uz argonski laser kao izvor svjetlosti valne duljine 488.

Od ukupnog broja od 10.000 stanica izdvojeni su eritrociti kao stanice s pozitivnom fluorescencijom, te su im izmjereni slijedeći parametri: rasap svjetlosti u smjeru ulazne zrake (engl. forward scatter, FSC) i rasap svjetlosti okomit na smjer ulazne zrake (engl. side scatter, SSC). Instrument je automatski računao srednji FSC i SSC za svaki uzorak. FSC je parametar proporcionalan veličini stanice, a SSC je kao parametar ovisan o stupnju granuliranosti, tj. složenosti unutarnje strukture stanice ili složenosti jezgre stanice, bio mjera oblika eritrocita, budući da je eritrocit stanica bez jezgre. Na kraju je izračunat i omjer SSC/FSC kako bi se izbjegao utjecaj veličine eritrocita na oblik.

 

Statistička analiza

Za statističku obradu podataka primijenjen je statistički program GraphPadPrism 5 (GraphPad Software, Inc., USA) verzija 5.01. Za ispitivanje normalnosti raspodjele podataka primijenjen je Kolmogorov-Smirnovljev test. Podaci koji slijede normalnu raspodjelu prikazani su aritmetičkom sredinom i standardnom devijacijom, a podaci s asimetričnom raspodjelom prikazani su medijanom i interkvartilnim rasponom. Statistička značajnost razlike među skupinama ispitana je pomoću Mann-Whitney testa. Kriterij za statističku značajnost bio je P < 0,05. ROC analiza (engl. Receiver Operating Characteristic) je upotrijebljena za procjenu dijagnostičkih mogućnosti mjerenih parametara.

 

Rezultati

Rezultati mjerenja FSC i SSC na protočnom citometru, kao i omjera SSC/FSC prikazani su u tablici 2. Nađena je statistički značajna razlika za sva tri parametra između dviju skupina bolesnika.

 

Tablica 2. Rezultati analize na protočnom citometru

 

Rezultati ROC analize prikazani su u tablici 3. Za sva tri parametra prikazane su dobivene površine ispod krivulje (engl. area under the curve, AUC) s pripadajućim 95%-tnim intervalima pouzdanosti, optimalne granične vrijednosti, te vrijednosti za dijagnostičku osjetljivost i specifičnost. Dobivena je statistički značajna razlika između dobivenih AUC za FSC i SSC (P = 0,013), te za omjer SSC/FSC i SSC (P < 0,001), dok razlika između dobivenih AUC za FSC i omjer SSC/FSC nije bila statistički značajna. Na slici 1. prikazane su ROC krivulje za FSC, SSC i omjer SSC/FSC, s graničnim vrijednostima za glomerularnu hematuriju.

 

Tablica 3. Rezultati ROC analize

 

 

Slika 1. ROC krivulje za razlikovanje podrijetla hematurije pomoću vrijednosti FSC, SSC i omjera SSC/FSC

 

Znakoviti rezultati analize mokraće protočnom citometrijom kod bolesnika s glomerularnom i neglomerularnom

 hematurijom prikazani su na slici 2. Za bolesnika s glomerularnom hematurijom dobivene su slijedeće vrijednosti: FSC = 31,2; SSC = 110,4; SSC/FSC = 3,54; a za bolesnika s neglomerularnom hematurijom FSC = 65,8; SSC = 36,5; SSC/FSC = 0,54.

 

Slika 2. Tipičan nalaz analize mokraće na protočnom citometru kod bolesnika s glomerularnom i neglomerularnom hematurijom: FSCxSSC (A), raspodjela eritrocita prema FSC (B) i SSC (C).

 

Na slici 3. prikazan je primjer analize dvaju uzoraka mokraće od istog bolesnika uzetih prije i neposredno poslije biopsije bubrega. Radilo se o bolesniku iz skupine 1 s dokazanom bolesti glomerula. U uzorku mokraće uzetom prije biopsije dobivene su slijedeće vrijednosti: FSC = 40,7; SSC = 99,9; SSC/FSC = 2,45; a u uzorku mokraće uzetom neposredno nakon biopsije FSC = 78,2; SSC = 69,4; SSC/FSC = 0,89.

 

Slika 3. Primjer nalaza mokraće na protočnom citometru kod istog bolesnika prije i nakon biopsije bubrega: FSCxSSC (A), raspodjela eritrocita prema FSC (B) i SSC (C).

 

Rasprava

Pouzdano otkrivanje podrijetla hematurije ima veliko kliničko značenje. Mikroskopske tehnike su jeftine, ali komplicirane, nereproducibilne i subjektivne (1,8-15). Objektivnije, automatizirane metode (protočni citometri za analizu mokraće, mjerenje MCV na hematološkim analizatorima) su ograničene interferencijom tzv. urinarnog debria (16-25).

U ovom smo radu ispitali metodu analize mokraće protočnom citometrijom kao metodom za razlikovanje podrijetla hematurije, uz predhodno bojanje eritrocita fluorescentnim antitijelima na GlyA, čime je izbjegnuta interferencija urinarnog debria. Nakon izdvajanja eritrocita mjereni su parametri koji su pokazatelji morfoloških značajka eritrocita u mokraći: FSC kao pokazatelj veličine eritrocita i SSC kao pokazatelj složenosti oblika eritrocita. Također se izračunao omjer SSC/FSC kao mogući bolji pokazatelj morfoloških značajka eritrocita. Metoda nije dosad opisana u literaturi. Tanaka i sur. su opisali metodu obilježavanja eritrocita fluorescentnim antihemoglobinskim antitijelima (26). Kao što je poznato, hemoglobin je smješten unutarstanično, pa je za obilježavanje bila potrebna predhodna permeabilizacija stanične membrane eritrocita, što kod antitijela na Gly A nije slučaj, jer je Gly A smješten na površini stanice eritrocita.

Mjerenjem parametara FSC i SSC te izračunavanjem omjera SSC/FSC dobivene su statistički značajne razlike u rezultatima između skupine bolesnika s glomerularnom i neglomerularnom hematurijom (tablica 2.).

ROC analiza je pokazala mogućnost pouzdanog razlikovanja između dviju skupina bolesnika mjerenjem parametara protočne citometrije, osobito FSC i omjera SSC/FSC (tablica 3., slika 1.). Primjerice, prema omjeru SSC/FSC, od 31 bolesnika iz skupine 1 glomerularna hematurija je potvrđena kod njih 26 (osjetljivost 83,9%), dok su kod 5 ispitanika dobiveni rezultati ukazivali na neglomerularnu hematuriju (16,1% lažno negativnih rezultata). Kod 3 od 5 ispitanika nađena je hematurija niskog intenziteta (1+ na test traci, < 5 eritrocita po vidnom polju uz veliko povećanje u sedimentu mokraće), što bi moglo biti razlogom za lažno negativne rezultate. Lažno pozitivni rezultati glomerularne hematurije dobiveni su kod 3 ispitanika (9,7%) iz skupine 2 (specifičnost 90,3%). Kod 2 ispitanika je pokazana visoka osmolalnost mokraće (626 i 951 mOsmol/kg), što je mogući uzrok promjene u obliku eritrocita, pa tako i lažno pozitivnog rezultata za glomerularnu hematuriju.

Kod glomerularne hematurije zapažene su prosječno niže vrijednosti FSC i više vrijednosti SSC u odnosu na neglomerularnu hematuriju. Također su dobivene više vrijednosti omjera SSC/FSC kod glomerularne hematurije. Ovakvi su rezultati potvrdili pretpostavke o „glomerularnim“ eritrocitima koji su manji po veličini, ali imaju nepravilne oblike, za razliku od „neglomerularnih“ eritrocita koji su veći i imaju pravilan oblik. Na slici 2. u dvoparametrijskom prikazu FSC×SSC kod bolesnika s glomerularnom hematurijom (A) jasno se vidi stanična populacija s relativno niskim vrijednostima FSC i širokom distribucijom po ordinati koja predstavlja vrijednosti SSC. Kod bolesnika s neglomerularnom hematurijom, međutim, eritrociti su u prikazu  FSC×SSC smješteni potpuno drukčije, s niskim vrijednostima SSC i višim vrijednostima FSC.

U primjeru na slici 3A. vidi se jasno pojava nove populacije eritrocita u uzorku istog bolesnika uzetom nakon biopsije bubrega u usporedbi s uzorkom uzetim prije biopsije. Zbog toga su i dobiveni rezultati mjerenja bili potpuno različiti prije i poslije biopsije, što bi moglo dovesti do pogrešne interpretacije da se radi o neglomerularnoj hematuriji. Radi se, međutim, o bolesniku s glomerularnom bolešću kod kojeg se zbog invazivnog dijagnostičkog postupka pojavila populacija neglomerularnih eritrocita u mokraći, što je prolazna pojava i predstavlja miješanu hematuriju. Program za analizu na protočnom citometru omogućava uočavanje ovakvih slučajeva, ali i zasebnu analizu i praćenje dviju populacije eritrocita kod miješane hematurije.

Prema pokazanim rezultatima, opisana metoda na protočnom citometru omogućava pouzdano razlikovanje podrijetla eritrocita u mokraći. Bilo bi, međutim, korisno potvrditi dobivene rezultate na većem broju ispitanika, kao i ispitati osjetljivost metode kod blage hematurije, tj. malog broja eritrocita u mokraći. Ograničenje ovoga ispitivanja svakako je činjenica da ispitanici iz skupine 2 nisu bili podvrgnuti biopsiji bubrega, pa moguća glomerularna bolest kod njih nije bila isključena. Kao i kod ostalih metoda za razlikovanje podrijetla hematurije potrebno je analizu provesti u kratkom razdoblju nakon uzorkovanja, pogotovu kod izrazito koncentriranih ili razrijeđenih uzoraka mokraće. Opisana metoda je objektivna i jednostavna, te je primjenjiva u svakodnevnom rutinskom radu laboratorija. Kliničarima daje mogućnost bržeg usmjeravanja bolesnika prema nefrološkoj odnosno urološkoj problematici, kao i izbjegavanje skupih i invazivnih dijagnostičkih postupaka koji se provode kako bi se otkrio uzrok hematurije. Laboratorijskim pak stručnjacima predstavlja mogućnost nove primjene protočne citometrije, i to u području urologije i nefrologije.

 

Zahvala

Neizmjerno smo zahvalni preminuloj kolegici dr. sci. Branki Užarević za njezin doprinos ovom radu, korisnim savjetima i pomoći na području protočne citometrije.

 

Literatura

1.     Grossfeld GD, Wolf JS, Litvin MS, Hricak H, Shuler CL, Agerter DC, et al. Asymptomatic microscopic hematuria in adults: summary of the AUA Best Practice Policy Recommendations. Am Fam Physician 2001;63:1145-54.

2.     Rockall AG, Newman-Sanders APG, Al-Kutoubi MA, Vale JA. Haematuria. Postgrad Med J 1997;73:129-36.

3.     Guder WG, Hofmann W. Urinproteindiagnostik. In: Thomas L, Fateh-Moghadam A, Guder WG, Hofmann W, Reiber H, Lammers M, eds. Proteindiagnostik Diagnose Therapiekontrolle. Frankfurt/Main: Behringwerke AG; 1991. pp.110-39.

4.     Schröder FH. Microscopic haematuria. Br Med J 1994;309:70-2.

5.     Thomas L, Boege F. Kidney and urinary tract. In: Thomas L, ed. Clinical laboratory diagnostics. 1st ed. Frankfurt/Main: TH-Books-Verl.-Ges; 1998. pp.362-400.

6.     Thaller TR, Wang LP. Evaluation of asymptomatic microscopic hematuria in adults. Am Pham Physician 1999;60:1143-54.

7.     Jaffe JS, Ginsberg PC, Gill R, Harkaway RC. A new diagnostic algorithm for the evaluation of microscopic hematuria. Urology 2001;57:889-94.

8.     Fasset RG, Horgan BA, Mathew TH. Detection of glomerular bleeding by phase-contrast microscopy. Lancet 1982;1:1432-4.

9.     Kőhler H, Wandel E, Brunck B. Acanthocyturia – a characteristic marker for glomerular bleeding. Kidney Int 1991;40:115-20.

10.   Mohammad KS, Bdesha AS, Snell ME, Witherow RON, Coleman DV. Phase contrast microscopic examination of urinary erythrocytes to localise source of bleeding: an overlooked technique? J Clin Pathol 1993;46:642-5.

11.   Lettgen B, Wohlmuth A. Validity of G1-cells in the differentiation between glomerular and non-glomerular haematuria in children. Pediatr Nephrol 1995;9:435-7.

12.   Dinda AK, Saxena S, Guleria S, Tiwari SC, Dash SC, Srivastava RN, et al. Diagnosis of glomerular haematuria: role of dysmorphic red cell, G1 cell and bright-field microscopy. Scand J Clin Lab Invest 1997;57:203-8.

13.   Fogazzi GB, Ponticelli C, Ritz E. The formed elements of the urinary sediment. In: Fogazzi GB, Ponticelli C, Ritz E, eds. The urinary sediment. 2nd ed. Milan: Masson S.p.A.; 1999. pp.29-134.

14.   Zaman Z, Proesmans W. Dysmorphic erythrocytes and G1 cells as markers of glomerular hematuria. Pediatr Nephrol 2000;14:980-4.

15.   Nagahama D, Yoshiko K, Watanabe M, Morita Y, Iwatani Y, Matsuo S. A useful new classification of dysmorphic urinary erythrocytes. Clin Exp Nephrol 2005;9:304-9.

16.   Shichiri M, Oowada A, Nishio Y, Tomita K, Shiiga T. Use of autoanalyser to examine urinary-red-cell morphology in the diagnosis of glomerular haematuria. Lancet 1986;2:781-2.

17.   Docci D, Delvecchio C, Turci A, Turci F, Baldrati L, Martinelli A. Detection of glomerular bleeding by urinary-red-cell-size distribution. Nephron 1988;50:380-2.

18.   DeMetz M, Schiphorst PP, Go RIH. The analysis of erythrocyte morphologic characteristics in urine using a hematologic flow cytometer and microscopic methods. Am J Clin Pathol 1991;95:257-61.

19.   Hyodo T, Kumano K, Haga M, Sakai T, Fukuda M, Isami Y, et al. The validity of the criteria to differentiate the origin of hematuria in the automated urinary flow cytometer. Nephron 1997;75:112.

20.   Hyodo T, Kumano K, Sakai T. Differential diagnosis between glomerular and nonglomerular hematuria by automated urinary flow cytometer. Nephron 1999;82:312-23.

21.   Kore RN, Dow CS, Desai KM. A new automated system for urine analysis: a simple, cost-effective and reliable method for distinguishing between glomerular and nonglomerular sources of haematuria. BJU International 1999;84:454-60.

22.   Game X, Soulie M, Fontanilles AM, Benoit JM, Corberand JX, Plante P. Comparison of red blood cell volume distribution curves and phase-contrast microscopy in localization of the origin of hematuria. Urology 2003;61:507-11.

23.   Kaneko K, Murakami M, Shiraishi K, Matsumoto M, Yamauchi K, Kitagawa T, et al. Usefulness of an automated urinary flow cytometer in mass screening for nephritis. Pediatr Nephrol 2004;19:499-502.

24.   Kincaid-Smith P, Fairley K. The investigation of hematuria. Semin Nephrol 2005;25:127-35.

25.   Scharnhorst V, Gerlag PG, Nanlohy Manuhutu ML, van der Graaf F. Urine flow cytometry and detection of glomerular hematuria. Clin Chem Lab Med 2006;44:1330-4.

26.   Tanaka M, Kitamoto Y, Sato T, Ishii T. Flow cytometric analysis of hematuria using fluorescent antihemoglobin antibody. Nephron 1993;65:354-8.