Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Izvorni znanstveni članak

 

Roberta Petlevski1, Dubravka Juretić1, Mirko Hadžija2, Milivoj Slijepčević2, Jana Lukač-Bajalo3. Koncentracija malondialdehida u NOD miševa tretiranih akarbozom. Biochemia Medica 2006;16(1):43-9.
1Farmaceutsko-biokemijski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zavod za medicinsku biokemiju i hematologiju, Zagreb
2Zavod za molekularnu medicinu, InstitutRuđer Bošković”, Zagreb
3Zavod za kliničku biokemiju, Farmaceutski fakultet, Sveučilište u Ljubljani, Ljubljana, Slovenija
Corresponding author: rpetlevski [at] pharma [dot] hr
 
Sažetak
 
Cilj: Malondialdehid (MDA) je jedan od toksičnih produkata lipidne peroksidacije, a koristi se u evaluaciji oksidativnog stresa tijekom šećerne bolesti. Cilj ovog rada bio je ispitati učinak akarboze (inhibitora a-glukozidaza) na koncentraciju glukoze u serumu i MDA u homogenatu jetre NOD (engl. non-obese diabetic) miševa.
Materijali i metode: U NOD miševa šećerna bolest inducirana je i.v. aplikacijom aloksan-monohidrata (75 mg/kg t. mase). NOD miševi podijeljeni su u 4 skupine (n=6): Kontrolni, zdravi NOD miševi (K), Kontrolni, zdravi NOD miševi tretirani 7 dana akarbozom (K/A), dijabetični NOD miševi (D) te dijabetični NOD miševi tretirani 7 dana akarbozom (D/A).
Koncentracija glukoze u krvi izmjerena je glukoza oksidaza-peroksidaza metodom, a koncentracija MDA u homogenatu jetre određena je upotrebom metode s tiobarbiturnom kiselinom.
Rezultati: Nakon sedmodnevnog tretmana akarbozom zabilježeno je statistički značajno smanjenje koncentracije glukoze u krvi u skupini D/A u odnosu na skupinu D (p<0.05), a isto tako je uočen i statistički značajan pad koncentracije MDA (p<0.05).
Zaključak: Ovi rezultati potvrđuju pozitivan antioksidacijski učinak akarboze što se može objasniti njezinim antihiperglikemijskim djelovanjem.
Ključne riječi: oksidativni stres, šećerna bolest, lipidna peroksidacija, akarboza
 
Pristiglo: 8. rujna 2005.                                                                                                            Prihvaćeno: 27. ožujka 2006.
 
Uvod
 
Proces lipidne peroksidacije je jedan oblik oksidativne promjene polinezasićenih masnih kiselina koji rezultira nastankom citotoksičnih produkata, a jedan od njih je malondialdehid (MDA) (1). MDA je prihvaćeni biljeg lipidne peroksidacije te se koristi u evaluaciji oksidativnog stresa (1). Mogući uzroci oksidativnog stresa u šećernoj bolesti su slijedeći: a) prekomjerno stvaranje reaktivnih kisikovih spojeva (ROS), posebno superoksid aniona (O2–) b) smanjena ekspresija/aktivacija endotelne NO sintaze c) oštećena ekspresija/aktivacija superoksid dismutaze (SOD) d) smanjena aktivnost antioksidativnih enzima: katalaze (CAT) i glutation peroksidaze (GPx) e) smanjena razina antioksidanasa: glutationa, a-tokoferola i askorbata. f) povećana neenzimska glikacija proteina i stvaranje tzv. produkata kasne glikacije (AGE) g) povećana autooksidacija glukoze h) hiperaktivnost poliolnog puta i stvaranje sorbitola.
Reaktivni kisikovi spojevi (ROS) mogu promijeniti funkciju endotela krvnih žila indirektno preko povećane produkcije produkata kasne glikacije (AGE) ili povećanjem oksidacije lipoproteina niske gustoće (LDL). Najvažniji od reaktivnih kisikovih spojeva je superoksid anion (O2–) koji uzrokuje kontrakciju glatkih mišića krvnih žila (2). Glavne posljedice oksidativnog stresa su: narušavanje strukture biomembrana, oštećenje nukleinskih kiselina, inhibicija enzima, razgradnja bjelančevina i lipidna peroksidacija. Kemijska modifikacija aminokiselina u proteinima tijekom lipidne peroksidacije rezultira formiranjem lipooksidacijskih produkata koji služe kao markeri oksidativnog stresa in vivo. Malondialdehid (MDA) i 4-hidroksinonenal (HNE) su dobro definirani oksidacijski produkti polinezasićenih masnih kiselina (3). MDA reagira s proteinima krvnih žila npr. s kolagenom i dovodi do promjena u njegovoj strukturi (4). Mnoge su studije pokazale da je njegova koncentracija znatno povišena u šećernoj bolesti (5). U radu Faure i sur. je opisano da je kontrola glikemije neophodna za smanjenje lipidne peroksidacije, odnosno koncentracije MDA (6). Akarboza je prvi lijek izbora u tretmanu šećerne bolesti tipa 2, a isto tako novija istraživanja pokazuju njen povoljan učinak na prevenciju šećerne bolesti u osoba sa oštećenom tolerancijom glukoze (7). Stoga je cilj ovog rada bio evaluirati oksidativni stres i lipidnu peroksidaciju u NOD miševa kojima je šećerna bolest izazvana aloksanom, određivanjem koncentracije MDA u homogenatu jetre jer je i jetra jedan od organa u kojem je dokazana povećana lipidna peroksidacija u tom patološkom stanju, te ispitati učinak akarboze na koncentraciju tog parametra lipidne peroksidacije.
 
Materijali i metode
Eksperimentalne životinje
U ovom radu korišteni su miševi soja NOD (engl. non-obese diabetic) u dobi od 3–4 mjeseca i tjelesne mase 23–30 g, uzgojeni u Laboratoriju za molekularnu endokrinologiju i transplataciju, Instituta “Ruđer Bošković”. Životinje su držane u metaboličkim kavezima na temperaturi od 22–24 °C u 12-satnom svjetlo/tama ciklusu te su hranjene standardnom laboratorijskom hranom (Pliva, Zagreb) i davana im je voda ad libidum.
U našem eksperimentu šećerna bolest u NOD miševa izazvana je i.v. aplikacijom aloksan-monohidrata (Sigma, St. Louis, MO) u dozi od 75 mg/kg tjelesne mase sedam dana prije početka tretmana akarbozom. Životinje su podijeljene u 4 skupine, po 6 u svakoj. Kontrolna, zdrava skupina NOD miševa (K), kontrolna, zdrava skupina NOD miševa tretirana 7 dana akarbozom u dozi od 25 mg/100 g standardne laboratorijske hrane (K/A), skupina dijabetičnih NOD miševa (D), skupina dijabetičnih NOD miševa tretirana 7 dana akarbozom u dozi od 25 mg/100 g standardne laboratorijske hrane (D/A).
Neposredno prije žrtvovanja u eter narkozi NOD miševima je izvađena venska krv u kojoj je određena koncentracija glukoze.
Priprema homogenata jetre
Nakon žrtvovanja u eter narkozi, NOD miševima je izvađena jetra te višekratno isprana u fiziološkoj otopini te držana na hladnom do obrade. Jetra je izvagana, a zatim homogenizirana pomoću Ultra-Turax homogenizatora tip TP 1812 NR 3219 (tri puta pri 13 000 rpm/30 sek.). Homogenat u koncentraciji 100 g/L načinjen je uz pomoć 0,14 M otopine KCl-a te uz stalno hlađenje u vodi s ledom. Homogenati jetre su zatim centrifugirani na 12 000 g 30 minuta pri +4°C u Eppendorf centrifugi Hettich EBA 12 R. Nakon centrifugiranja homogenati jetre su čuvani na –20°C do analize. U tako dobivenom homogenatu jetre određena je koncentracija MDA.
Određivanje koncentracije MDA
Lipidna peroksidacija određena je mjerenjem malondialdehida (MDA) u homogenatima jetre NOD miševa uz pomoć tiobarbiturne kiseline (8). Metoda se temelji na slijedećem principu: zagrijavanjem tiobarbiturne kiseline i višestruko nezasićenih masnih kiselina u kiselom mediju kao sekundarni produkt nastaje ružičasti MDA, čija se apsorbancija mjeri spektofotometrijski kod valne dužine od 532 nm. Apsolutna količina MDA očitana je iz baždarnog dijagrama koji je pripremljen iz različitih razrijeđenja matičnog standarda 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP).
Određivanje koncentracije glukoze
Glukoza u krvi NOD miševa određena je metodom glukoza oksidaza-peroksidaza (GOD-PAP) (9) reagensima tvrtke Trace. Apsorbancija uzorka očitana je prema slijepoj i standardu pri valnoj dužini od 500 nm.
Statistička metoda
Srednja vrijednost (sv) i standardna devijacija (sd) izračunate su pomoću računala korištenjem programa Excel, MicrosoftÒ. Razina značajnosti (p) izračunata je korištenjem Student-t-testa, istog programa. Statistički značajnom promjenom smatrana je promjena za koju je p<0,05.
 
Rezultati
Koncentracija glukoze u serumu NOD miševa
Tablica 1. prikazuje koncentraciju glukoze u serumu NOD miševa izmjerenu sedmog dana od početka tretmana akarbozom. Koncentracija glukoze kontrolne, zdrave skupine NOD miševa (skupina K) je 4,63 ± 0,30 mmol/L, dok je u kontrolnoj skupini s dodatkom akarboze u hrani u dozi od 25 mg/100 g standardne laboratorijske hrane (skupina K/A) izmjerena koncentracija glukoze 2,85 ± 0,42 mmol/L tj. zabilježen je njen statistički značajan hipoglikemijski učinak (p<0,001). NOD miševi sa šećernom bolesti (skupina D) imaju statistički značajno višu koncentraciju glukoze u usporedbi s kontrolnom, zdravom skupinom NOD miševa (skupina K) (p<0,01). U skupini D izmjerena koncentracija glukoze u serumu bila je 31,28 ± 4,54 mmol/L, dok je u dijabetičnih NOD miševa tretiranih akarbozom u dozi od 25 mg/100 g standardne laboratorijske hrane (skupina D/A) izmjerena koncentracija glukoze bila 16,44 ± 9,5 mmol/L što je također statistički značajno niže u usporedbi s dijabetičnom skupinom D (p<0,05).
Koncentracija MDA u homogenatu jetre NOD miševa
Koncentracija MDA mjerena je u homogenatu jetre NOD miševa i rezultati su također prikazani u tablici 1.
 
Tablica 1. Koncentracija glukoze u serumu (mmol/L) i koncentracija MDA u jetri NOD miševa (mM/g jetre)
 
Koncentracija MDA mjerena u jetri kontrolnih, zdravih NOD miševa (skupina K) bila je 13,02 ± 1,84 mM/g. U skupini zdravih NOD miševa koja je tijekom sedam dana bila tretirana akarbozom u dozi od 25 mg/100 g standardne laboratorijske hrane (skupina K/A) izmjerena je statistički značajna niža koncentracija MDA u jetri 9,25 ± 1,04 mM/g (p<0,01). Dijabetična skupina NOD miševa (skupina D) imala je statistički značajno višu koncentraciju MDA u usporedbi s kontrolnom, zdravom skupinom (p<0,05). Promjena koncentracije MDA mjerena u dijabetičnoj skupini NOD miševa tretiranoj akarbozom u dozi od 25 mg/100 g standardne laboratorijske hrane (skupina D/A) bila je statistički značajno niža u usporedbi sa skupinom D (p<0,05) (12,65 ± 5,73 mM/g vs. 24,57 ± 3,75 mM/g).
 
Rasprava
 
Oksidativni stres je karakteriziran povećanom produkcijom slobodnih radikala i/ili smanjenom aktivnosti antioksidativne obrane. U eksperimentalnom modelu šećerne bolesti, stanje oksidativnog stresa je izazvano auto-oksidacijom glukoze i glikacijom proteina (10). Oksidativnom stresu danas se posvećuje velika pažnja kao procesu koji je vjerojatno odgovoran za nastanak komplikacija u šećernoj bolesti (ateroskleroza, nefropatija, neuropatija i retinopatija) (11,12). Jedna od posljedica oksidativnog stresa je i lipidna peroksidacija. Od parametara lipidne peroksidacije mjere se: koncentracija lipidnih peroksida, koncentracija konjugiranih diena te koncentracija malondialdehida (MDA) koji je visokotoksičan konačni produkt lipidne peroksidacije vjerojatno nastao njihovim neenzimskim oksidativnim raspadom. Altomare i suradnici (13) uspoređivali su koncentracije MDA u skupinama: osoba sa šećernom bolesti sa slabo kotroliranom glikemijom, dobro kontroliranom glikemijom i usporedili rezultate sa zdravim, normoglikemičnim osobama. Njihovi rezultati pokazuju znatan porast koncentracije lipidnih peroksida u plazmi pacijenata sa slabo kontroliranom glikemijom u usporedbi s druge dvije skupine ispitanika. Pokus Armstronga i sur. (14) pokazao je da već i strogo nadziran način prehrane kod osoba sa šećernom bolesti dovodi do sniženja koncentracije MDA.
Hiperglikemija u šećernoj bolesti je primarni uzrok oksidativnom stresu i lipidnoj peroksidaciji. Ona naime uzrokuje promjene u staničnom redoks statusu preko nekoliko različitih mehanizama: mijenja regulaciju protein tirozin kinaza, mijenja regulaciju protein kinaze C, dovodi do nakupljanja sorbitola te povisuje omjer NADH/NAD+ i smanjuje omjer NADPH/NADP+ preko hiperaktivnosti sorbitol (poliolnog) puta. Posljedica svega toga je neravnoteža citosolnog redoks statusa ili to stanje se naziva i pseudohipoksija, zbog povišenog omjera NADH/NAD+ koji prikriva hipoksiju tkiva (15).
Primjena lijekova koji snizuju hiperglikemiju (posebno postprandijanu) je važna u smanjivanju komplikacija u šećernoj bolesti uzrokovanih oksidativnim stresom.
Stoga smo u ovom radu ispitali hipoglikemijski učinak akarboze i njen utjecaj na oksidativni stres, odnosno lipidnu peroksidaciju u NOD miševa. Akarboza je pseudooligosaharid dobiven kao sekundarni metabolit iz kultura Actinomycetales. Molekula akarboze se sastoji iz nezasićenog cikloheksitolskog ostatka koji je vezan za aminošećer i dva glukozna ostatka putem a-1,4 glikozidnih veza. Njen antihiperglikemijski učinak temelji se na činjenici da je ona kompetitivni inhibitor intestinalnih a-glukozidaza, koje obuhvaćaju glukoamilaze, saharaze, maltaze i a- dekstrinaze, a ti su enzimi neophodni za razgradnju škroba, saharoze i maltoze (16). Akarboza se veže na navedene a-glukozidaze s afinitetom koji je 10 000 do 100 000 puta veći od istog npr. saharoze. Inhibicija ove enzimske aktivnosti akarbozom smanjuje brzinu nastanka monosaharida i njihovu apsorpciju u tankom crijevu. I novija istraživanja potvrđuju učinak akarboze na smanjenje postprandijalne hiperglikemije u osoba s oštećenom tolerancijom glukoze i osoba s tipom 2 šećerne bolesti (17). Akarboza također smanjuje makrovaskularne komplikacije, odnosno oštećenje endotela u postprandijalnoj hiperglikemiji (18). Znanstvena istraživanja su potvrdila da je oksidativni stres uključen u patogenezu kardiovaskularnih bolesti tijekom šećerne bolesti. Međutim, još je uvijek nejasno da li oksidativni stres nestaje smanjenjem postprandijalne hiperglikemije. U radu autora Assaloni i sur. dokazano je da se kontrolom postprandijalne hiperglikemije oralnom primjenom mitiglinida smanjuje oksidativni stres i lipidna peroksidacija i na taj način spriječava nastanak kasnih dijabetičnih komplikacija (19).
U ovom radu prikazana je statistički značajno povišena koncentracija MDA u jetri (p<0,05) i glukoze u serumu (p<0,01) u NOD miševa u kojih je šećerna bolest izazvana aloksanom (D) u usporedbi s kontrolnom, zdravom skupinom (K) što potvrđuje stanje oksidativnog stresa i lipidne peroksidacije u dijabetičnoj skupini NOD miševa. Pokusom je dokazan hipoglikemijski učinak akrboze u maloj dozi (25 mg /100 g standardne laboratorijske hrane) (p<0,05), a također je zabilježen i povoljan učinak akrboze na stanje oksidativnog stresa, naime u dijabetičnih NOD miševa nakon tretmana akrbozom u trajanju od sedam dana (skupina D/A), koncentracija MDA bila je statistički značajno niža (p<0,05) u usporedbi s dijabetičnom skupinom NOD miševa (skupina D). Povoljan učinak akarboze na koncentraciju MDA može se objasniti njenim antihiperglikemijskim učinkom.
 
Literatura
 
1.   Bukan N, Sancak B, Yavuz O, Koca C, Tutken F, Ozcelikay AT, Altan N. Lipid
2.   peroxidation and scavening enzyme levels in the liver of streptozotocin-induced diabetic rats. Indian J Biochem Biophy 2003; 40(6):447-50.
3.   Bayraktutan U. Free radicals, diabetes and endothelial dysfunction. Diab Obes Metab 2002;4:224-38.
4.   Requena JR, Fu MX, Ahmed MU, Jenkins AJ, Lyons TJ, Thorpe SR. Lipoxidation products as biomarkers of oxidative damage to proteins during lipid peroxidation reactions. Nephrol Dial Transplant 1996;11 Suppl 5:48-53.
5.   Tiku ML, Allison GT, Naik K, Karry SK. Malondialdehyde oxidation of cartilage collagen by chondrocytes. Osteoarthritis Cart 2003;11(3):159-66.
6.   Slatter DA, Bolton CH, Bailey AJ. The importance of lipid-derived malondialdehyde in diabetes mellitus. Diabetologia 2000;43(5):550-7.
7.   Faure P, Corticelli M. Lipid peroxidation and trace element status in diabetic ketotic patients: Influence of insulin therapy. Clin Chem 1993;39:789-93.
8.   Van de Laar FA, Lucassen PLBJ, Akkermans RP, Van de Lisdonk EH, Ruten GEHM, Van Weel C. Alpha-glucosidase inhibitors for type 2 diabetes mellitus. Cochrane Database System Rev (2): PUB 2, 2005.
9.   Uchyjama M, Mihara M. Determination of malondialdehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Anal Biochem 1977;86:271-8.
10. Burrin JM, Price CP. Measurement of blood glucose. Ann Clin Biochem 1985;22:327-42.
11. Feillet-Coundray C, Rock E, Coundray C. Lipid peroxidation and antioxidant status in experimental diabetes. Clin Chim Acta 1999;284:31-43.
12. Maritim AC, Sanders RA, Watkins JB. Diabetes, oxidative stresss and antioxidants: a review. J Biochem Mol Toxicol 2003;17(1):24-38.
13. Baynes JW. Role of oxidative stress in development of complications in diabetes. Diabetes 1991;40:405-12.
14. Altomare E, Vendemiale K et al. Increased lipid peroxidation in Type 2 poorly controlled diabetic patients. Diabetes and Metabolisme 1992;18:246-71.
15. Armstrong AM, Chestnutt JE et al. The effect of dietary treatment of lipid peroxidation and antioxidant status in newly diagnosed non-insulin dependent diabetes. Free Rad Biol Med 1996;21:719-26.
16. Williamson JR, Chang K, Frangos M et al. Hyperglycaemic pseudohypoxia and diabetic complications. Diabetes 1993;42:801-13.
17. Clissold SP, Edwards C. Acarbose. A preliminary review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic potential. Drugs 1988;35:214-43.
18. Charpentier G, Riveline JP, Dardari D, Varround-Vial M. Should postprandial hyperglycaemia in prediabetic and type 2 diabetic patients be treated? Drugs 2006;66(3):273-86.
19. Shimabukuro M, Higa N, Chinen I, Yamakava K, Takahasu N. Effects of a single administration of acarbose on postprandial glucose excursion and endothelial dysfunction in Type 2 diabetic patients: A randomized crossover study. J Clin Endoc Metab 2006;91(3):837-42.
20. Assaloni R, Da Ros R, Quagliaro L, Piconi L, Maier A, Zuodar G, Motz E, Ceriello A. Effects of S21403 (mitiglinide) on postprandial generation of oxidative stress and inflammation in type 2 diabetic patients. Diabetologia 2005;48;1919-24.