Contact

Ana-Maria Šimundić
Editor-in-Chief
Clinical Institute of Chemistry
Sestre milosrdnice University hospital
Vinogradska 29
10 000 Zagreb, Croatia

Phone: +385 1 3787 184
Fax: +385 1 3768 280

e-mail address: editorial_office [at] biochemia-medica [dot] com
 

Useful links

Events

Porto 2015

Pregledni članak:

Ilza Salamunić. Laboratorijska dijagnostika autoimunih bolesti – nove tehnologije, stare nedoumice. Biochemia Medica 2010;20(1):45-56.
 
Department of Medical Laboratory Diagnosis, University Hospital Center Split, Split, Croatia
Corresponding author: s_ilza [at] yahoo [dot] com
 
Sažetak
 
Autoimuna bolest nastaje kada imuni sistem tijela počinje napadati vlastite antigene. Glavna značajka bolesti je proizvodnja visoko afinitetnih autoantitijela. Primjenom različitih tehnika razvijaju se specifični testovi za otkrivanje autoantitijela, kao što su imunodifuzija, imunoblot, imunofluorescencija, enzimski imunotestovi i od nedavno, protočna citometrija za testove temeljene na istovremenoj višestrukoj detekciji specifičnih antinuklearnih antitijela (engl. flow cytometry for multiplex bead-based assays). Zbog varijabilnosti u testovima, koja je dovela do nedoumica u tumačenju rezultata, neophodno je pokrenuti odgovarajuću standardizaciju tehnika i metoda. Za dijagnostičke testove, koji se temelje na reakciji antigen-autoantitijelo, ne postoje referentne metode, nema točno definirane vrijednosti standarda, a uzorci seruma su heterogeni te se razlikuju od standarda. Tvrtke koje proizvode testove za kliničku dijagnostiku, često primjenjuju poznate komercijalne testove kao referentnu metodu, no velike razlike u kalibraciji testa vode ka neodgovarajućem tumačenju rezultata testa. Laboratoriji bi se mogli naći u nedoumici zbog tehnika koje su relevantne i pouzdane u otkrivanju prisutnosti svih klinički značajnih autoantitijela. Istodobno, primijenjena metoda trebala bi biti visoko produktivna, djelotvorna, jednostavna za primjenu i financijski povoljna.
Standardizacija autoimunih testova, bilo da se radi o „starim“ ili „novim“ metodama, ključna je za postavljanje dijagnoze i praćenje širokog spektra autoimunih bolesti u kliničkoj praksi.
 
Ključne riječi: autoimune bolesti; autoantitijela; dijagnostika; tehnologija; standardizacija
 
Pristiglo: 1. studenog 2009.
Prihvaćeno: 12. prosinca 2009.
 
Uvod
 
Do autoimune bolesti dolazi kada imuni sustav počne napadati svoje vlastite antigene. Općenito, te su bolesti povezane s humoralnim i stanično posredovanim imunim reakcijama na jedno ili više sastavnih dijelova vlastitog tijela (1). Kada se poremeti tolerancija na vlastite antigene kao rezultat upalnih patogena, promijenjenog receptora, radijacije ili genetske osnove, sve to vodi poremećenom funkcioniranju imunog sustava, što nadalje rezultira povišenom razinom autoantitijela u serumu. Dijagnostika autoimune bolesti ovisi o prepoznavanju kliničkih simptoma povezanih s tom bolesti i povezana je s otkrivanjem prisutnosti autoantitijela.
Kliničari konvencionalno klasificiraju autoimune bolesti kao sistemske ili organske.
Kod sistemskih autoimunih bolesti velik je broj autoantitijela visoko specifičan za određenu bolest: anti-dsDNA, anti-Sm, anti-ribosomalna P autoantitijela u sistemskom lupusu eritromatozu (SLE), anti-topoizomeraza I (Scl-70) u sklerodermi, autoantitijela na citrulinirane proteine (anti-CCP) kod reumatskog artritisa, anti-SS-A/Ro, anti-SS-B/La kod Sjögrenovog sindroma (SjS), anti-U1-RNP, anti-PM-Scl kod miješane bolesti vezivnog tkiva (engl. mixed connective tissue disease, MCTD) ili anti-Jo-1 kod polimiozitisa i dermatomiozitisa.
Organske autoimune bolesti povezane su s autoantitijelima specifičnima za glavni oboljeli organ, kao što su tireoglobulin (TGA) i enzim tireoidna peroksidaza (TPO) kod tiroiditisa, inzulin i autoantitijela na dekarboksilazu glutaminske kiseline kod šećerne bolesti tipa I. i anti-mitohondrijska autoantitijela kod primarne bilijarne ciroze. Autoantitijela mogu ukazivati na status aktivnosti bolesti ili predvidjeti buduće patogeno stanje.
Laboratoriji za dijagnostiku autoimunih bolesti analiziraju i mjere sve veći broj autoantitijela širokim spektrom tehnika i metoda (2).
Prva metoda otkrivanja antinuklearnih antitijela (engl. antinuclear antibody, ANA) bio je 1947. godine test LE stanica (engl. Lupus erythematosus (LE) cell preparation test), kojeg je prvi primjenio Hargraves, što je povezalo autoimune bolesti sa sistemskim lupusom eritematozusom (3). Tehnika imunofluorescencije za otkrivanje ANA, koja označava specifične podskupine na temelju nuklearne ili citoplazmatske komponente, predstavljena je 1957. (4). Narednih godina laboratorijski stručnjaci i dijagnostička industrija razvili su niz tehnika i različitih metoda za otkrivanje antitijela (5).
Prvi enzimski imunotest predstavljen je 1972. i otada su razvijeni različiti oblici enzimskih imunotestova, koji su bili jednostavne, visoko produktivne analize, koje su se nadalje mogle automatizirati i standardizirati (6,7).
Tradicionalne metode, temeljene na hemaglutinacijskim reakcijama, imunodifuziji i do određenog stupnja imunofluorescenciji, sve se više zamjenjuju manje zahtjevnim testovima temeljenim na tehnikama imunoblota ili enzimskom imunotestu (engl. enzyme immunoassay, EIA), koji je u širokoj primjeni za otkrivanje prisutnosti ili koncentracije pojedinačnih antitijela u biološkim tekućinama. Novo razvijen višestruki imunotest, gdje je veliki broj antigena imobliziran na čvrstoj podlozi te smješten ravno ili u prostoru na česticama, omogućuje istodobno otkrivanje različitih autoantitijela (8).
Čim se pojavi nova dijagnostička ili tehnička novost te se potvrdi kao korisna, dijagnostičke tvrtke počinju razvijati novu tehnologiju s ciljem njene komercijalizacije. Suprotno tome, razvoj standarda teče sporije i zahtjeva suglasnost tvrtki za kliničku dijagnostiku i medicinskih društava (9). Standardizacija tehnika i metoda je važna jer omogućuje usporedivost rezultata različitih istraživanja te poboljšava kliničko tumačenje nalaza. Standardizacija je moguća ako su standard i analiti identični, dok su biološki uzorci heterogeni pa se razlikuju se od standarda.
Standardizacija imunotestova za otkrivanje autoantitijela je složena, zbog činjenice da ne postoje čisti standard, referentne metode niti standardni referentni materijali (engl. standard reference materials, SRMs). Stručne organizacije koje okupljaju stručnjake koji se bave standardizacijom imunotestova, prepoznale su taj problem te započele razvijati serumske standarde u kojima je matriks sličan matriksu iz kliničkih uzoraka. Specifičnost imunotesta uglavnom ovisi o specifičnosti epitopa na antigenu koji određuje antitijelo. Standardizacija zahtjeva puno vremena i novčanih sredstava, tako da tvrtke za kliničku dijagnostiku obično posežu za često primjenjivanim i uspješnim komercijalnim testovima kao referentnim metodama. Velike razlike u kalibriranju testova, dovele su do neodgovarajućeg tumačenja rezultata. Imajući na umu probleme u standardizaciji kod imunologije, specifičnost autoantitijela i antigena, heterogenost biološkog materijala kao uzoraka analize i poznavajući prednosti i mane starih i novih tehnologija pri otkrivanju autoantitijela, laboratoriji bi se mogli naći u nedoumici pri otkrivanju prisustva svih klinički značajnih autoantitijela. Analize različitih sustava ispitivanja koje se rade u laboratorijima ili u sklopu nekog kliničkog istraživanja, nisu uvijek međusobno zamjenjive što štetiti medicini temeljenoj na dokazima (10).
Standardizacija „starih“ ili „novih“ testova za otkrivanje autoantitijela postaje prijeko potrebna u kliničkoj primjeni tih testova kod postavljanja dijagnoze i predlaganja liječenja za vrlo raznovrsnu skupinu autoimunih poremećaja.
Identifikacija ljudskih autoantitijela – odgovornost laboratorija
Laboratoriji koji se bave dijagnostikom autoimunih bolesti, primjenjuju imunotestove kao osnovnu tehniku otkrivanja autoantitijela, a ne antigena (2). Važni antigeni su dobro opisani te se primjenjuju u metodama za otkrivanje autoantitijela. Antigeni se mogu izolirati iz jezgre zečje prsne žlijezde ili ljudske slezene ili mogu biti rekombinantni. Mnogi od važnih autoantigena dobro su karakterizirani, što je važno za razlikovanje metoda kojima se otkrivaju autoantitijela (10,11).
Otkrivanje autoantitijela na atigene SS-A/Ro, SS-B/La, Sm, RNP, Scl-70, PM-Scl i Jo-1 je klinički vrlo korisno kod sistemskih autoimunih bolesti.
Antigen SS-A/Ro je ribonukleoprotein molekularne mase 60 i 52 kDa. Autoantitijela prisutna u serumu bolesnika mogu biti usmjerena na obje sastavnice proteina.
Antigen SS-B/La je fosfoprotein molekularne mase 47 kDa povezan s mnoštvom malih molekula RNA unutar stanice.
Antigeni Sm i RNP predstavljaju skupinu heterogenih molekula koje se sastoje iz proteina koji su povezani s malim molekulama RNA. Autoantitijela Sm reagiraju s proteinom B/B' molekularne mase 28kDa i D proteinom mase 14 kDa. Autoantitijela RNP reagiraju najjače s proteinom mase 70kDa i kod pojedinih bolesnika s C proteinom mase 32 ili 20 kDa. Zbog zamršene prirode tih antigena, metode proizvodnje tih antigena za komercijalne testove vrlo su složene.
Antigen Scl-70 je protein molekularne mase 70 kDa, sadrži 765 aminokiselina i djeluje kao topoizomeraza. Rekombinantni Scl-70 je osjetljiv, no pokazuje visoku aktivnost enzima (4,6,7).
Antigen PM-Scl je sklop od 11-16 proteina s molekularnom masom koja varira od 20 do 111 kDa (4).
Antigen Jo-1 je identičan histidil-tRNA-sintetazi i prisutan je u citoplazmi. Veliki epitop nalazi se u amino-termalnom dijelu molekule proteina.
Postoji velik broj drugih antigena koji se primjenjuju za otkrivanje autoantitijela povezanih sa specifičnim sistemskim ili organskim autoimunim bolestima. Klinička korisnost rezultata ovisi o kvaliteti laboratorijskih testova. Idealan dijagnostički test je visoko specifičan i osjetljiv. Također može prepoznati sve bolesnike koji boluju od određene bolesti te ne daje pozitivne rezultate za ispitanike koji ne boluju od bolesti (11,12).
Laboratoriji bi se mogli naći u nedoumici po pitanju tehnika koje su važne i pouzdane u otkrivanju svih klinički značajnih autoantitijela. Istovremeno, primijenjena metoda mora biti visoko produktivna, djelotvorna, financijski povoljna i lako primjenjiva (13,14).
Na laboratorijima leži odgovornost procjene svake nove tehnike i nove metode korištenjem testnih seruma bolesnika. Sustav kontrole kvalitete u kliničko-imunološkim laboratorijima uključuje procese za osiguranje točnosti i ponovljivosti rezultata. Specifikacija testa za otkrivanje autoantitijela treba sadržavati podatke o roku valjanosti testa, njegovoj preciznosti, graničnim vrijednostima i njihovom značenju, osjetljivosti i specifičnosti testa iz kojih se mogu izračunati prediktivne vrijednosti i omjer vjerojatnosti (engl. likelihood ratio, LR) (15). Procesu kontrole kvalitete treba pristupiti u uskoj međusobnoj suradnji dijagnostičkih laboratorija i kliničara, koji teže ka točnim dijagnozama i okrenuti su dobrobiti bolesnicima (16).
Tehnike i metode za otkrivanje antitijela
Testovi probira za otkrivanje autoantitijela provode se za mnoštvo sistemskih i organskih autoimunih bolesti. Zahtjevi za provođenjem tih testova znatno su porasli, najviše zbog povećanog poznavanja prirode autoantitijela. Istodobni razvoj novih metoda i analitičkih sustava u kliničkoj imunologiji uključuje neprekidno povećanje izdataka za testiranje antitijela (13). Neodgovarajuća primjena laboratorijskih testova jedan je od najčešćih problema kod autoimunih bolesti, koji vodi ka postavljanju netočnih dijagnoza iz kojih proizlaze i neodgovarajuća liječenja (2).
Imunofluorescencija
Tehnika indirektne imunofluorescencije (engl. indirect immunofluorescence, IIF), koja kao izvor antigena koristi razne dijelove tkiva ili ljudsku staničnu liniju tumora (HEp-2), imala je veliki utjecaj na dijagnostiku autoimunih bolesti u rutinskom laboratorijskom radu (17). Kod IIF, autoantitijela iz bolesnikovih seruma prepoznaju nedefinirane antigene i daju specifične obrasce koji se trebaju tumačiti prema njihovoj povezanosti s bolesti (Tablica 1.) (18).
 
Tablica 1. Obrasci fluorescencije i njihova veza sa specifičnim autoantitijela i bolesti
 
Obrascima indirektne imunofluorescencije pozitivnih uzoraka može se procijeniti koje specifičnosti određenog antigena treba tražiti. Poznato je da stanice HEp-2, kojima se otkrivaju autoantitijela nemaju zadovoljavajuću sposobnost davanja pozitivnih rezultata IIF za antitijela na SS-A/Ro-52 i Jo-1 (histidil-tRN-sintetaza) (19). Mnogi uzorci iz seruma daju zrnaste ili homogene obrasce, koji se ne mogu odmah prepoznati kao jedan od poznatih obrazaca (17). Prisutnost raznih antigena na određenom dijelu tkiva, rezultira izvrsnom ukupnom osjetljivošću. Antinuklearna antitijela, koja imaju nedefinirane specifičnosti, mogu se naći u serumu bolesnika oboljelih od širokog spektra autoimunih bolesti, zaraznih bolesti, a ponekad i kod zdravih pojedinaca.
Manjak specifičnosti može rezultirati tumačenjem koje navodi na krivi zaključak što ukazuje na ograničenja tehnike IIF za potrebe probira (6,11). Mikroskopija kod IIF je osjetljiva metoda, pa ipak, kod nje postoje neka ograničenja kao što su varijacije supstrata, neautomatizirana izvedba, subjektivno tumačenje rezultata, niska ponovljivost i manjak standardizacije. IIF zahtjeva puno vremena, rezultira niskom produktivnošću i povećanim troškovima radne snage (20,30). Kako bi se prevladala ova ograničenja, nedavno su uvedeni potpuno automatizirani IIF sustavi za tumačenje s programima za prepoznavanje obrazaca. Standardizacija testiranja autoantitijela tehnikom IIF ostaje ključno i kritično pitanje u rutinskom radu laboratorija i u njihovoj međusobnoj suradnji, no to se stanje može poboljšati automatskim sustavom tumačenja (21).
Analiza autoantitijela tehnikom IIF i dalje ostaje glavnom metodom dijagnosticiranja, no neki stručnjaci tvrde da je ta tehnika zastarjela i da je u rutinskom laboratorijskom radu treba zamijeniti enzimskim imunotestovima ili višestrukim testovima (22).
Enzimski imunotest
Enzimski imunotest ELISA (engl. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) s antigenima izoliranim iz jezgre ljudskih staničnih linija karcinoma (HEp-2) i jezgre visoko pročišćenih antigena ili iz rekombinantnih antigena je najperspektivniji test. Postoje razlike između različitih metoda enzimskih imunotestova, pogotovo što se pozitivnosti rezultata tiče (23-26). Izolacija autoantitijela iz prirodnih izvora, kao što je ljudsko tkivo ima veliko ograničenje u pogledu ponovljivosti testa i njegove čistoće. Mnogi su proteini prisutni samo u ograničenom broju te njihova čistoća zahtjeva odstranjivanje ostalih potencijalnih antigenskih ciljeva (17). Specifičnost testa ELISA za mjerenje koncentracije autoantitijela jako ovisi o kvaliteti primijenjenih antigena te je važno da antigen ima identičnu sekvencu, konformaciju i post-translacijske modifikacije kao i ljudski antigen (20,27).
Enzimski imunotest (engl. enzyme immunoassay, EIA) je danas u širokoj uporabi za otkrivanje specifičnih nuklearnih ili citoplazmatskih antigena različitih skupina kod organskih imunoloških poremećaja, kao što su Graveova bolest, primarna bilijarna ciroza, šećerna bolest tipa I. ili sistemskih imunoloških poremećaja koji zahvaćaju različite organe kao što su sistemska skleroza, Sjörgenov sindrom, miješana bolest veznog tkiva ili reumatoidni artritis (18,28).
Enzimski test HEp-2 ANA EIA je automatizirana metoda visoke ponovljivosti i interne kalibracije koja je temelj standardizacije. Međutim, procjena klinički dobro definiranih uzoraka na slučaju bolesnika oboljelih od skleroderme enzimskim testom HEp-2 ANA EIA, dala je niže pozitivne rezultate od onih dobivenih metodom ANA IIF (26,29). Mnoga su istraživanja, provedena u standardiziranim uvjetima, pokazala analitičku varijabilnost različitih sustava ispitivanja.
Višestruki imunotestovi
Višestruki imunotestovi podržavaju otkrivanje višestrukih autoantitijela u jednom pokušaju u isto vrijeme.
Metode koje se temelje na mikropostroju
Imunoblot (engl. line-blot immunoassay) je višestruki imunotest koji može paralelno analizirati različite tipove autoantitijela. Imunoblot s trakama (engl. line assays) koristi gotovo jedino rekombinantne antigene, koji su imobilizirani u ravnim linijama na najlonskoj test traci. Kad ih se inkubira sa serumom, autoantitijela iz uzorka vežu se na linije antigena na traci.
Vezana autoantitijela se vizualiziraju sustavom otkrivanja bojom, koji se temelji na aktivnosti alkalne fosfataze. Rezultati se tumače usporedbom intenziteta boje linija antigena s onim linijama koje predstavljaju graničnu vrijednost (engl. cut-off lines). Neke su publikacije pokazale da će manji postotak IIF ANA negativnih seruma postati pozitivan ispitamo li ga imunoblotom s trakama, posebice oni za anti-SS-A/Ro (10,31,32).
Tehnologija mikropostroja kod kojeg su antigeni smješteni ravno na dnu (engl. planar) razvijena je i primjenjuje se za simultano otkrivanje različitih autoantitijela korištenjem sandwich metode imunotesta. Različiti autoantigeni imobilizirani su na mikropostroju zajedno s kontrolnim proteinima. Nizovi se nakon toga inkubiraju serumom bolesnika te se vezana autoantitijela otkrivaju označenim sekundarnim antitijelom. Većina formata testova koji se temelje na mikropostroju koristi metode otkrivanja pomoću kemiluminescencije ili fluorescencije (33,34).
Test temeljen na česticama
Kao alternativa mikropostrojima, gdje su antigeni smješteni ravno na dnu posude, razvijena je protočna citometrija, za testove temeljene na istovremenoj višestrukoj detekciji specifičnih antinuklearnih antitijela (engl. flow cytometry for multiplex bead-based assays). Nedavno je za otkrivanje ANA predstavljen komercijalni fluorescentni test temeljen na mikrosferi. Potencijalno niski troškovi i ušteda u vremenu mogli bi biti razlozi njegove češće rutinske primjene u istraživanju i kliničkim laboratorijima (16). Sustav imunotesta s tehnologijom mikročestica (engl. micro-bead) i određivanje protočnom citometrijom (xMAP tehnologija) primjenjuje se za mjerenje koncentracije različitih autoantitijela. Sustav rabi polistrenske mikročestoce interno označene različitim omjerima dvaju različitih fluorokroma. Svaki fluorokrom može imati bilo koji od 10 mogućih stupnjeva intenziteta fluorescencije, stoga se stvara skupina od 100 spektarskih mjesta na česticama. Antigeni usmjereni na autoantitijela vezani su na mikročestice. Svaka od 100 mikročestica koja se može razlikovati po svojoj fluorescenciji, nosi specifični imobiliziran antigen za svako autoantitijela. Istodobno, zeleni laser ekscitira vanjski reporter da započne fluorescenciju kako bi uočio i kvantificirao specifične reakcije vezane za svako autoantitijela (35). Nekoliko tvrtki dobavlja komercijalne testove za simultano određivanje različitih autoantitijela protočnom citometrijom. Procjena testova različitih proizvođača za simultano kvantitativno određivanje u istom uzorku od specifičnosti 9 antinuklearnih autoantitijela (dsDNA, SS-A/Ro, SS-B/La, Sm Sm/RNP, Scl-70, Jo-1, ribosomi i centromera B) dala je dobre rezultate (36). Klinička procjena protočne citometrije za metode temeljene na istovremenoj višestrukoj detekciji specifičnih antinuklearnih antitijela, kojom se istovremeno otkrivaju antitijela na tireoidnu peroksidazu i tireoglobulin rezultirala je dobrim slaganjem s metodom ELISA (31).
Jedan problem kod otkrivanja autoantitijela kod bolesnika je manjak stvarne kvantitativne kalibracije zbog različitih afiniteta antitijela na antigene (37). Međutim, glavno pitanje ostaje jesu li kvantitativni podaci dobiveni metodama temeljenim na istovremenoj višestrukoj detekciji specifičnih antinuklearnih antitijela identični ili barem slični onima dobivenim primjenom drugih metoda (35). Osjetljivost, pouzdanost i točnost ovih testova slične su kao i kod ELISA procedura (16,38).
Proteomička tehnologija za ispitivanje i dijagnosticiranje autoimunih bolesti
Klinička proteomika nudi mogućnosti otkrivanja bioloških biljega novih bolesti u tjelesnim tekućinama, stanicama i tkivima. Pažnja kliničke proteomike usredotočena je na analitičku i kliničku validaciju i implementaciju novih dijagnostičkih i terapijskih biljega (39).
Mikropostroj predstavlja validiranu platformu za profiliranje koncentracije proteina i njihove posttranslacijske modifikacije. Proteomičke tehnologije s platformama mikropostroja antigena omogućuju širokopojasnu karakterizaciju imunih odgovora na strane i vlastite antigene koji bi mogli biti uključeni u razvoj i napredovanje autoimune bolesti. Mikropostroji s antigenima omogućuju opsežne analize autoantitijela usmjerenih na stotine i tisuće antigena, uključujući proteine, peptide, nukleinske kiseline, makromolekularne komplekse (33).
Monoklonalna ili poliklonalna antitijela mogu služiti kao molekularne probe. Nizovi se ispituju staničnom kulturom, nadtalogom, staničnim lizatom ili serumom. Ovisno o tome koja se molekularna proba primjenjuje, u uzorku se proteini ili antitijela vežu za ravno smješten niz. Sekundarno antitijelo označeno fluorescentnom bojom prepoznaje vezane molekule ili se to događa direktno ukoliko je uzorak označen fluorescentnom bojom. Različiti čitači mogu pročitati vrijednosti inkubiranih mikropostroja na antitijelima po principu ravnog vođenja (34).
Iako je postignut napredak u razumijevanju funkcije imunog sustava, razumijevanje i poznavanje narušene regulacije koja je u podlozi i specifičnosti autoimunog odgovora ostaje ograničeno. Alteracije u genima koji kontroliraju puteve regulirajući toleranciju na vlastite stanice, ključne su u patogenezi tih bolesti. Danas postoje tehnologije DNA mikropostroja koje pružaju mnoštvo informacija o patofiziologiji koja se nalazi u podlozi autoimunih bolesti (40).
Primjena proteomičkih tehnika u dijagnosticiranju autoimunih bolesti, pomoću kojih se može predvidjeti tijek bolesti, predložiti liječenje odgovarajućom terapijom i pratiti utjecaj terapije, ubuduće će promijeniti dijagnostički proces (41).
Razlike u metodama
Razvojem novih tehnologija javlja se potreba procjene i standardizacije u odgovarajućem rutinskom radu u kliničkom laboratoriju (16).
Mnoga su istraživanja, provedena u standardiziranim uvjetima, pokazala analitičku varijabilnost različitih sustava ispitivanja (29). Specifičnosti i osjetljivost autoantitijela na različite antigene važne su značajke za postavljanje dijagnoze, no varijabilnost rezultata ovisi o izvoru antigena, ponovljivosti rezultata testa, preciznosti i točnosti te kliničkoj manifestaciji bolesti (10,42-45). Neka su ispitivanja pokazala slaganja između metoda IIF ANA i EIA (6,23-25,29), dok su druga pokazala razlike u rezultatima (17,26,42,46). Odabir testa u velikoj mjeri ovisi o kliničkim okolnostima, a viša specifičnost i osjetljivost testa jako ovise o graničnoj vrijednosti (6).
Višestruke tehnologije za istraživanje profila autoantitijela predstavljaju nove tehnologije. Mogućnost istovremenog mjerenja nekoliko analita koji su u korelaciji (engl. multiplexing) može prevladati neka ograničenja konvencionalnih metoda. Međutim, podaci nisu u dobroj korelaciji s rezultatima dobivenim IIF testiranjem ili EIA te ukazuju na visoke razine lažno pozitivnih i lažno negativnih rezultata (14,47-52). Postoji nekoliko važnih razlika između testa temeljenog na istovremenom višestrukom otkrivanju specifičnih antinuklearnih antitijela i ELISA testova. Primjerice, test temeljen na istovremenom višestrukom otkrivanju specifičnih antinuklearnih antitijela rabi fluorescenciju kao sustav izvještavanja, dok ELISA koristi pojačavanje enzima u kolometrijskoj reakciji. Test temeljen na istovremenom višestrukom otkrivanju specifičnih antinuklearnih antitijela hvata ligande na mikročestice u otopini dok su kod metode ELISA antigeni smješteni na ravnoj ploči s 96 jažica. Metoda ELISA općenito ispituje jedno po jedno autoantitijelo, dok je test temeljen na istovremenom višestrukom otkrivanju specifičnih antinuklearnih antitijela višestruk i može simultano rješavati svaki problem koji se pojavi kao rezultat analiziranja višestrukih liganda, kao što su npr. unakrsne reaktivnosti (53).
Postoje mjerljive varijacije u rezultatima dobivenih dijagnostičkim kitovima za testove raznih proizvođača (18,19). Te su metode heterogene, pa različiti izvori antigena i različite granične vrijednosti mogu doprinijeti većoj varijabilnosti rezultata (5). Problematičnija je činjenica, da čak i ako se primjenjuje isti kit za otkrivanje antitijela određene reaktivnosti, može doći do varijacija rezultata između laboratorija (54).
Standardizacija rezultata testova ostaje nezadovoljavajuća
Rezultati dobiveni u laboratorijima ili drugim kliničkim istraživanjima, naglašavaju potrebu za drastičnom standardizacijom primjenjivanih procesa i važnost nezavisnih kalibratora ili međunarodnih standarda.
Kliničari i proizvođači testova stoje pred izazovom pružanja kvantitativnih i definitivnih mjerenja koncentracije autoantitijela, koja se zasnivaju na pouzdanim i ponovljivim testovima, koji mogu pružiti klinički korisne informacije s visokom specifičnošću i osjetljivošću. Prisutna raznolikost metodologija testova odražava složenost standardizacije testova (55).
Nekoliko je organizacija uključeno u razne aspekte standardizacije imunotestova. Na vrhu hijerarhije standardizacije nalazi se Međunarodna organizacija za standardizaciju (engl. International Standardization Organization, ISO). Svjetska zdravstvena organizacija (engl. World Health Organization, WHO) izdaje standarde za klinički važne antigene koji se određuju imunotestovima. Uz ta službena tijela, postoji nekoliko stručnih organizacija koje vode projekte standardizacije imunotestova, npr. Međunarodna federacija za kliničku kemiju (engl. International Federation of Clinical Chemistry, IFCC), Međunarodna unija čiste i primjenjene kemije (engl. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC), Udruga američkih patologa (engl. College of American Pathologists, CAP), Nacionalno povjerenstvo za standarde u kliničkoj kemiji (engl. National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS).
Povjerenstvo za standardizaciju autoantitijela (engl. Autoantibody Standardization Committee, ASC) osnovano je ranih 80-ih godina prošlog stoljeća, jer je prepoznalo potrebu za referentnim ljudskim autoimunim serumima u standardizaciji (55). Europska inicijativa za standardizaciju autoimuniteta (engl. European Autoimmunity Standardization Initiative, EASI) osnovana je kako bi se raspravilo kako se u praksi može poboljšati međudjelovanje između laboratorija i kliničkih odjela, kako se mogu harmonizirati algoritmi kod testiranja autoantitijela i koji bi se međunarodni koncept standardizacije dijagnostičkih strategija trebao uzeti u obzir (56).
 
Zaključak
 
Laboratoriji za dijagnostiku autoimunih bolesti primjenjuju imunotestove kao osnovnu tehniku za otkrivanje prisutnosti autoantitijela. Središnji i glavni princip postupka za sve dijagnostičke testove koji ispituju koncentraciju autoantitijela je hvatanje autoantitijela iz seruma primjenjujući imobilizirane autoantigene. Međutim, postoji velika varijabilnost između tih testova koja vodi ka razlikama u rezultatima, postoji varijabilni stupanj pouzdanosti njihove primjene, čak i mogućnost pogrešnog dijagnosticiranja bolesti kod bolesnika (57). Ne postoji univerzalno rješenje tih problema, no moguće je poboljšati stupanj standardizacije tehnika i metoda. Standardizacija je međunarodni problem i poželjno je da jedna međunarodna organizacija u suradnji sa svim organizacijama odgovornim za procjenu kvalitete testova bude odgovorna za koordinaciju između dijagnostičkih znanstvenika, kliničara i tvrtki za kliničku dijagnostiku. U praksi to znači da su laboratoriji odgovorni za rješavanje nedoumice oko prikladne primjene odgovarajućih metoda za otkrivanje autoantitijela u suradnji s laboratorijskim stručnjacima, kliničarima i proizvođačima.
 
Literatura
 
 1. Lernmark A. Autoimmune diseases: are markers ready for prediction? J Clin Invest 2001;108:1091-6.
 2. González-Buitrago JM, González C. Present and future of the autoimmunity laboratory. Clin Chim Acta 2006;365:50-7.
 3. Hargraves M, Richmond H, Morton R. Presentation of two bone marrow components, the tact cell and the LE cell. Mayo Clin Proc 1948;27:25-8.
 4. Cook L. New Methods for Detection of Anti-nuclear Antibodies. Clin Immunol Immunopathol 1998;88:211-20.
 5. Rouquette AM, Desqruelles C, Larosche P. Evaluation of the new multiplexed immunoassays, FIDIS, for simultaneous quantitative determination of antinuclear antibodies and comparison with conventional methods. Am J Clin Pathol 2003;120:676-81.
 6. Hayashi N, Kawamoto T, Mukai M, Morinobu A, Koshiba M, Kondo S, et al. Detection of Antinuclear Antibodies by Use of an Enzyme Immunoassay with Nuclear Hep-2 Cell Extract and Recombinant Antigens: Comparison with Immunofluorescence Assay in 307 Patients. Clin Chem 2001;47:1649-59.
 7. Engvall E, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA. III. Quantitation of specific antibodies by enzyme-linked anti-immunoglobulin in antigen-coated tubes. J Immunol 1972;109:129-35.
 8. Balboni I, Chan SM, Kattah M, Tenenbaum JD, Butte AJ, Utz PJ. Multiplexed Protein Array Platforms for Analysis of Autoimmune Diseases. Annu Rev Immunol 2006;24:391-418.
 9. Bossuyt X, Louche C, Wiik A. Standardisation in clinical laboratory medicine: an ethical reflection. Ann Rheum Dis 2008;8:1061-3.
10. Eissfeller P, Sticherling M, Scholz D, Hennig K, Lüttich T, Motz M, et al. Comparison of Different Test Systems for Simultaneous Autoantibody Detection in Connective Tissue Diseases. Ann NY Acad Sci 2005;1050: 1-13.
11. Bossuyt X, Frans J, Hendrickx A, Godefridis G, Westhovens R, Mariën G. Detection of Anti-SSA Antibodies by Indirect Immunofluorescence. Clin Chem 2004;12:2361-9.
12. Von PAJM, Bast EJEG, Derksen RHWM. Cost-effective detection of non-antidouble-stranded DNA antinuclear antibody specificities in daily clinical practice. Reumatology 2006;45:629-35.
13. Tozzoli R, Bizzaro N, Tonutti E, Villalta D, Bassetti D, Manoni F, et al. Guidelines for the Laboratory Use of Autoantibody Tests in the Diagnosis and Monitoring of Autoimmune Rheumatic Diseases. Am J Clin Pathol 2002;117:314-24.
14. Salamunić I, Pauković-Sekulić B, Galetović A, Tandara L, Martinović-Kaliterna D. Comparative analysis of multiplex AtheNA Multi-Lyte ANA test system and conventional laboratory methods to detect autoantibodies. Biochem Med 2008;18:88-98.
15. Sturgess A, Edmonds J. Improving the effectiveness of autoantibody testing in the clinic. Autoimmun Rev 2002;1:273-8.
16. Fritzler MJ. Advances and applications of multiplexed diagnostic technologies in autoimmune diseases. Lupus 2006;15:422-7.
17. Hoffman IEA, Peene I, Veys EM, De Keyser F. Detection of Specific Antinuclear Reactivities in Patients with Negative Anti-nuclear Antibody Immunofluorescence Screening Tests. Clin Chem 2002;48:2171-6.
18. Stinton LM, Fritzler MJ. A clinical approach to autoantibody testing in systemic autoimmune rheumatic disorders. Autoimmun Rev 2007;7:77-84.
19. Wiik AS. Anti-nuclear autoantibodies. Clinical utility for diagnosis, prognosis, monitoring, and planing strategy in systemic immunoinflammatory diseases. Scand J Rheumatol 2005;34:260-8.
20. Haass M, Lehmann HP. New aspects of autoantibody detection with a new combination of autoantigenic targets. Clin Applied Immunol Rev 2001;1:193-200.
21. Hieman R, Büttner T, Krieger T, Roggenbuck D. Challenges of automated screening and differentiation of non-organ specific autoantibodies on HEp-2 cells. Autoimmun Rev 2009;9:17-22.
22. Dahle C, Skogh T, Åberg AK, Jalal A, Olcén P. Methods of choice for diagnostics antinuclear antibody (ANA) screening: Benefit of adding antigen-specific assays to immunofluorescence microscopy. J Autoimmun 2004;22:241-8.
23. Orton SM, Peace-Brewer A, Schmitz JL, Freeman K, Miller WC, Folds JD. Practical Evaluation of Methods for Detection and Specificity of Autoantibodies to Extractable Nuclear Antigens. Clin Diagn Lab Immunol 2004;11:297-301.
24. Fenger M, Wiik A, Høter-Madsen M, Lykkegaard JJ, Rozenfeld T, Hansen MS, et al. Detection of Antinuclear Antibodies by Solid-Phase Immunoassays and Immunofluorescence Analysis. Clin Chem 2004;50:2141-7.
25. González C. Guevara P, Alarcón I, Hernando M, Navajo JA, González-Buitrago JM. Antinuclear antibodies (ANA) screening by enzyme immunoassay with nuclear HEp-2 cell extract and recombinant antigens: analytical and clinical evaluation. Clin Biochem 2002;35:463-9.
26. Bizzaro N, Tozzoli R, Tonutti E, Piazza A, Manoni F, Ghirardello A, et al. Variability between methods to determine ANA, anti-dsDNA and anti-ENA autoantibodies: a Collaborative study with the biomedical indystry. J Immunol Methods 1998;219:99-107.
27. Binder SR. Autoantibody detection using multiplex technologies. Lupus 2006;15:412-21.
28. Jaskowski TD, Schroder C, Martins TB, Mouritsen CL, Litwin CM, Hill HR. Screening for antinuclear antibodies by enzyme immunoassay. Am J Clin Pathol 1996;105:468-73.
29. Tan EM, Smolen JS, McDougal JS, Butcher BT, Conn D, Dawkins R, et al. A critical evaluation of enzyme immunoassays for detection of antinuclear autoantibodies of defined specificities. Arthritis Rheum 1999;42:455-64.
30. Friou CJ. Clinical application of lupus serum nucleoprotein reaction using fluorescent antibody technique. J Clin Invest 1957;36:890-7.
31. Gonzalez C, Garcia-Berrocal B, Talavan T, Cassas ML, Navajo JA, Gonzalez-Buitargo JM. Clinical evaluation of a microsphere bead-based flow cytometry assay for the simultaneous determination of anti thyroid peroxidase and anti thyroglobulin antibodies. Clin Biochem 2005;38:966-72.
32. Gordon P, Khamashta MA, Rosenthal E, Simpson JM, Sharland G, Brucato A, et al. Anti-52 kDa Ro, Anti-60 kDa Ro, and Anti-La antibody profiles in neonathal lupus. J Rheumatol 2004;31:2480-7.
33. Joos TO, Stoll D, Templin MF. Miniaturised multiplexed immunoassays. Curr Opin Chem Biol 2001;6:76-80.
34. Wingren C, Borrebaeck CA. Antibody microarrays: current status and key technological advances. OMICS 2006;10:411-27.
35. Gonzales-Buitrago JM. Multiplexed testing in the autoimmunity laboratory. Clin Chem Lab Med 2006;44:1169-74.
36. Rouquete AM, Desgruelles C, Laroche P. Evaluation of the new multiplexed immunoassay, FIDIS, for simultaneous quantitative determination of antinuclear antibodies and comparison with conventional methods. Am J Clin Pathol 2003;120:676-81.
37. Feng Y, Ke X, Ma R, Chen Y, Hu G, Liu F. Parallel Detection of Autoantibodies with Microarray in Rheumatoid Diseases. Clin Chem 2004;50:416-22.
38. Seideman J, Peritt D. A novel monoclonal antibody screening method using the Luminex-100 microsphere system. J Immunol Methods 2002;267:165-71.
39. Apweiler R, Aslandis C, Defuel T, Gerstner A, Hansen J, Hochstrasser D, et al. Approaching clinical proteomics: current state and future fields of application in fluid proteomics. Clin Chem Lab Med 2009;47:724-44.
40. Robinson WH, Steinman L, Utz PJ. Proteomics technologies for the Study of Autoimmune Disease. Arthritis Rheum 2002;46:885-93.
41. Hueber W, Robinson WH. Proteomic biomarkers for autoimmune disease. Proteomics 2006;6:4100-5.
42. Tozzoli R, Bizzaro N, Tonutti E, Pradella M, Manoni F, Vilalta D. Immunoassay of Anti-Thyroid Autoantibodies: High Analytical Variability in Second Generation Methods. Clin Chem Lab Med 2002;40:568-73.
43. Lukinac Lj, Krilić D, Nöthig-Hus D, Kusić Z. The problem of thyroid antibodies testing. Acta Clin Croat 2004;43:355-9.
44. Vergani D, Alvarez F, Bianchi FB, Cancado ELR, Mackay IR, Manns MP, et al. Liver autoimmune serology: a consesus statement from the committee for autoimmune serology of the International Autoimmune Hepatitis Group. J Hepatol 2004;41:677-83.
45. Törn C, Mueller P, Schlosser M, Bonifacio E, Bingley P. Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for autoantibodies to glutamic acid decarboxylase and islet antigen-2. Diabetologia 2008;51:846-52.
46. Rouquette AM, Desgruelles C. Detection of antibodies to dsDNA: an overview of laboratory assays. Lupus 2006;15:403-7.
47. Fritzler MJ, Behmanesh F, Fritzler ML. Analysis of human sera that are polyreactive in an addressable laser bead immunoassay. Clin Immunol 2006;120:349-56.
48. Biagini RE, Parks CG, Smith JP, Sammons DL, Robertson SA. Analytical performance of the AtheNA MultiLyte ANAII assay in sera from lupus patients with multiple positive ANAs. Anal Bioanal Chem 2007;388:613-18.
49. Shovman O, Gilburd B, Barzilai O, Shinar E, Larida B, Zandman-Goddard G, et al. Evaluation of the BioPlex 2200 ANA Screen Analysis of 510 Healthy Subjects: Incidence of Natural/predictive autoantibodies. Ann NY Acad Sci 2005;1050:380-8.
50. Avaniss-Aghajani E, Berzon S, Sarkissian A. Clinical Value of Multiplex Bead Based Immunoassay for Detection of Autoantibodies to Nuclear Antigens. Clin Vaccine Immunol 2007;14:505-9.
51. Shovman O, Gilburd B, Zandman-Goddard G, Yehiley A, Langevitz P, Shoenfeld Y. Multiplexed AtheNA Multi-lyte immunoassay for ANA screening in autoimmune diseases. Autoimmunity 2005;38:105-9.
52. Nifli AP, Notas G, Mamoulaki M, Niniraki M, Ampartzaki V, Theodoropoulos PA, et al. Comparison of a multiplex, bead-based fluorescent assay and immunofluorescence methods for the detection of ANA and ANCA autoantibodies in human serum. JIM 2006;311:189-97.
53. Elshal MF, McCoy P. Multiplex bead array assays: Performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA. Methods 2006;38:317-23.
54. Fritzler MJ, Wiik A, Fritzler ML, Barr SG. The use and abuse of commercial kits used to detect autoantibodies. Arthritis Res Ther 2003;5:192-201.
55. Chan EKL, Fritzler MJ, Wiik A, Andrade LEC, Reeves WH, Tincani A, Meroni PL. AutoAbSC. Org-Autoantibody Standardization Committee in 2006. Autoimmun Rev 2007;6:377-80.
56. Wiik A, Cervera R, Haass M, Kallenberg C, Khamashta M, Meroni PL, et al. European attempts to set guidelines for improving diagnostics of autoimmune rheumatic disorders. Lupus 2006;15:391-6.
57. Dodig S. Interferences in quantitative immunochemical methods. Biochem Med 2009;19:50-62.