Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Pregledni članak:

Giuseppe Lippi1*, Emmanuel J Favaloro2. Karika koja nedostaje između genotipa, fenotipa i kliničkih nalaza. Biochemia Medica 2009;19(2):137-45.
 
1Odsjek za kliničku kemiju, Odjel za morfološke i biomedicinske znanosti, Sveučilište u Veroni, Verona, Italija
2Odsjek za hematologiju, Institut za kliničku patologiju i medicinska istraživanja, Bolnica Westmead, Westmead, Australija
Corresponding author*: ulippi [at] tin [dot] it, giuseppe [dot] lippi [at] univr [dot] it
 
Sažetak
 
Broj genetskih testova bilježi eksponencijalan rast u kliničkim laboratorijima, zahvaljujući izvanrednim znanstvenim i tehnološkim dostignućima, uz potporu relativno jeftinih, brzih, pouzdanih i visoko propulzivnih tehnika. Sasvim je neupitno da je genetsko testiranje pomoglo u identificiranju molekularne osnove monogenskih bolesti, kao i mnoštva gena upletenih u većinu poligenskih patologija. To je pak omogućilo individualizaciju liječenja i farmakološke terapije. Međutim, to je isto tako stvorilo jedan paradoks u upravljanom liječenju bolesnika prema kojemu se genetsko testiranje sad često vidi kao panacea, „lijek za sve“, pretpostavljajući kako je svaki pojedini genetski polimorfizam udružen sa specifičnim, pojedinim fenotipom i/ili kliničkom slikom. Nažalost, više procesa koji reguliraju ekspresiju proteina ostaje i dalje nepoznato, dok njihova biološka osnova još nije konačno prepoznata, pa veza između genotipa, fenotipa i kliničkih nalaza nije uvijek očita te je često još teže ispitati u kojoj će mjeri veza između gena i okoline utjecati na liječenje bolesnika. Cilj ovoga članka je pružiti kritički osvrt na složen i višeslojan odnos koji povezuje gene, biokemiju i kliničke podatke, s naglaskom na prednosti i nedostatke genetskog testiranja kod monogenskih i poligenskih bolesti, te u predviđanju farmakološkog odgovora.
Ključne riječi: genotip; fenotip; klinički nalazi; genetsko testiranje
Pristiglo: 2. ožujka 2009.                                                                                                                                      
Prih
vaćeno: 21. travnja 2009.

                                                                                             

Uvod
 
Genetika je znanost o nasljeđivanju i raznovrsnosti živih organizama, koja istražuje funkciju gena, ustrojstvo genoma, organizaciju kromatina, stopu rekombiniranja, procese mutacije i povijest evolucije, kako bi pružila suvislo shvaćanje ljudskog genoma i njegovog složenog odnosa s biologijom, fiziologijom i bolešću. Genomika se pak u pravilu definira kao intenzivni napori da se odredi cjelokupna sekvenca DNA pojedinih organizama te da se provede podrobno genetsko mapiranje uključujući studije intragenomskih pojava kao što su heteroza, epistaza, pleiotropija i druge interakcije između lokusa i alela unutar genoma. Genetsko testiranje se prvotno razvilo prije gotovo dvadeset godina, a njegova izvorna primjena bila je ograničena na savjetovanje i prenatalnu dijagnostiku kod nekoliko nasljednih bolesti. Zahvaljujući završetku projekta humanog genoma (engl. Human Genome Project, HGP) (1) te projektu koji je potom uslijedio International HapMap Project, (od kojih su oba opisali genetske varijacije, uglavnom polimorfizme jednog nukleotida među različitim pojedincima te uzroke varijacija u genomu) (2), i uz izvanredna tehnološka dostignuća, genetsko testiranje je danas široko rasprostranjeno u kliničkim laboratorijima, uz pomoć relativno jeftinih, brzih i pouzdanih visoko propulzivnih tehnika. Genetska analiza doista je ljudima omogućila da shvate molekularnu osnovu nekih bolesti, izazvala je paradigmatski pomak u dijagnostici i kliničkom pristupu monogenskim bolestima (npr. hemofiliji, talasemiji, itd.), pomogla je identificirati razne gene upletene u većinu pretežito poligenskih bolesti (npr. šećerna bolest, tumori, venska tromboembolija, srčanožilne bolesti), omogućila je individualizaciju liječenja i osobito farmakoloških terapija. Međutim, ona je isto tako dovela do paradoksa u liječenju bolesnika, a to je da se genetsko testiranje većinom smatra panaceom, „lijekom za sve“, uz pretpostavku da je svaki pojedini genetski polimorfizam udružen sa specifičnim, pojedinačnim fenotipom i kliničkom slikom. No, istina je drukčija, kako za monogenske, tako osobito za poligenske bolesti. O nekoliko primjera govori se niže u tekstu.
Monogenske bolesti
Hemofilija A je teška nasljedna bolest krvarenja uzrokovana X-vezanim recesivnim mutacijama koje dovode do nedostatka funkcionalnog faktora VIII (FVIII). Učestalost bolesti u populaciji (otprilike 1 na 5000–10.000 muških živorođenih) uzrokovana je visokom stopom mutacije, poglavito u muškim zametnim stanicama, odnosno de novo somatskim mutacijama u ranoj embriogenezi (3). Tradicionalno se smatra da su najteži oblici nedostatka FVIII (npr. oni s aktivnošću FVIII < 1%) udruženi s izrazito povećanim rizikom od krvarenja zbog običnih ozljeda, koje zahvaća zglobove, mišiće, probavni sustav i mozak. Kod umjereno teških oblika bolesti (npr. aktivnosti FVIII između 1% i 5%) krvarenja mišića i zglobova također su česta, ali je moguć i nastup krvarenja u probavnom sustavu i mozgu (4,5). Glavni problem u upravljanom liječenju hemofiličara je personalizacija profilakse i terapije. Iako se većina znanstvenika i kliničara oslanja na tradicionalnu klasifikaciju bolesti (teška, umjerena, blaža), višestruki klinički dokazi govore kako se težina simptoma uvelike razlikuje među bolesnicima, kao i među onima koji nose iste (genetske) molekularne defekte. Složenosti ovoga pitanja doprinosi i nepostojanje čvrste korelacije između kliničke težine hemofilije i rezultata koagulacijskih pretraga (aktivnost nedostatnih faktora, vrijeme zgrušavanja pune krvi, tromboplastinski test probira), jer 10-15% bolesnika s teškom hemofilijom (< 1% aktivnosti faktora zgrušavanja) imaju relativno blagu kliničku bolest, rijetko krvare i ne trebaju profilaktičnu terapiju (4,5). Štoviše, nastup najteže komplikacije kod hemofiličara, tj. razvoj antitijela na FVIII (nazvana „inhibitorima“) je vrlo heterogen (6). Iako je objavljeno kako bi razvoj inhibitora mogao biti češći u bolesnika s teškom hemofilijom A i mutacijama koje predviđaju nulti alel, nego u onih s missense mutacijama, sveukupna prediktivna vrijednost genetskog testiranja je upitna, jer bi se 33% do 78% hemofiličara moglo pogrešno klasificirati prema njihovom pojedinačnom genetskom riziku (7).
Usprkos ovim podacima, zaključili bismo da se pojedini genotipovi kod hemofiličara (kao i kod drugih monogenskih bolesti) ne odražavaju uvijek jednakim biokemijskim i kliničkim fenotipovima. Prvo i najvažnije, aktivnost FVIII u plazmi (FVIII:C) slična je, ali se ne preklapa u bolesnika s jednakim mutacijama, jer je poluživot FVIII u plazmi navodno kraći u bolesnika s krvnom grupom O i niskom aktivnošću von Willebrandova faktora (VWF) (5). Prema tome, današnji pristup kojim se nedostatak ispravlja nadomjesnom terapijom (rekombinantni FVIII ili rjeđe svježa smrznuta plazma) zasnovan je na kliničkim podacima i postojećoj aktivnosti FVIII:C u plazmi, a ne na pojedinačnom genotipu. Uz raznoliku udruženost genotipa s ostatnom aktivnosti faktora zgrušavanja, drugi dokazi ukazuju na to da farmakokinetika primijenjenih koncentrata faktora zgrušavanja, prisutnost protrombotskih biljega (8) i varijacije drugih koagulacijskih proteina procijenjene testovima sveopće hemostaze te fibrinolitički sustav mogu djelovati na trenutnu aktivnost FVIII:C u plazmi i kliničku težinu krvarenja (4,5,9). Sve u svemu, ovi dokazi navode na neizbježan zaključak kako je podrijetlo velike heterogenosti fenotipova kod teške hemofilije multifaktorsko, pa bi doprinos genetskog testiranja stoga bio ograničen; zato će se upravljana skrb o bolesnicima u bliskoj budućnosti uvelike voditi kliničkim značajkama i fenotipskim laboratorijskim pretragama kao što su testovi aktivnosti faktora i moguće testovi stvaranja trombina. Čak i kad predviđa kliničku težinu hemofilije, složeni sustav za procjenu težine hemofilije, Hemophilia Severity Score (HSS), previđa genotip, a umjesto toga uključuje samo godišnju incidenciju krvarenja zglobova, procjenu zglobova prema World Federation of Hemophilia Orthopedic score i godišnji čimbenik potrošnje (10).
Poligenske bolesti
Srčanožilna bolest je prvi uzrok pobola i smrtnosti u zapadnim zemljama te predstavlja znatno ekonomsko opterećenje na razini pojedinca, ustanova i države. Točna procjena različitih razina rizika i utvrđivanje najprimjerenije trijaže bolesnika vodeći su ciljevi za optimalno kliničko i isplativo bavljenje ovom patologijom (11). Uza svu svojstvenu fenotipsku složenost, prisutnost višestrukih uzročnih čimbenika predstavlja dodatni izazov u istraživanju genetske osnove srčanožilne bolesti (12). Zapravo, iako postoji znatno preklapanje među raznim fenotipovima, osnovna patofiziologija obično se razlikuje, jer ishemijski ispadi (odnosno akutni infarkt miokarda) često, ali ne uvijek proizlaze iz prsnuća krhkog aterosklerotskog plaka, a čimbenici rizika i njihove interakcije koji dovode do te krhkosti razlikuju se od onih koji utječu na koronarno aterosklerotsko opterećenje (12). Tako su tisuće znanstvenih epidemioloških studija provedenih u posljednjim desetljećima dovele do otkrića snažne ali složene genetske osnove koja se ogleda u poremećenim koncentracijama lipida i lipoproteina, poremećajima u metabolizmu glukoze (osobito šećerna bolest), pretilosti, hipertenziji, upali, oksidacijskom stresu i hiperkoagulabilnosti (12).
Uz mogući doprinos dijagnostici monogenskih bolesti, genetsko testiranje bi se u budućnosti moglo pokazati vrijednim i kod poligenskih bolesti kao što je srčanožilna bolest, gdje bi ono omogućilo individualni pristup bolesniku, uključujući određivanje razine rizika za primarnu ili sekundarnu profilaksu, trajanje antikoagulantne terapije te u obiteljska ispitivanja. U takvoj situaciji učestalost specifičnih nasljednih čimbenika (npr. hipertenzija, hiperkolersterolemija) te značajan rizik što ga čini kombinacija dodatnih, rjeđih genetskih defekata dodatno ukazuje na potrebu provođenja genetskih analiza. Međutim, kako je gore napomenuto, kombinirani učinci genotipova i/ili haplotipova tako su složeni i mnogostruki da se kod nekih bolesnika mogu razviti ishemijske komplikacije bez ikakvih čimbenika rizika koje bi bilo moguće utvrditi, dok se kod drugih to neće dogoditi iako su nositelji „visoko rizičnih“ genotipova. Uzimajući kao gotovu činjenicu da brojni rizični čimbenici potiču razvoj infarkta miokarda, od životnih navika koje se mogu promijeniti (npr. pušenje, tjelesna aktivnost) do genetske predodređenosti, analize gena kandidata provođene tijekom dva desetljeća nisu dosad uspjele objasniti molekularnu osnovu genetske predodređenosti za ovu patologiju (13). Štoviše, još preostaje dokazati jesu li sve alelne varijante koje se dovode u vezu sa srčanožilnim bolestima doista udružene s funkcionalnim učincima koji utječu na predviđanje rizika, te dostižu li objavljene veličine učinka te udruženosti dovoljan stupanj kliničke značajnosti (14).
Moguće je da će odgovarajuća i diskretna primjena genetskih testova, u razumnim uvjetima i prema kliničkoj situaciji (probir ili dijagnostika), otvoriti velike mogućnosti. Zbog sve većih ograničenja troškova i stoga upitne uporabe za klasificiranje rizika procijenjeni trošak ne opravdava preventivni probir u velikim populacijama zdravih ljudi (15). Međutim, osobe s visokim obiteljskim rizikom mogle bi imati koristi od strategija ranog otkrivanja te od biokemijskih pretraga i testova na osnovi DNA, kojima bi se njihov rizik mogao podrobnije definirati. Osobe s najvišim obiteljskim rizikom možda su nositelji mendelijanskih poremećaja udruženih s velikim rizikom za preranu koronarnu arterijsku bolest, pa treba razmisliti o njihovu upućivanju na genetsku procjenu (16).
Farmakogenetika
Kumarinski antikoagulansi čine glavnu skupinu lijekova u oralnoj antikoagulantnoj terapiji (OAT), a među njima je varfarin najčešće rabljeni antikoagulans širom svijeta. Upravljano liječenje bolesnika na OAT vrlo je zahtjevno zbog raznolikosti odgovora na određenu dozu lijeka, pa bi personalizirani odgovori pružili vrijednu mogućnost za ograničavanje opterećenja neželjenim zdravstvenim ishodima. Danas nekoliko vrsta dokaza potvrđuje kako je 50-60% pojedinačnih farmakoloških odgovora na varfarin i druge antikoagulantne lijekove genetski određeno pod utjecajem polimorfizama gena koji kodiraju reduktazu epoksida vitamina K (VKOR) i citokrom P450 CYP2C9 (17). Stoga se farmakogenetsko testiranje predlaže kao vrijedna pomoć u predviđanju odgovora na početnu dozu tijekom terapije te za procjenu razlika u dozi održavanja. Međutim, genetsko testiranje ni ovdje ne predstavlja panaceu, jer je podložno višestrukim ograničenjima koja uključuju optimalan sastav zbirke testova, ograničene podatke o razlikama među pojedincima, nedostatak specifikacija kvalitete i osobito nedostatak analiza konačnog ishoda koje bi nedvosmisleno potvrdile isplativost ovoga pristupa. Glavna prepreka proizlazi iz prevladavajućeg oslanjanja na pojedinačni farmakološki odgovor na varijable okoline i „slučajne“ događaje kao što su različit unos vitamina K, probavna funkcija, metaboličke nenormalnosti koje utječu na sintezu čimbenika zgrušavanja ovisnih o vitaminu K, alkohol, te drugi lijekovi (18,19). Zato je prerano zaključiti da bi rutinsko genetsko testiranje dovelo do nedvojbeno povoljnog odnosa troškova i koristi, iako bi razvoj i kliničko vrednovanje jednostavnih ali sveobuhvatnih algoritama koji objedinjavaju najinformativnije genske polimorfizme s nekim demografskim i kliničkim varijablama mogao pružiti vrijedno sredstvo za pojedinačno upravljano liječenje bolesnika varfarinom.
Zašto i gdje nedostaje karika
Ekspresija proteina se regulira na nekoliko razina uključujući: a) transkripcijske/posttranskripcijske/predtranslacijske procese koji utječu na kvantitativnu razinu ekspresije mRNA; b) translacijske procese koji reguliraju pretvorbu mRNA u proteine; i c) posttranslacijske/degradacijske procese koji utječu na stabilnost poluživota proteina. Postoji i nekoliko drugih mogućih procesa koji su još nepoznati ili njihova biološka osnova nije prepoznata. Uz gensku transkripciju, ima dodatnih aspekata koji će utjecati na ekspresiju proteina, uključujući genske interakcije, istodobno prisutne bolesti, biološku varijabilnost i okolinu.
Lipoprotein(a) (Lp(a)) je paradigmatski primjer kako sve te varijable mogu djelovati na prevođenje genotipa u fenotip. Metabolizam ovoga neobičnog i visoko aterogenog lipoproteina navodno podliježe strogoj genetskoj regulaciji, jer kvantitativni i kvalitativni polimorfizmi na lokusu gena apolipoproteina(a) utječu na 90% njegove koncentracije u plazmi (20). S obzirom na to, očekivali bismo da će genetsko testiranje moći pouzdano predvidjeti biokemijski fenotip i kliničke nalaze koji u konačnici pokazuju koncentraciju u plazmi i aterogenost. To je tek djelomice točno, jer postoji očito razmimoilaženje između genotipa, fenotipa i kliničkih podataka (Slika 1.). Zapravo, prisutnost nekih elemenata koji reagiraju na interleukin 6 u sekvenci ovoga gena uzrokuje znatan porast koncentracije u plazmi kao odgovor na upalu (21). Slično tomu, spolni hormoni i tjelesna aktivnost također reguliraju gensku transkripciju prema višim vrijednostima, bubrežno zatajenje može dovesti do nakupljanja imunoreaktivnog Lp(a) u plazmi, jer se Lp(a) također izlučuje putem bubrega, dok su neki prehrambeni sastojci (npr. alkoholna pića) i zatajenje jetre udruženi sa znatnim sniženjem njegove koncentracije u plazmi, jer je ovaj organ glavno mjesto sinteze apolipoproteina(a) (21,22). Kako se konačna čestica Lp(a) sklapa u plazmi kovalentnim spajanjem dijelova apolipoproteina(a) i apolipoproteina B lipoproteina niske gustoće, koncentracija ovoga potonjeg u plazmi ima snažan utjecaj na razine Lp(a) (21). I konačno, glede aterogenosti Lp(a), u tijeku je rasprava o tome jesu li visoke razine Lp(a) sukladne s dugovječnosti, pa bi se ova pojava mogla pokazati očitim paradoksom (23). Međutim, dosljedno se izvještava o tome da je aterogenost Lp(a) usko povezana (podređena) s istodobnom prisutnošću dodatnih čimbenika rizika (odnosno hiperkolesterolemijom i hiperhomocisteinemijom), koji bi na koncu mogli razotkriti ili pojačati njegov aterogeni i anti-fibrinolitički potencijal (24).
 
Slika 1. Čimbenici koji utječu na koncentraciju lipoproteina(a).
 
Zaključne napomene
 
Glavno područje translacijske medicine je nastojanje da se premosti jaz između eksperimentalnih istraživanja i kliničke prakse, te da se razrade i objave novi podaci koji bi mogli pomoći u prevenciji, dijagnostici i liječenju bolesti (25-27). Sa završetkom HGP mnogi istraživači sad ispituju kako to geni i proteini međusobno djeluju da bi stvorili druge proteine. Nažalost, poveznica između genotipa, fenotipa i kliničkih podataka nije uvijek očita, pa je to veći izazov ispitivati u kojoj će mjeri veza između gena i okoline utjecati na upravljano liječenje bolesnika. No, nema nikakve sumnje da će saznanja koja se danomice stječu u prediktivnim znanostima obilježenim zajedničkim dometkom -omika (genomika, proteomika, lipidomika, metabolomika, citomika) pokrenuti i poticati širok spektar istraživanja, što će omogućiti da se rasvijetli nekoliko faza na genetsko-podstanično-molekularno-biokemijskoj razini. Tada će biti moguće prevladati tradicionalni mehanistički pristup bolesti i razviti personalizirani okvir za klasificiranje bolesnika u različite (čak pojedinačne) podskupine, svaka od njih sa zajedničkim ali jedinstvenim značajkama (25-28). S izumom epigenetske tehnologije velikog kapaciteta zasnovane na čipovima (npr. ChIP-on-chip i ChIP-seq), genetsko će se testiranje proširiti dalje od genske ekspresije i istraživati aktivnost genske regulacije, čime će se prevladati nedostaci svojstveni tradicionalnom genetskom testiranju i omogućiti istodobno mjerenje relativnih razina ekspresije tisuća pojedinih gena.
Daljnje prepreke odnose se na financijska, etička, regulatorna i praktična pitanja te na kraju, iako jednako važno, na nedostatak djelotvorne komunikacije između laboratorijskih stručnjaka i kliničara u cilju najboljeg mogućeg iskorištenja i tumačenja laboratorijskih mogućnosti (29,30). Priklonili bismo se dvama idealnim pristupima koji istražuju višestruke odnose između genetike, biokemije i kliničkih nalaza. Studije genetske udruženosti pružaju izglede za mapiranje uzročnih gena umjerenih učinaka, ali su ograničene, jer se istodobno može ispitivati tek manji broj gena. Za razliku od ovih, genomske studije udruženosti (engl. genome-wide association, GWA) uskoro će otkriti novi scenarij za razumijevanje ljudske biologije, fiziologije i patologije (31). DNA čipovi (engl. microarray) se izrađuju pomoću visoko brzinske robotike, što omogućava usporednu izraženost velikog mnoštva gena i studije za otkrivanje gena. Pokus sa samo jednim DNA čipom može istraživačima pružiti podatke o tisućama gena istodobno, što predstavlja golem iskorak koji je, međutim, vrlo zahtjevan za izvedbu na obje strane (laboratorijskoj i kliničkoj). Kako se studije GWA uglavnom temelje na komercijalnim čipovima jednonukleotidnih polimorfizama za koje je sveobuhvatna pokrivenost genoma opći kriterij procjene (32), glavna prepreka je ponovno omjer troškova i koristi, jer je postupak i dalje preskup i klinički upitan. Kako bi se spriječio predvidiv i katastrofičan scenarij ograničavajuće regulacije genetskog testiranja diljem svijeta (od ljekarna do „virtualnih“, nekontroliranih sredstava na webu) (33), laboratorijsko savjetovanje će biti prvi korak slijedom kojega će se proizvođače upućivati na razvijanje najkorisnijih i predvidivih čipova, dok će kliničare upućivati prema najprobranijoj primjeni ovih moćnih sredstava.
U zaključku, postavlja se slijedeća zagonetka: kakav je stvaran odnos između genotipa, fenotipa i kliničkih podataka? I k tome, što je još provokativnije, hoće li analiza genotipa zamijeniti fenotipsko testiranje u rutinskoj laboratorijskoj praksi? Zasad nema jednoznačnog odgovora na ova pitanja. Genetsko testiranje doista ima velik unutarnji potencijal za identificiranje rizičnih brakova, neinvazivno prenatalno određivanje spola ploda i preimplantacijsku genetsku dijagnostiku. Ono isto tako pomaže u predviđanju, dijagnosticiranju i liječenju patologija, ali se ne može smatrati „magičnom kuglom“ u gore spomenutim patologijama, kao ni u drugim poremećajima, jer se predvidivost genetskog testiranja postupno smanjuje tijekom ovog translacijskog procesa (Slika 2.). Razmotriti treba i neka važna etička pitanja. U ovom trenutku je veza između genetskog testiranja i kliničkih podataka slaba kod nekih patologija, tako da bi procjena rizika mogla velik broj bolesnika izložiti lažnom ohrabrenju ili pak pretjeranoj zabrinutosti. Nadajmo se da će nam daljnja znanstvena i tehnološka postignuća pomoću u razumijevanju stvarne uloge, korisnosti i učinkovitosti genetskih analiza, očekujući da one još neće zamijeniti fenotipsko testiranje koje ostaje temeljnim uporištem laboratorijske prakse u godinama koje dolaze.
 
 
Slika 2. Slaba veza između genotipa, fenotipa i kliničkih podataka zbog smanjenih prediktivnih vrijednosti rezultata genetskog testiranja.
 
 
Literatura
 
 1.   International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001;409:860-921.
 2.   International HapMap Consortium. A haplotype map of the human genome. Nature 2005;437:1299-320.
 3.   Oldenburg J, Ananyeva NM, Saenko EL. Molecular basis of haemophilia A. Haemophilia 2004;10(Suppl 4):133-9.
 4.   van den Berg HM, De Groot PH, Fischer K. Phenotypic heterogeneity in severe hemophilia. J Thromb Haemost 2007;5(Suppl 1):151-6.
 5.   Jayandharan GR, Srivastava A. The phenotypic heterogeneity of severe hemophilia. Semin Thromb Hemost 2008;34:128-41.
 6.   Franchini M, Lippi G. Acquired factor VIII inhibitors. Blood 2008;112:250-5.
 7.   Margaglione M, Castaman G, Morfini M, Rocino A, Santagostino E, et al. AICE-Genetics Study Group. The Italian AICE-Genetics hemophilia A database: results and correlation with clinical phenotype. Haematologica 2008;93:722-8.
 8.   Sanna V, Zarrilli F, Nardiello P, D’Argenio V, Rocino A, Coppola A, et al. Mutational spectrum of F8 gene and prothrombotic gene variants in haemophilia A patients from southern Italy. Haemophilia 2008;14:796-803.
 9.   Salvagno GL, Astermark J, Lippi G, Ekman M, Franchini M, Guidi GC, Berntorp E. Thrombin generation assay: a useful routine check-up tool in the management of patients with haemophilia? Haemophilia 2009;15:290-6.
10.   Schulman S, Eelde A, Holmström M, Ståhlberg G, Odeberg J, Blombäck M. Validation of a composite score for clinical severity of hemophilia. J Thromb Haemost 2008;6:1113-21.
11.   Lippi G, Guidi G. Risk factors for cardiovascular disease. CMAJ 2002;166:710.
12.   Ding K, Kullo IJ. Evolutionary genetics of coronary heart disease. Circulation 2009;119:459-67.
13.   Schunkert H, König IR, Erdmann J. Molecular signatures of cardiovascular disease risk: potential for test development and clinical application. Mol Diagn Ther 2008;12:281-7.
14.   Lanktree M, Oh J, Hegele RA. Genetic testing for atherosclerosis risk: inevitability or pipe dream? Can J Cardiol 2008;24:851-4.
15.   Lippi G, Salvagno GL, Targher G, Guidi GC. Multiple biomarkers for the prediction of first major cardiovascular events and death: considerable costs and limited benefits. MedGenMed 2007;9:34.
16.   Scheuner MT. Genetic evaluation for coronary artery disease. Genet Med 2003;5:269-85.
17.   Bussey HI, Wittkowsky AK, Hylek EM, Walker MB. Genetic testing for warfarin dosing? Not yet ready for prime time. Pharmacotherapy 2008;28:141-3.
18.   Lippi G, Salvagno GL, Guidi GC. Genetic factors for warfarin dose prediction. Clin Chem 2007;53:1721-2.
19.   Lippi G, Salvagno GL, Guidi GC. Genetic analysis to prevent warfarin complications. CMAJ 2007;177:377.
20.   Lippi G, Guidi G. Lipoprotein(a): an emerging cardiovascular risk factor. Crit Rev Clin Lab Sci 2003;40:1-42.
21.   Lippi G, Braga V, Adami S, Guidi G. Modification of serum apolipoprotein A-I, apolipoprotein B and lipoprotein(a) levels after bisphosphonates-induced acute phase response. Clin Chim Acta 1998;271:79-87.
22.   Lippi G, Targher G, Franchini M, Guidi GC. Biochemical correlates of lipoprotein(a) in a general adult population. Possible implications for cardiovascular risk assessment. J Thromb Thrombolysis 2009;27:44-7.
23.   Lippi G, Franchini M, Guidi GC. Lipoprotein(a), athero-thrombosis and longevity. A historical paradox finally elucidated? Haematologica 2007;92:e48.
24.   Lippi G, Guidi G. Biochemical risk factors and patient’s outcome: the case of lipoprotein(a). Clin Chim Acta 1999;280:59-71.
25.   Lippi G, Plebani M, Guidi GC. The paradox in translational medicine. Clin Chem 2007;53:1553.
26.   Plebani M. The changing scenario in laboratory medicine and the role of laboratory professionals in translational medicine. Clin Chim Acta 2008;393:23-6.
27.   Plebani M, Marincola FM. Research translation: a new frontier for clinical laboratories. Clin Chem Lab Med 2006;44:1303-12.
28.   Lippi G, Franchini M, Montagnana M, Guidi GC. Genomics and proteomics in venous thromboembolism: building a bridge toward a rational personalized medicine framework. Semin Thromb Hemost 2007;33:759-70.
29.   Lippi G, Fostini R, Guidi GC. Quality improvement in laboratory medicine: extra-analytical issues. Clin Lab Med 2008;28:285-94.
30.   Plebani M. The clinical importance of laboratory reasoning. Clin Chim Acta 1999;280:35-45.
31.   Hirschhorn JN, Daly MJ (2005) Genome-wide association studies for common diseases and complex traits. Nat Rev Genet 6:95-108.
32.   Li M, Li C, Guan W. Evaluation of coverage variation of SNP chips for genome-wide association studies. Eur J Hum Genet 2008;16:635-43.
33.   Lippi G, Siest G, Plebani M. Pharmacy-based laboratory services: past or future and risk or opportunity? Clin Chem Lab Med 2008;46:435-6.