Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Izvorni znanstveni članak

 
Yusuf Saidu1, Lawal Suleman Bilbis1, Mansur Lawal1, Simeon Alabi Isezuo2, Rabiu Aliyu Umar1. Ispitivanje hematotoksičnosti ekstrakta lišća Albizia chevalieri (Leguminosae). Biochemia Medica 2007;17(2):203-211.
1 Odsjek za biokemiju, Sveučilište Usmanu Danfodiyo, Sokoto, Nigeria
2 Odsjek za medicinu, Sveučilište Usmanu Danfodiyo, Sokoto, Nigeria
*Adresa za dopisivanje: yusab [at] ahoo [dot] com
 
Sažetak
Uvod: Postoje izvješća o značajnom hipoglikemijskom učinku vodenog ekstrakta lišća biljke Albizia chevalieri kod dijabetičnih štakora s šećernom bolesti izazvane aloksanom.
Materijali i metode: Učinak vodenog ekstrakta lišća Albizia chevalieri na hematološke varijable i patohistološku analizu ispitan je kod štakora kojima su davane akutne i subkronične doze ovoga pripravka. Štakori na akutnim dozama primili su između 0 i 3000 mg/kg tjelesne težine ekstrakta oralno u jednoj dozi, dok su oni na subkroničnim dozama primali između 0 i 1500 mg/kg tjelesne težine na dan kroz 28 dana. Testirani parametri analizirali su se u uzorcima krvi i tkiva na kraju razdoblja promatranja.
Rezultati: Ekstrakt nije imao značajnog učinka (P>0,05) na koncentraciju hemoglobina, crvenu krvnu sliku, volumen koncentriranih stanica (engl. packed cell volume, PCV) (hematokrit), bijelu krvnu sliku i diferencijalnu krvnu sliku, te broj trombocita u testu akutne toksičnosti. Nije bilo značajnog učinka na srednji stanični volumen (engl. mean cell volume, MCV), srednju vrijednost staničnog hemoglobina (engl. mean cell hemoglobin, MCH) i srednju koncentraciju staničnog hemoglobina (engl. mean cell hemoglobin concentration, MCHC). kod štakora na akutnim i subkroničnim dozama ekstrakta (P>0,05). U studiji subkronične toksičnosti, PCV, bijela krvna slika i diferencijalna slika (P<0,05) pokazali su značajne i od dozi neovisne razlike od kontrolnih vrijednosti. Patohistološka analiza tkiva jetre, bubrega i srca štakora pokazala je normalne nalaze kako nakon akutnog tako i nakon subkroničnog davanja ekstrakta.
Zaključak: Vodeni ekstrakt lišća Albizia chevalieri, za koji je objavljeno da ima značajno hipoglikemijsko djelovanje kod štakora sa šećernom bolesti izazvane aloksanom, mogao bi biti siguran za primjenu u ispitivanim dozama.
Ključne riječi: hematologija, patohistologija, Albizia chevalieri, akutna i subkronična toksičnost
Pristiglo: 19. lipnja 2007.                                                                                                 Prihvaćeno: 9. rujna 2007.
 
 
Uvod
Albizia je velik rod drveća, porodica graha (Fabaceae), udomaćen u toplim krajevima Staroga svijeta. Listovi su perasti i složeni u redovima. Albizia (A.) chevalieri je drvo tipa akacije udomaćeno u tropskim i suptropskim krajevima uključujući Nigeriju i Republiku Niger, sa slobodno visećim kuglicama bjelkastih mirisnih cvjetova i ravnim smeđim mahunama. Cvjetići oblikuju okrugle ili prstolike snopiće. Plod je velika remenasta mahuna. Nekoliko drugih vrsta roda Albizia rastu kao ukrasno drveće (1).
Ekstrakt lista A. chevalieri rabi se kao hladni vodeni uvarak ili se osušeni, samljeveni i prosijani list miješa s kašom za liječenje šećerne bolesti, što se prakticira u tradicionalnoj medicini u nekim dijelovima Republike Niger i u Sokotu, Nigerija. Postoje izvješća o tome da ovaj ekstrakt ima značajan hipoglikemijski učinak (2).
Moguće je da se hipoglikemijska svojstva ove biljke, zapravo ljekovita svojstva biljaka koje se upotrebljavaju u tradicionalnoj medicini zasnivaju na jednom ili nekoliko od mnoštva kemijskih sastojaka biljnog materijala. Ove fitokemikalije, među inima, uključuju složene ugljikohidrate, alkaloide, glikopeptide, terpenoide, tanine, cijanogene, peptide i amine, steroide, flavonoide, lipide, kumarine, sumporne spojeve i anorganske ione. Smatra se da je hipoglikemijski agens ekstrakta A. chevalieri fenolni spoj (2). Neki od tih spojeva mogu biti toksični, pa bi stoga biljke koje ih sadrže mogle izazvati toksičnost različite razine u osobe koja ih unosi u organizam. Tako bi neke biljke mogle same po sebi biti opasne, jer sadrže prirodne toksine, često s citotoksičnim, karcinogenim učinkom ili nekim drugim toksičnim svojstvima (3). Na primjer, za poznatu hipoglikemijsku biljku Carica papaya (4,5) izvještava se kako izaziva sterilnost kod eksperimentalnih životinja (5,6). Patohistološke promjene zapažene u organima štakora koji su dobivali sirove larve Cirina forda (Westwood) također ukazuju na to da je ta biljka toksična (7). Prema literaturnim izvješćima, vodeni ekstrast lišća A. chevalieri ima LD50 >3000 mg/kg tjelesne težine i ne utječe na većinu biokemijskih serumskih parametara jetrene i bubrežne funkcije kod albino štakora (8).
U ovom su članku opisani akutni i subkronični in vivo učinci krutog vodenog ekstrakta lišća A. chevalieri na hematološke varijable i patohistološke nalaze albino štakora.
 
Materijali i metode
Kemikalije i reagencije
Sve kemikalije i reagencije upotrebljene u ovom radu bile su analitičkog stupnja.
 
Biljni materijal
A. chevalieri je nabavljena iz sela Sanyinna, koje se nalazi oko 50 km južno od grada Sokoto, Nigerija. Biljni materijal je identificirao taksonomist iz Odjela za botaniku Katedre za biološke znanosti, Sveučilište Usmanu Danfodiyo iz Sokota. Referentni uzorak (UDUS/VS/o4/09) je pripravljen i pohranjen u Herbarij Katedre. Lišće je osušeno na suncu, usitnjeno laboratorijskim batićem u mužaru, te prosijano kroza sito od 1 mm2. Tako dobiveni prah od lišća spremljen je u plastične vrećice u desikatoru do uporabe.
 
Priprava krutog ekstrakta
Biljni materijal usitnjen u prah namočen je u hladnu destiliranu vodu u omjeru od 20% (w/v) kroz 24 sata. Ekstrakt je filtriran kroz višestruko presavijen muselin kako bi se uklonile otpadne čestice. Potom je tako dobiveni filtrat protjeran kroz filtar papir Whatman br. 1 i otparen u uređaju za sušenje na 40°C (9). Tako dobiveni ostatak iznosio je 18,7% (w/w). Tada je upareni ekstrakt rekonstituiran u destiliranoj vodi u omjeru od 30% (w/v) i pohranjen u male plastične spremnike sa zatvaračem na +4°C do uporabe. Ovaj postupak je primijenjen za testove akutne i subkronične toksičnosti. Doza ekstrakta koja se preporuča u nigerijskoj tradicionalnoj medicini je oko 130 mg/kg tjelesne težine. Ranije je opisano kako je doza od 100 mg/kg tjelesne težine učinkovito snizila razinu glikemije kod Wistar štakora (2).
 
Eksperimentalne životinje
Zdravi muški Wistar štakori, težine 163±11 g, nabavljeni su od Državnog instituta za istraživanje tripanosomijaze, Vom, blizu Jos Plateaua, Nigerija. Životinje su ostavljene kroz jedan tjedan da se prilagode laboratorijskoj okolini i za to vrijeme su imale slobodan pristup čistoj vodi i hrani.
 
Ispitivanje akutne toksičnosti
Životinje su podijeljene u šest skupina od po sedam životinja, označene AC, BC, CC, DC, EC i FC. Kruti vodeni ekstrakt davao se u pojedinačnim oralnim dozama od 500, 1000, 1500, 2200 i 3000 mg/kg tjelesne težine skupinama BC, CC, DC, EC odnosno FC. Životinje u skupini AC dobile su 0,5 mL destilirane vode istim putem i služile su kao kontrole. Životinje su izvagane prije i 72 sata nakon davanja lijeka, te su promatrane kroz 72 sata zbog toksičnih simptoma kao što su slabost i agresivnost, odbijanje hrane, gubitak težine, iscjedak iz očiju i ušiju, šumovi pri disanju i smrtnost (10,11).
 
Ispitivanje subkronične toksičnosti
Životinje su podijeljene u 6 skupina od po 7 životinja, označenih kao SC, TC, VC, XC, YC i ZC. Kruti vodeni ekstrakt davao se oralno u 5 gradacija od 150, 300, 500, 1000 i 150 mg/kg tjelesne težine na dan kroz 28 dana skupinama SC, TC, VC, XC, YC odnosno ZC. Životinje u kontrolnoj skupini SC primale su 0,5 mL destilirane vode pod sličnim eksperimentalnim uvjetima, istim putem i kroz isti broj dana. Promjene tjelesne težine promatrale su se tjedno tijekom čitavog razdoblja eksperimenta. Životinje su također promatrane zbog manifestacije toksičnosti i smrtnosti kao i u dijelu studije u kojem se ispitivala akutna toksičnost.
Na kraju razdoblja promatranja (u ispitivanjima subkronične i akutne toksičnosti) životinje su anestetizirane pomoću para kloroforma. Uzeti su uzorci krvi srčanom punkcijom i prenešeni u označene plastične bočice koje su sadržavale EDTA (disodium etilenediamin tetraacetat) u količini od 1,5 mg/mL krvi (12).
 
Hematološke pretrage
Sadržaj hemoglobina (Hb) u uzorcima krvi određen je spektrofotometrijskom metodom (12). Crvena krvna slika (engl. red blood cell, RBC) određena je metodom vizualnog brojenja (12). Volumen koncentriranih stanica (engl. packed cell volume, PCV), bijela krvna slika (engl. white blood cell, WBC), diferencijalna krvna slika i broj trombocita (Plt): pomoću mehaničkog širenja i optičkog uvećanja, pojačano supravitalnim bojenjem stanica, sustav QBCII izdaje broj trombocita, bijelu krvnu sliku i broj dviju glavnih podskupina bijele krvne slike iz linearnih mjerenja slojeva koncentriranih stanica u sloju leukocita i trombocita. Također se mjeri PCV, kao i kod konvencionalnih postupaka mikrocentrifugiranja (13). Epruveta s krvlju napuni se antikoaguliranom krvlju pomoću uređaja za pipetiranje. Vrh epruvete očisti se od krvi papirnim rupčićem. Epruveta se čvrsto zatvori i lagano protrlja među prstima kroz 5 sekunda. Nezatvoreni kraj epruvete prevuče se preko vrha prethodno postavljenog plovka i gurne tako da plovak uđe što dublje u epruvetu. Tada se epruveta s krvlju centrifugira na rotoru centrifuge QBCII kroz 5 minuta i očita na čitaču QBCII. Izračunati su srednji stanični volumen (engl. mean cell volume, MCV), srednji stanični hemoglobin (engl. mean cell haemoglobin, MCH) i srednja koncentracija staničnog hemoglobina (engl. mean cell hemoglobin concentration, MCHC) (12).
 
Patohistološke pretrage
Iz svake su skupine nasumce odabrane po tri životinje, anestetizirane parama kloroforma i secirane kroz središnji rez na trbuhu. Uzeti uzorci bubrega, srca i jetre i odmah fiksirani u 10%-noj fiziološkoj otopini-formalinu u označene plastične bočice za uzorke. Tkiva su dehidrirana u gradiranim koncentracijama ksilena, uklopljena u rastaljeni parafinski vosak i izrezana u komadiće od 5 . Tako izrezana tkiva su fiksirana na bezmasna predmetna stakalca i obojena hematoksilinom i eozinom za pregled pod svjetlosnim mikroskopom uz povećanje 400 puta (14). Napravljeni su fotomikrogrami nekih tkiva pomoću mikroskopa s fotografskim aparatom i razvijeni rutinski u laboratoriju za fotografiju u boji.
 
Statistička analiza
Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. Rezultati hematološke analize obrađeni su analizom varijance (ANOVA). Za utvrđivanje razlika u srednjim vrijednostima primijenjene su višestruke usporedbe post hoc testova pomoću LSD. Vrijednosti P manje od 0,05 smatrale su se statistički značajnima. U analizi je korišten statistički paket SPSS Windows, verzija 10.
 
Rezultati
Rezultati o učincima različitih akutnih i subkroničnih doza krutog ekstrakta lišća A. chevalieri na hematološke varijable prikazani su u tablicama 1. i 2. Rezultati nisu pokazali nikakve značajne razlike (P>0,05) između životinja na različitim dozama ekstrakta ni u jednom modelu.
Rezultati patohistološke analize tkiva štakora koji su dobivali akutne i subkronične doze ekstrakta lišća A. chevalieri zbrajani su po metodi Akinnawoa i sur. (7), a prikazani u tablicama 3 i 4. Ekstrakt nije imao nikakav učinak na većinu tkiva.
 
Tablica 1. Hematološki parametri Wistar štakora koji su dobivali akutne oralne doze vodenog ekstrakta lišća A. chevalieri
 
 
Tablica 2. Hematološki parametri Wistar štakora koji su dobivali subkronične oralne doze vodenog ekstrakta A. chevalieri
 
 
Tablica 3. Zbirna patologija organa Wistar štakora nakon akutnog oralnog davanja različitih doza vodenog ekstrakta lišća A. chevalieri za tri životinje tretirane akutnom dozom
 
 
Tablica 4. Zbirna patologija organa Wistar štakora nakon subkroničnog oralnog davanja različitih doza vodenog ekstrakta lišća A. chevalieri za tri životinje tretirane subkroničnom dozom (28 dana)
 
 
Rasprava
Točnim određivanjem hematoloških parametara može se postaviti oko 80% hematoloških dijagnoza, te dobiti potrebne podatke za procjenu stadija određene bolesti ili pak za dijagnosticiranje nekih bolesti koje ne moraju biti izravno povezane s hematopoetskim sustavom (15). Podaci dobiveni iz broja leukocita, a bez diferencijalne krvne slike mogu biti tek djelomični, a u nekim slučajevima mogu čak dovesti do zabune. Stoga se u diferencijalnoj slici procjenjuju podvrste leukocita, kako bi se utvrdila narav infekcije (15). Broj eozinofila povišen je u gotovo svim vrstama alergijskih bolesti, parazitnim infekcijama, te u manjoj mjeri kod zloćudnih bolesti (15). S druge strane, povišen broj monocita nalazi se kod kroničnih upalnih bolesti, dok je broj limfocita povišen kod kronične limfocitične leukemije, zaraznih bolesti poput pertusisa, virusnih bolesti poput ospica, rubeole i vodenih kozica (15). Rezultati ove studije pokazuju da su broj ukupnih leukocita i diferencijalna slika bili normalni u oba ispitivana modela i time ukazivali na nealergijsku narav pripravljenih ekstrakata. To također pokazuje kako ekstrakt nije remetio imuni status životinja.
Nedostatak željeza je glavni uzrok hipokromne mikrocitične anemije, gdje je moguć granično nizak Hb i PCV čak i kad je broj eritrocita normalan. Akutni gubitak mase krvnih stanica kakav se nalazi kod krvarenja i hemolize glavni je uzrok normokromne normocitne anemije. Kod makrocitne anemije postoji smanjenje apsolutnog broja eritrocita po jedinici volumena. U tom slučaju je pojedinačna stanica veća u volumenu i promjeru te sadrži više hemoglobina, što rezultira povišenjem MCV i MCHC. Ovaj oblik anemije nalazi se kod nedostatka folne kiseline i vitamina B12. U našem ispitivanju niti akutno niti subkronično davanje ekstrakta nije značajno utjecalo na broj eritrocita (P=0,067; 0,121), PCV (P=0,343; 0,195) i Hb (P=0,730; 0,451). Uz to, davanje pripravka nije utjecalo niti na druge eritrocitne parametre (MCV, MCH i MCHC). To bi moglo značiti da ovaj ekstrakt u ispitivanim koncentracijama ne izaziva nikakav oblik anemije. S obzirom na to da je terapijska doza ekstrakta daleko niža od količina koje su se rabile u ispitivanju toksičnosti, može se pretpostaviti da ekstrakt ne bi utjecao na eritropoezu, sintezu hemoglobina ili na druge čimbenike povezane s metabolizmom eritocita kad ga se uzima u terapijskoj dozi. Isto tako u ovoj studiji nije bilo značajnog utjecaja na broj trombocita (P>0,05). Slični su rezultati objavljeni za Strychnos potatorum, biljku koja se rabi u Indiji za liječenje većeg broja bolesti uključujući šećernu bolest (16). Međutim, Ali i Bashir (17) i Taiwo i sur. (18) izvješćuju kako su ekstrakti Aviccenia marina odnosno Aloe vera značajno utjecali na hematološke parametre kod štakora kojima su se davale akutne i subkronične doze istih.
Zbirna patologija organa štakora nakon akutnog i subkroničnog oralnog davanja vodenog ekstrakta lišća A. chevalieri,prikazana u tablicama 7. i 8., pokazala je normalnu arhitekturu jetre, bubrega i srca. Opažene promjene nisu bile značajne i bile su ograničene na bubreg u oba ispitivana modela. Promjene su uglavnom uključivale blagu kongestiju i proteinske cilindre, što nije bilo ovisno o dozi. Kad su nastupile blage promjene, to je zabilježeno u manje od 20% ispitivanih uzoraka. Prema literaturnim podacima, akutne i subkronične doze vodenog etanolnog ekstrakta lišća Senna alata (19) te vodeni ekstrat i prah sjemenaka Strychnos potatorum (16) nisu značajno utjecale na jetru štakora. Međutim, akutno davanje ekstrakta biljke Aviccenia marina koja podnosi sol (17) i vodenog ekstrakta lišća sirove biljke Aloe vera (18) uzrokovalo je značajne promjene histologije jetre i bubrega štakora. Pokazalo se kako jetra kao prvi organ koji se susreće sa svim materijalima apsorbiranima iz probavnog sustava na različite načine odgovara na toksikološka oštećenja, što uključuje staničnu degeneraciju i nekrozu, hiperplaziju žučovoda i fibrozu (7). Bubreg je izlučni organ koji uklanja metabolizirane i ne-metabolizirane toksične tvari iz organizma; stoga je bubreg izložen višim koncentracijama štetnih tvari koje mogu uzrokovati oštećenja.
 
Zaključak
 
U zaključku, vodeni ekstrakt lišća A. chevalieri, za koji je opisano da ima značajan hipoglikemijski učinak kod štakora s šećernom bolesti izazvane aloksanom (2), može se smatrati relativno sigurnim u ispitanim dozama. U ranijem radu su Saidu i sur. (8) objavili kako ovaj ekstrakt ima LD50 iznad 3000 mg/kg tjelesne težine i nema nikakvog značajnog učinka na biokemijske parametre jetrene i bubrežne funkcije u serumu.
 
Zahvala
Autori zahvaljuju gospodinu Basseyu iz Odjela za patohistologiju, Sveučilišna bolnica Usmanu Danfodiyo, Sokoto, Nigerija, na izradi tkivnih pripravaka, te pok. Dr. T.J. Anga s Katedre za veterinarsku patologiju, Sveučilište Usmanu Danfodiyo, Sokoto, Nigerija, na pomoći u tumačenju pripravaka. Zahvaljujemo gospodinu M. Kamba na pomoći u određivanju hematoloških varijabla.
 
Literatura
1.    Britannica. Encyclopaedia Britannica 2001 Deluxe Edition CD Rom.
2.    Saidu Y, Lawal M, Isezuo SA, Shehu RA, Sahabi DM, Bilbis LS. Partial purification and elucidation of mechanism of hypoglycaemic agent of aqueous leaf extract of Albizzia chevalieri Harms (Leguminosae). J Pharmacol Toxicol 2007;2(6):513-23.
3.    Humphrey SI, McKenna DJ. Herbs and breastfeeding. Breastfeeding Abstracts 1997;17(2):11-2.
4.    Onoagbe TO, Ebhota AO, Udegbe HC, Omondia M, Edeni D, Ebengho SO. Assessment of some medicinal plants for hypoglycaemic activities in rats and rabbits. Bioscience Research Communications 1999;11(2):159-63.
5.    Lohiya NK, Pathak N, Mishra PK, Manivannan B. Reversible contraception with chloroform extract of C. Papaya Lin seeds in male rabbits. Reprod Toxicol 1999;13:59-66.
6.    Lohiya NK, Pathak N, Mishra PK, Manivannan B. Contraceptive evaluation and toxicological study of aqueous extract of the seeds of Carica papaya in male rabbits. J Ethnopharmacol 2000;70:17-27.
7.    Akinnawo OO, Taiwo VO, Ketiku AO, Ogunbiyi JO. Weight changes and organ pathology in rats given edible larvae of Cirina forda (Westwood). Afr J Biomed Res 2005;8(1):35-9.
8.    Saidu Y, Bilbis LS, Lawal M, Isezuo SA, Hassan SW, Abbas AY. Acute and sub-chronic toxicity studies of crude aqueous extract of Albizzia chevalieri Harms (Leguminosae). Asian J Biochem 2007;2(4):224-36.
9.    Harborne JB. Photochemical methods; Chapman and Hall; London; 1973. pp. 1-32.
10. Fielding D, Matheron G. Rabbits; CTA and Macmillan; 1991. pp. 77-83.
11. Vijayalakshmi T, Muthulakshmi V, Sachdanandam P. Toxic studies on biochemical parameters carried out in rats with Serankottai nei, a siddha drug-milk extract of semecarpus anacardium nut. J Ethnopharmacol 2000;69:9-15.
12. Dancier JV, Lewis SM. Practical Haematology, 7th edition; Churchhill Livingstone; Edinburgh, London, Melbourne, New York; 1991. pp. 1-7,37-66.
13. QBC II Manual: Operator’s manual: QBCII Centrifugal Haemat.
14. Kiernan JA. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice; Pergamon Press; Oxford, New York, Toronto Sydney, Paris, Frankfurt; 1981. pp. 1-87.
15. Tilkian SM, Conover MB, Tilkian AG. Clinical implications of laboratory tests; C.V. Mosby Company; St. Louis, Toronto, London; 1979. pp. 3-44; 117-32;154-9.
16. Sanmugapriya E, Venkataraman S. Toxicological investigations on Strychnos potatorum Linn seeds in experimental animal models. J Health Sci 2006;52(4):339-43.
17. Ali BH, Bashir AK. Toxicological studies on the leaves of Avicennia marina (mangrove) in rats. J Appl Toxicol 1998;18(2):111-6.
18. Taiwo VO, Olukunle OA, Ozor IC, Oyejobi AT. Consumption of aqueous extract of raw Aloe vera leaves: histopathological and biochemical studies in rat and tilapia. Afr J Biomed Res 2005;8:169-78.
19. Pieme CA, Penlap VN, Nkegoum B, Taziebou CL, Tekwu EM, Etoa FX, Ngongang J. Evaluation of acute and subacute toxicities of aqueous ethanolic extract of leaves of Senna alata (L.) Roxb (Ceasalpiniaceae). Afr J Biotechnol 2006;5(3):283-9.