Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

 Izvorni stručni članak

 

Jelica Gluhak-Heinrich1, Wuchen Yang2, Marie A. Harris2, Stephen E. Harris2. Kvantitativna in situ hibridizacija povećane osjetljivosti u mekom, koštanom i zubnom tkivu pomoću RNA probi označenih digoksigeninom. Biochemia Medica 2008;18(2):59-80.
 

1 Klinika za ortodonciju, Sveučilište u Texasu, Zdravstveni znanstveni centar u San Antoniju, San Antonio, Teksas, SAD

2 Klinika za periortodonciju, Sveučilište u Texasu, Zdravstveni znanstveni centar u San Antoniju, San Antonio, Teksas, SAD

  
*Adresa za dopisivanje: gluhak [at] uthscsa [dot] edu
 
Sažetak
Uvod: Kvantitativna neradioaktivna in situ hibridizacija je moćna tehnika za lokalizaciju ekspresije transkripata mRNA. Ove metode omogućavaju otkrivanje mRNA uz visoku rezoluciju na razini jedne jedine stanice. Dosad najšire opisani neradioaktivni protokoli rabili su deblje kriostatske rezove mekog tkiva i lokalizirali visoko zastupljene gene bez kvantificiranja.
Materijali i metode: Mi smo razvili metodu neradioaktivne insitu hibridizacije pomoću tankih rezova demineraliziranog koštanog tkiva uklopljenog u parafin, uz otkrivanje nisko zastupljenih gena i kvantifikacijuinsitu signala. Naš protokol zasniva se na optimalnoj sintezi digoksigeninom obilježenih DNA probi za vizualiziranje vrlo nisko zastupljenih gena u mekom, koštanom i zubnom tkivu uklopljenom u parafin. Naša nova tehnika prikazuje insitusignal uz umnožavanje i pojačanje boje kroz reakciju alkalne fosfataze.
Rezultati: Osjetljivost je na razini radioaktivnih protokola, a rezolucija je na razini pojedine stanice, što je bolje nego kod radioaktivnih protokola. Kvantificiranje insitu hibridizacijskog signala, što se ranije radilo pomoću radioaktivnog ili fluorescentnog obilježavanja, sad je moguće s alkalnom fosfatazom pomoću naše tehnike i programa ImageJ.
Zaključak: Prikazani primjeri pokazuju kako slijedeća metoda ima bolju dokazanu rezoluciju i jednaku osjetljivost kao radioaktivno obilježene metode u različitim tkivima s mogućom kvantifikacijom; to pak pokazuje da se ova metoda općenito može rabiti u istraživačkim kao i u kliničkim laboratorijima.
Ključne riječi: kvantitativnainsituhibridizacija, digoksigeninske probe, koštano tkivo uklopljeno u parafin
Pristiglo: 14. kolovoza 2007.                                                                                                 Prihvaćeno: 29. rujna 2007.
 
 
Uvod
Pokusi u kliničkim i istraživačkim laboratorijima često zahtijevaju in situ lokalizaciju mRNA tkivno specifičnih bioloških biljega i njihovu kvantifikaciju unutar specifičnih stanica tkiva (1,2). Prošlo je 37 godina otkako je objavljen prvi protokol za in situ hibridizaciju (3). Od toga vremena objavljeni su brojni radovi o ovoj tehnici, koja se danas uvelike rabi u bazičnim i kliničkim istraživanjima (4-7). Objavljeni su radovi koji izvještavaju kako neradioaktivna in situ hibridizacija može pokazivati jednaku osjetljivost kao radioaktivna hibridizacija (8). Idealno bi takve tehnike trebale omogućiti otkrivanje mRNA koja je prisutna u vrlo maloj količini na staničnoj razini, ali s osjetljivošću i kvantifikacijskim mogućnostima radioaktivno obilježenih probi pomoću 33P ili 35S. Neki laboratoriji prednost daju otkrivanju kolorimetrijskim pred fluorescentnim metodama; razlog za to je to što rezultat nije osjetljiv na svjetlo, neće s vremenom izblijediti i nema žurbe sa slikama, koje se isto tako mogu ponovno snimati bez fluorescentnog mikroskopa. Prednost fluorescentnih metoda je sulokalizacija mRNA in situ, jer ove metode omogućavaju vrlo dobro otkrivanje višestrukih probi i lako kvantificiranje hibridizacijskog signala. S druge strane, fluorescentna in situ hibridizacija se tradicionalno provodila s teškoćama, uključujući nizak signal, visok pozadinski signal i autoflurescenciju, naročito u koštanom tkivu (9).
Većina objavljenih protokola za neradioaktivnu in situ hibridizaciju razvijena je uz primjenu debljih kriorezova (10-12) te nekolicina uz uporabu tkiva uklopljenog u parafin (13,14). Taj se pristup primjenjivao za vremenske i prostorne uzorke u mekom tkivu s visoko zastupljenim genima. Osjetljiviji hibridizacijski protokoli i otopine bili su potrebni za signal visoke rezolucije u tankim rezovima koštanog i zubnog tkiva, uz primjenu nisko zastupljenih gena na razini pojedinačne stanice.
Neka od ovih pitanja je, na sreću, riješila pojava sustava pojačavanja signala tiramidom (TSA, PerkinElmer), koji smo mi rabili za povećanje osjetljivosti (15).
U ovom izvješću podrobno opisujemo postupnik za otkrivanje mRNA pomoću pojačavanja signala i tehnika za povećan razvoj boje u usporedbi s dvjema drugim različitim neradioaktivnim tehnikama i jednom radioaktivnom tehnikom in situ hibridizacije, koje smo također razvili i primijenili u našem laboratoriju. Ove su tehnike vrlo osjetljive i mogu se primjenjivati na tankim parafinskim rezovima mekog tkiva, kao i demineraliziranog zubnog i koštanog tkiva. Ove tehnike mogu otkriti signale nisko zastupljenih gena s jednakom osjetljivošću kao i radioaktivne metode, ali na razini jedne stanice, što se može kvantificirati.
 
Materijali i metode
Priprava DNA kalupa bez RNaza
RNA probe za in situ hibridizaciju načinjene su transkripcijskom reakcijom in vitro. Svaki sklop s različitim cDNA probama uveden u plazmidni vektor za transkripciju in vitro sadržavao je promotor T3, T7 ili SP6. Kako bismo svaku probu prepisali samo iz željene cDNA (a ne iz čitavog vektora), naše smo vektore digestirali i napravili linearizirane DNA kalupe.
Za pripravu DNA kalupa bez RNaza željenom je restrikcijskom endonukleazom digestirano otprilike 20 mg plazmidnog sklopa koji je sadržavao cDNA za probu (Slika 1.) uz primjenu 100 mL reakcijskog volumena. Ova je količina bila dostatna da omogući obilježavanje najmanje 10 puta.
 
Slika 1. Ova slika je primjer kako stvoriti antisense i sense RNA probe transkripcijom cDNA kalupa iz plazmidnog sklopa. Dio plazmidnog sklopa obojen svijetlo sivo (S-obilježeni je sense lanac, sekvenca ista kao mRNA) i crno (AS-obilježeni je antisense lanac, sekvenca komplementarna mRNA) predstavlja umetak cDNA probe kloniran na poliklonskom mjestu plazmida (obojen tamno sivo). Bluescript plazmid ima polimeraze T3 i T7 (točkasto), uporaba kojih može transkribirati sense ili antisense RNA probe uz primjenu cDNA umetka kao kalupa probe. Da bismo lokalizirali mRNA u tkivu, stvoriti ćemo antisense RNA probu koja je komplementarna mRNA sekvenci (sense). Sense probe se mogu rabiti za kontrolu. Za stvaranje antisense RNA probe plazmid treba prije transkripcije izrezati s odgovarajućim restrikcijskim enzimom blizu 5’ sense lanca (svijetlo sivo) cDNA inserta. Izrezivanje plazmida ograničiti će samo transkripciju cDNA inserta, isključujući vektorske sekvence. Nova antisense RNA proba može se sintetizirati iz 3’ završetka sense cDNA lanca (svijetlo sivo) kao kalup uz uporabu pripadajuće polimeraze (u ovom slučaju T3). Za stvaranje sense RNA probe plazmidnu DNA treba izrezati s drugim odgovarajućim restrikcijskim enzimom blizu 3’ završetka sense cDNA lanca (svijetlo sivo) i može se sintetizirati iz 3’ završetka antisense cDNA lanca (crno) kao kalup uporabom pripadajuće polimeraze (u ovom slučaju T7).
 
Linearizirani kalupi su ekstrahirani pomoću TRIS-HCl zasićenog fenola, pH = 8 (bez RNaza) i kloroform-izoamil alkoholom (49:1) u omjeru 1:1, dva puta, te jedanput samo kloroformom. Vodena faza je precipitirana pomoću 3 M natrij acetata, pH = 5,5 (konačna molarnost 0,3 M natrij acetata) i 3 volumena 100%-tnog etanola preko noći na –20 °C. Kuglica DNA dobivena centrifugiranjem isprana je ledenim 70% etanolom (razrijeđenim vodom bez RNaza iz 100%-tnog etanola ). Na zraku osušena kuglica je rastopljena u 20 mL 10 mM TRIS (pH = 7,5) (bez RNaza) i pohranjena na –20 °C do kasnije uporabe. Izmjerene koncentracije kalupa za probe bile su između 0,5 i 1,5 mg/mL.
 
Priprava antisense i sense mRNA probi za in situ hibridizaciju
Za svaku probu rabili smo standardnu in vitro transkripcijsku reakciju s digoksigeninom UTP (16). Transkripcijska smjesa koju smo pripravili sadržavala je slijedeće komponente: 1 mL inhibitora RNaza (40 U/mL), 3 mL H2O bez RNaza, obrađene pomoću DEPC (dietil pirokarbonat, Sigma) (17), 4 mL 5X SP6 ili T3, T7 polimerazni pufer (Promega ili Roche), 2 mL DTT (10X) 0,1 M (Promega ili Roche), 6 mL 10 mM ATP, CTP i GTP (10X) 2 mL od svakoga, 1,3 mL 10 mM UTP (10X), 0,7 mL DIG-11-UTP (10X, Roche), ukupni volumen 18 mL. Nakon inkubacije kroz 1 sat na 37 °C, u ovu transkripcijsku smjesu dodan je 1 mL DNA kalupa bez RNaza i 1 mL SP6, T3 ili T7 polimeraze. Neprepisani DNA kalup je uklonjen pomoću 2 mL DNaze (Roche) u 27 mL pufera DNaze (40 mM TRIS, pH = 7,5; 6 mM MgCl2; 10 mM NaCl) i 1 mL inhibitora RNaza kroz 30 min na 37 °C. Reakcija je okončana pomoću 5 mL 0,2 M EDTA, pH = 8. U ovom trenutku je ukupni volumen naše probe bio 55 mL. Konačno pročišćenje RNA probe provedeno je precipitacijom s 1 mL glikogena (20 mg/mL, Roche), 5,6 mL 3 M Na-acetata i 200 mL (prethodno ohlađenog, –20 °C) 100%-tnog etanola na –20 °C preko noći. Probe su centrifugirane 30 minuta na 4 °C. Kuglica je isprana u 1,0 mL ledenog (-20 °C) etanola, centrifugirana 10 minuta na 4 °C i osušena na zraku. Probe su rastopljene dodatkom 200 mL H2O bez RNaza, uz 2 mL inhibitora RNaza (kako bi se očuvala RNA) i zagrijane na 37 °C, uz vrtnju nekoliko puta tijekom 20-minutne inkubacije. RNA probe su potvrđene elektroforezom na 5% poliakrilamidnim gelovima koji su sadržavali 15 M ureje, ili Northern analizom, pomoću RNA biljega, uz primjenu 1 mL prepisane probe. Probe su kvantificirane primjenom DOT blota za procjenu iskorištenja DIG-obilježene RNA. Probe su pohranjene na –70 °C u alikvotima od po 0,5 ili 1 mg.
Probe veće od 1 kb su hidrolizirane radi boljeg prodiranja u tkivo (18). Za hidrolizu RNA probi rabili smo alkalni pufer za hidrolizu bez RNAza 0,2 M (80 mM Na2HCO3/120 mM Na2CO3), pH = 10,2. Vrijeme inkubacije za hidrolizu izračunali smo prema jednadžbi:
T = L0 – Lf/ L0 × Lf × K,
gdje je T vrijeme u minutama; L0 početna duljina probe u kb; Lf željena duljina probe u kb (mi smo rabili 200 bp);
K = 0,11 (cijepanje lanca/kg na minutu); primjer:
1 kb – 0,2 kb / 1 × 0,2 × 0,11 = 0,8 kb / 0,22 = 36 min.
Reakcija hidrolize provedena je (prema potrebi) nakon digestije pomoću DNaze prije konačnog pročišćavanja probe precipitacijom etanolom. Primijenili smo jednak volumen obilježene RNA probe (50 mL) i pufera za hidrolizu (50 mL) na 60 °C, prilagođavajući vrijeme izračunavanjem gornje jednadžbe. Reakcija hidrolize je zaustavljena pomoću 1/10 (10 mL) volumena Na-acetata, pH = 5,5 i 1/20 volumena (5 mL) 10% ledene octene kiseline (razrijeđene vodom bez RNAza), nakon precipitacije pomoću 3 volumena (300 mL) 100%-tnog etanola, jednako kako je gore opisano za konačno pročišćavanje RNA probe, prilagođavajući postupak za veće volumene.
 
Kvantifikacija digoksigeninom obilježenih RNA probi
Prije pohrane na –70 °C RNA probe su kvantificirane pomoću DOT blota na pozitivno nabijenoj najlonskoj membrani (Slika 2.). Sve digoksigeninom obilježene probe i kontrolna digoksigeninom obilježena RNA serijski su razrijeđene u omjerima 1:10, 1:100, 1:1000 i 1:10.000. Po 1 mL svakog razrjeđenja ukapan je na najlonsku membranu i fiksiran UV transiluminatorom. Najprije je filtar kratko ispran u Puferu 1 (100 mM TRIS-HCl, 150 mM HCl, pH = 7,5) te 5 minuta u Puferu 2 (pufer 1 + 2% reagens za blokiranje, Roche), a potom obrađen konjugatom anti-digoksigeninskih antitijela i alkalne fosfataze (Roche), razrijeđen u omjeru 1:5000 u Puferu 2. Zatim smo proveli dva ispiranja po 5 minuta u Puferu 1 i dvije minute u Puferu 3 (100 mM TRIS-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, pH = 9,5). Za razvijanje boje alkalne fosfataze tijekom 30 minuta na sobnoj temperaturi upotrijebili smo 0,4 mL svježe razrijeđene NBT/BCIP Stock otopine (Roche) ili 90 mL otopine NBT (Roche) i 70 mL BCIP (Roche) u 20 mL pufera 3.
 
 
Slika 2. Kvantifikacija digoksigeninom obilježenih probi uz primjenu DOT blot i kontrolne obilježene RNA tvrtke Roche. Točke obilježene kao 0 predstavljaju nerazrijeđene probe. A predstavlja razrjeđenje probi 1/10, B 1/100, C 1/1000 i D 1/10000. Koncentracija kontrolne probe je 0,1 μg/mL. U ovom primjeru su naše obilježene probe (1-8) imale sličnu koncentraciju kao kontrolna proba (CTR).
 
Primjenjujući gore opisani postupak većina naših probi bila je iste koncentracije kao kontrolna proba nakon obilježavanja. Kontrolna proba bila je koncentracije 0,1 mg/mL. Napravili smo alikvote od 10 mL (1 mg) u svakoj epruveti za sve probe. Alikvotirane probe su spremljene na –70 °C kroz godinu dana za buduće pokuse. Za pokus smo svakom alikvotu dodali 1 mL hibridizirane otopine.
 
Priprava histoloških rezova
Koštano, zubno i meko tkivo je usitnjeno, čuvano na ledu i fiksirano u svježem 4%-tnom paraformaldehidu preko noći na 4 °C (19). Nakon demineralizacije u 15% EDTA, pH = 7,5 i 0,5%-tnom paraformaldehidu kroz 6 tjedana na 4 °C, koštani i zubni uzorci su dehidrirani (uzorci mekog tkiva su dehidrirani slijedećega dana bez demineralizacije) u rastućim koncentracijama metanola (25%, 50%, 80%, 100% dva puta) na ledu, svaka izmjena po 1 sat. Rezovi su uklopljeni u parafin na 56 °C uz 3 izmjene parafina od po 1 sat. Više temperature i duža vremena inkubacije mogu kasnije remetiti imunocitokemiju ako je potrebna nakon in situ hibridizacije. Sva vremena u ovom postupku bila su namještena za komadiće tkiva koji nisu veći od 5 mm u promjeru. Za veće komadiće tkiva potrebna su duža vremena u postupku. Sve otopine nabavljene su bez RNAza ili su obrađene pomoću DEPC (17). Za razmazivanje rezova na predmetna stakalca rabili smo vodu bez RNAza (obrađenu pomoću DEPC) koja je prethodno zagrijana na 50 °C, jer parafin koji smo upotrebljavali ima točku taljenja na 52 °C. Upotrebljavali smo prethodno očišćena i obrađena stakalca nabavljena od Fisher Scientific, koja osiguravaju vrlo nisku pozadinu i optimalno prianjanje tkiva: stakalca ProbeOn Microscope ili Superfrost/Plus Microscope. Nakon nanošenja pripravke smo ručno protresli kako bi se uklonile kapljice vode između reza i tkiva. Stakalca su ostavljena preko noći na stalku okomito na površinu grijača na 55 °C. Rezovi su spremljeni u kutije na +4 °C s desikatorom, tako da će godinama zadržati signal za in situ hibridizaciju i imunocitokemiju. Radi boljeg prianjanja su prije in situ hibridizacije stakalca s rezovima kroz noć do slijedećeg jutra položena vodoravno na zagrijanu ploču na 55 °C (to se nije radilo za imunocitokemiju). Rezovi obrađeni dodatnom toplinskom inkubacijom čuvaju mRNA i takvi rezovi su bolje prionuli uza stakalca kroz čitavo vrijeme in situ hibridizacije.
 
Metode 1, 2 i 3; neradioaktivna in situ hibridizacija; postupci s primjenom digoksigeninom obilježenim probama
Neradioaktivna in situ hibridizacija provedena je postupcima koje smo razvili u našem laboratoriju uz metode koje opisuju drugi istraživači uz primjenu digoksigeninskih probi (7,20). Prije hibridizacije rezovi su deparafinizirani ksilenom i 100%-tnim etanolom nakon rehidracije 50%, 75% i 95% etanolom i PBS (razrijeđenim vodom bez RNAza). Nakon obrade otopinom proteinaze K (Proteinase K, 5 mg/mL u 50 mM TRIS, 5 mM EDTA, pH = 7,6) kroz 10 minuta na 37 °C rezovi su ponovno fiksirani u 4%-tnom formaldehidu u PBS (0,2 M fosfatnog pufera, 0,3 M NaCl), acetilirani (100 mM trietanolamina, 0,25% octeni anhidrid) i predhibridizirani u 2XSSC. Hibridizacija je provedena preko noći na 55 °C u hibridizacijskoj otopini koja je sadržavala 50%-tni formamid, 20 mM TRIS-HCl (pH = 8,0), 1 mM EDTA, 0,3 M NaCl, 10% dekstran sulfat, 1X Denhardtove otopine, 100 mg/mL denaturirane Salmon-Sperm DNA, 500 mg/mL tRNA) i 1 mg/mL DMP1 UTP-digoksigeninom obilježene RNA probe. Nakon hibridizacije su uklonjene pokrovne folije u 5XSSC na sobnoj temperaturi, te su rezovi isprani u 50% formamidu, 5XSSC i 1% SDS otopini na 55 °C dva puta po 30 minuta. Potom su rezovi inkubirani pomoću RNAza (40 mg/mL RNaze A1 i 10 U/mL RNaze T1) u otopini RNaza pufera (0,3 M NaCl, 10 mM TRIS, 5 mM EDTA) na 37 °C kroz jedan sat, nakon čega je slijedila inkubacija u istom puferu bez RNAza kroz 30 minuta. Uzastopno ispiranje na 55 °C uslijedilo je dva puta uz 50% formamid i 2XSSC kroz 30 minuta, te svako tri puta po 5 minuta na sobnoj temperaturi u TBST (100 mM TRIS pH = 7,5, 150 mM NaCl, Tween–20 0,1%). Sada su pripravci bili spremni za otkrivanje hibridizacijskog signala trima različitim metodama.
 
Otkrivanje signala in situ hibridizacije
Metoda 1: otkrivanje alkalnom fosfatazom
Nakon ispiranja rezovi su se kroz 1 sat na sobnoj temperaturi namakali u smjesi za blokiranje: 1% reagens za blokiranje (Roche), svježe razrijeđen u puferu maleične kiseline (100 mM maleične kiseline, 150 mM NaCl, kruti NaOH ili 10 N kako bi se namjestio pH = 7,5). Odsječci anti-Digoxigenin-AP-Fab (Boehringer Mannheim ili Roche) razrijeđeni su u omjeru 1:50 za probu koštanog morfogenetičnog proteina 2 (BMP2), osteokalcina (OC) i osteopontina (OPN), 1:500 u smjesi za blokiranje za probu kolagena 1a1 (Col1) i dodani nakon poslijehibridizacijskog ispiranja i inkubiranja za inkubaciju preko noći na 4 °C. Slijedećega dana su rezovi isprani pomoću TBST kroz 5 minuta puferom za ispiranje (100 mM maleične kiseline, 150 mM NaCl, Tween–20 0,1%, 2 mM levamisola), dva puta kroz 15 minuta, te preddetekcijskim puferom (100 mM TRIS pH = 9, 100 mM NaCl, 2 mM levamisola) kroz 5 minuta. Otkrivanje hibridizacijskog signala provedeno je prema De Blocku i sur. (21) dodavanjem supstrata alkalne fosfataze (NTB/BCIP, Boehringer Mannheim ili Roche) ili NTB (Boehringer Mannheim ili Roche) i BICP (Roche u pufer za detekciju (10% polivinil alkohol 70–100 kd-Sigma, 100 mM TRIS pH = 9, 100 mM NaCl, 2 mM, 50 mM MgCl2, 2 mM levamisola) kako bi se inhibirala endogena alkalna fosfataza, te 10 mM N-etil maleimida za inhibiranje reakcije „dehidrogenaze ničega“ (22). Trajanje razvoja hibridizacijskog signala bilo je od 1 sata do preko noći na 30 °C, ovisno o probi. Kad je otkrivanje hibridizacijskog signala završeno, rezovi su isprani toplom vodom 3 puta po 5 minuta (može se ostaviti u vodi nekoliko dana na +4 °C) i kontraobojeni metilnim zelenim ili nuklearnim brzim crvenilom kroz 5 minuta, dehidrirani u etanolu, isprani u ksilenu i naneseni.
Metoda 2: umnožavanje signala tiramidom i otkrivanje alkalnom fosfatazom
In situ hibridizacija provedena je na isti način kao kod 1. metode, jedino je dodano prigušivanje faze endogene peroksidaze (3% H2O2 u PBS kroz 60 minuta) prije digestije pomoću proteinaze K, nakon toga 3 5-minutna ispiranja pomoću PBS. Taj je korak bio neophodan kako bi se pozadina svela na najmanju mjeru, jer hrenova peroksidaza (HRP) katalizira aktiviranje i kovalentno vezanje DNP amplifikacijskog reagensa.
Za ovo otkrivanje rabili smo in situ sustav TSA plusDNP-AP, Perkin Elmer. Nakon poslijehibridizacijskog ispiranja rezovi su namočeni kroz 30 minuta na sobnoj temperaturi u TNB reagensu za blokiranje: 0,5% reagensa za blokiranje-Perkin Elmer (ili je bila priložena u setu), svježe pripravljena ili pohranjena na –20 °C u TNT puferu (100 mM TRIS pH = 7,5; 150 mM NaCl; 0,05% Tween–20). Antitijelo Anti Digoxigenin-POD (Poly) Fab odsječaka (Boehringer Mannheim ili Roche) razrijeđeno je u omjeru 1:50 u reagensu za blokiranje i inkubirano preko noći na 4 °C nakon 3 puta po 5 minuta ispiranja u TNT-u. Slijedeći korak je bila 3- do 10-minutna inkubacija u reagensu za umnožavanje signala tiramidom (razrjeđena u omjeru 1:50 u 1 x amplifikacijskom razrjeđivaču, oboje isporučeno u setu), nakon 3 puta po 5 minutnih ispiranja u TNT. Nakon ovih ispiranja rezovi su inkubirani u preddetekcijskom puferu (100 mM TRIS pH = 9, 100 mM NaCl, 2 mM levamisola) kroz 5 minuta. Otkrivanje hibridizacijskog signala provedeno je kao kod 1. metode. Trajanje razvoja hibridizacijskog signala bilo je od 10 minuta do 1 sata na 30 °C, ovisno o probi. Rezovi su kontraobojeni i naneseni kao kod 1. metode.
Metoda 3: Umnožavanje signala tiramidom i fluorescentno otkrivanje cijaninom 5
In situ hibridizacija je provedena jednako kao kod 1. metode, samo je dodano prigušivanje faze endogene peroksidaze prije digestije proteinazom K, nakon toga su slijedila tri 3-minutna ispiranja pomoću PBS, kako je opisano za 2. metodu.
U ovoj metodi otkrivanja rabili smo in situ sustav TSA PLUS Fluorescence, Perkin Elmer. Nakon poslijehibridizacijskog ispiranja, kao kod 2. metode, rezovi su namočeni kroz 30 minuta na sobnoj temperaturi u TNB reagensu za blokiranje. Antitijelo Anti Digoxigenin-POD razrijeđeno je u omjeru 1:50 u reagensu za blokiranje i inkubirano preko noći na 4 °C nakon 3 5-minutnih ispiranja u TNT. Nakon inkubacije kroz 3–10 minuta u reagensu za umnožavanje signala tiramidom (isporučeno u setu) slijedila su 3 5-minutna ispiranja u TNT. Nakon ovih ispiranja rezovi su naneseni u fluorescentni medij Vector shield i promatrani pomoću konfokusnog mikroskopa (ekscitacija na 648 nm, emisija na 570 nm).
 
Kvantifikacija hibridizacijskog signala pomoću programa ImageJ
ImageJ je na Javi baziran program za obradu snimaka za javnu uporabu, koji je izradio National Institute of Health (NIH), SAD. Program ImageJ je dostupan za Microsoft Windows, Mac OS, Mac OS X, Linux, Sharp Zaurus PDA i može se prebaciti na čvrsti disk nakon prijave na: http//:rsb.info.nih.gov/ij/download.html.
Ovaj program je izrađen s otvorenom arhitekturom, tako da osigurava mogućnost proširenja putem verzije 1.1 ili kasnijih verzija Java pomoću nadogradnje i makroa koji se mogu snimiti. Prilagođeno prikupljanje, analiza i obrada nadogradnje mogući su pomoću programa za uređivanje ugrađenog u ImageJ i Java prevodnika. Korisnička nadogradnja omogućava rješavanje mnogih problema u obradi i analizi snimaka, od trodimenzijskog prikaza živih stanica do obrade radioloških snimaka, usporedbe podataka višestrukih sustava prikazivanja i automatskih hematoloških sustava.
Mi smo za kvantificiranje signala in situ hibridizacije rabili purpurno plavu boju iz NBT formazana, proizvoda stvorenog reakcijom alkalne fosfataze uz pomoć supstrata BCIP i NTB. Kontrabojanje treba biti vrlo lagano kako ne bi remetilo signal mRNA. Prije upotrebe programa ImageJ može se pod Analyze u Set Measurements izabrati područje, minimalno i maksimalno sivo područje, te srednja vrijednost sivog. Mi smo rabili radnju „free hand selection“ oko područja mjerenja. Sva mjerenja se očitavaju pritiskom na Measure pod Analyze. Sva područja mjerena za hibridizacijski signal ispravljena su za očitanje pozadine. Za definiranje pozadine odabrano je i uprosječeno 5 područja bez hibridizacijskog signala, a potom oduzeto od vrijednosti signala. Svi dobiveni brojevi su relativni.
4. metoda: radioaktivna in situ hibridizacija i otkrivanje signala
Radioaktivna in situ hibridizacija uvelike se provodila pomoću postupaka razrađenih u našem laboratoriju i opisanih u radu Gluhak-Heinrichi suradnika (23). Hibridizacija je provedena pomoću RNA probi 32P rUTP obilježenog kolagena1a1 (Col1) i osteokalcina (OC).
 
Rezultati
Cilj ove studije bio je razviti i odrediti snagu naših neradioaktivnih in situ tehnika u usporedbi s našom dobro utvrđenom i široko primjenjivanom radioaktivnom metodom (23) uz uporabu parafinskih rezova. Kao nov pristup u dokazivanju korisnosti naših novo razvijenih metoda u različitim primjenama, poglavito s parafinskim rezovima, pokazali smo i mogućnost kvantificiranja signala neradioaktivne hibridizacije. Za ispitivanje ove mogućnosti rabili smo demineralizirane tkivne rezove s koštanim, zubnim i mekim tkivom. Najprije smo razradili i optimirali tri različita postupka za metode neradioaktivne in situ hibridizacije. Zatim smo analizirali izraženost Col1 i OC mRNA u rezovima mišje alveolarne kosti blizu prvih kutnjaka pomoću naše rutinske radioaktivne in situ analize (slika 3.). Potom smo utvrdili izraženost Col1, OC i osteoponinske (OP) mRNA neradioaktivnim pristupom (slika 4.). Rabili smo točno iste kalupe naših cDNA za prepisivanje RNA probi obilježenih 32P ili digoksigeninom. Izraženost Col1 i OC mRNA u alveolarnoj kosti i zubima usporedili smo i kvantificirali. Kako bismo dokazali da je naša neradioaktivna metoda broj 2 in situ hibridizacije jednako osjetljiva kao i naša radioaktivna metoda u mekom i koštanom tkivu, ispitali smo tri različite neradioaktivne metode i radioaktivnu metodu trima različitim probama: BMP2 (vrlo nizak broj kopija mRNA), Col1 (vrlo visok broj kopija mRNA) i OP (srednji broj kopija i specifična za osteocite).
 
Slika 3. Radioaktivna in situ hibridizacija Collagen1a1 (A) i Osteocalcin (B) u reprezentativnim rezovima mišje maksile. Pozitivan hibridizacijski signal predstavljen je srebrnim zrncima-crnim točkicama na tkivu. Grimizna boja je kontrabojanje hematoksilinom. Signal iznad pozadine je najviši u osteoblastima i za probu Collagen1a1 i za probu Osteocalcin. Vidi se kako je hibridizacijski signal obilniji za kolagen nego za osteokalcin. PD, periodont; OB, osteoblasti; OC, osteociti.
 
 
Slika 4. Neradioaktivna in situ hibridizacija provedena pomoću digoksigeninom obilježenih probi, Collagen1a1 (A) i Osteocalcin (B) u reprezentativnim rezovima mišje maksile. Pozitivan hibridizacijski signal predstavljen je plavim obojenjem. Zelena boja predstavlja metil zeleno obojenje kao kontraboju. Signal je najviši u osteoblastima i za probu Collagen1a1 i probu Osteocalcin, no isto tako postoji stanovit signal u PDL i stanicama koštane obloge. U ovim rezovima osteociti ne izražavaju niti kolagen niti osteokalcin. Opaža se kako je hibridizacijski signal obilniji za kolagen nego za osteokalcin. PD, periodont; OB, osteoblasti; OC, osteociti; BLC, stanice koštane obloge.
 
 
U razvoju naših in situ postupaka najprije smo ispitali različite parametre za optimalan rad. Rezultati ovih ispitivanja opisani su niže u tekstu.
Naše smo ispitivanje započeli optimalnom pripravom koštanog tkiva. To je ključno, jer in situ hibridizacija uvijek započinje fiksacijom tkiva ili stanica kako bi se očuvala mRNA unutar stanica, kao i tkivna morfologija. Fiksacija paraformaldehidom uz obradu pomoću EDTA treba od početka biti bez RNAza. Isto tako smo utvrdili kako su rezovi debljine 8 mikrona optimalni za naše metode; mogu se rabiti deblji rezovi i debljina bi nam mogla dati više hibridizacijskog signala, ali će se rezolucija smanjiti ako se snimke rade uz veliko uvećanje i možda ne ostanu prionuti uza stakalca kroz čitavo vrijeme hibridizacijskog postupka.
Najbolji rezultati za linearizaciju DNA probi restrikcijskim endonukleazama dobiveni su enzimskim cijepanjem kojim su proizvedeni 5’ ljepljivi ili tupi završetci. Rezultati su također bili bolji ako su probe prije obilježavanja digoksigeninom i prije alikvotiranja radi čuvanja podvrgnute vorteksiranju i zagrijane uz 10 mM TRIS, pH = 7,6 bez RNAza na 65 °C kroz 20 minuta i/ili uz dodatak SDS u 0,1% kako bi se pripomogla topljivost probi.
Dobili smo optimalni signal i nisku pozadinu s 5 mL probe na 1 cm2 stakalca za hibridizaciju, sa svim digoksigeninom obilježenim probama u koncentraciji od 1 mg na 1 mL hibridizacijske otopine. Uporaba veće količine otopine s više probe na mm2 na stakalcu ili više koncentrirane probe dala je jaču pozadinu. Utvrdili smo kako se koncentracija probe može točno procijeniti gel elektroforezom i bojanjem etidijevim bromidom uspoređujući alikvote RNA DIG obilježene probe sa standardnom RNA poznate koncentracije (jedna takva se isporučuje sa setom za obilježavanje DIG) ili usporedbom DOT blota serije razrjeđenja obilježene RNA probe i obilježenih RNA standarda (Slika 2.).
Za radioaktivnu hibridizaciju procijenili smo količinu probe upotrebljenu u gel elektroforezi i kod bojanja etidijevim bromidom s standardom RNA poznate koncentracije. Koncentracija probi koju smo mi rabili kretala se od 100 do 500 ng/mL hibridizacijske otopine, a na stakalca smo dodali 80 mL (10 mL na 1 cm2). Glede duljine probe, naši pokusi su pokazali kako sa probama do 1 kb nema problema kod prodiranja u tkivo kod neradioaktivnog in situ postupka, ali su za radioaktivni in situ postupak sve probe hidrolizirane do prosječne duljine od 150–250 bp kako bi se dobio optimalan signal.
Pri ispitivanju tkivne propustljivosti naša neradioaktivna metoda pokazala je dobre rezultate s 5 mg/mL proteinaze K. Ova je koncentracija prethodno ispitana za našu dobro utvrđenu radioaktivnu metodu (23). Nakon pokusa s različitim koncentracijama proteinaze K najbolje rezultate smo polučili primjenom iste koncentracije kakvu smo rabili za radioaktvni in situ postupak, jer su koncentracije veće od 10 mg/mL proteinaze K uništavale morfologiju i povećavale pozadinu.
U našim prijašnjim i usporednim studijama radeći s radioaktivnom in situ hibridizacijom analizirali smo digestiju s RNazom tijekom faza ispiranja i njezin učinak na pozadinu. Našli smo da je optimalna koncentracija RNaze 40 mg/mL. Ova nam je količina dala najnižu pozadinu, a veće količine su imale manji utjecaj na pozadinu. Velika razlika u smanjenju pozadine kod in situ hibridizacije nastupila je dodavanjem RNaze T1 u količini do 10 U/mL. Ovo ispitivanje je obavljeno uz radioaktivni in situ postupak te je preuzeto za neradioaktivni postupak, pokazujući vrlo čistu, nisku pozadinu.
Ispitivali smo različita razrjeđenja anti-digoksigeninskih antitijela. Najbolje rezultate za visoko zastupljene gene dobili smo s razrjeđenjem 1:500, no za probe koje smo rabili za otkrivanje malobrojnih mRNA ciljeva optimalno razrjeđenje je bilo 1:50.
Temeljito smo ispitivali duljinu vremena za razvijanje obojene otopine enzimatskom reakcijom alkalne fosfataze. Utvrdili smo kako je vrijeme razvijanja za probu Col1 jedan sat, probama OC i OP trebalo je 6 sati, dok je za probu BMP2 kao ciljnu mRNA, koja je prisutna u vrlo niskoj količini, trebalo prekonoćno razvijanje pomoću 1. metode. Ovi su uvjeti vrijedili za razrjeđenje anti-DIG antitijela 1:50. Što su antitijela više razrijeđena, to je više vremena potrebno za razvijanje. Pomoću 2. metode sve su se probe razvile u vremenu od 10 minuta do 1 sata, jer je signal bio pojačan (ovi rezultati nisu prikazani). Naši su rezultati pokazali kako razvijanje duže od 20 sati obično dovodi do jače pozadine nego što je prihvatljivo.
Kvantifikacija rezultata in situ hibridizacije dobivenih pomoću Col1 i OC
Kako je prikazano na slikama 4. i 5., vidljivost signala neradioaktivne hibridizacije može se otkriti na različitim razinama. Najviši intenzitet hibridizacijskog signala otkriven je u odontoblastima (OD) pomoću probe Col1 (slika 5A.). Najniži signal je otkriven u osteoblastima (OB) pomoću probe Col1 (slika 5B. i 6B.). Nakon kvantifikacije je hibridizacijski signal najvišeg intenziteta izmjeren pomoću programa ImageJ kao 95% (100% je crno), dok je najniži otkriven u ovom pokusu bio 23% (0% je bijelo). Druge dvije srednje razine izraženosti bile su slijedeće: signal u odonoblastima (OD) dobiven pomoću OC (80%) i signal u osteoblastima (OB) pomoću Col1 (45%). Slični rezovi hibridizirani istim probama, Col1 i OC, obilježeni radioaktivnošću pokazali su podjednaku izraženost Col1 i OC, prikazano raspodjelom srebrnih zrnaca kao hibridizacijski signal (Slika 1.). Primjenom ove radioaktivne metode lokalizacija signala na staničnoj razini nije bila tako jasna kao kod neradioaktivne lokalizacije.
 
 
Slika 5. Različita jačina hibridizacijskog signala dobivenog neradioaktivnom digoksigeninom obilježenom in situ hibridizacijom Collagen1a1 (A) i Osteocalcin (B) u reprezentativnim rezovima mišje maksilarne alveolarne kosti i dijela prvog kutnjaka. Plavo obojenje predstavlja pozitivan hibridizacijski signal, a zeleno predstavlja kontraboju. Signal je najviši u odontoblastima obilježenima Collagen1a1, nakon čega slijedi signal nižega intenziteta ali još uvijek visok u osteokalcinom obilježenim odontoblastima. Srednja jačina hibridizacijskog signala nalazi se u osteoblastima hibridiziranima pomoću Collagen1a1. Dobro vidljiv ali najniži intenzitet hibridizacijskog signala otkriven je u osteoblastima hibridiziranim osteokalcinskom probom. Stanice koštane obloge također su visoko obilježene. Osteociti ne izražavaju niti kolagen niti osteokalcin u ovim rezovima. Vidi se također kako je hibridizacijski signal obilniji za kolagen nego za osteokalcin i u odontoblastima i u osteoblastima. PD, periodont; OB, osteoblasti; OC, osteociti; BLC, stanice koštane obloge; OD, odontoblasti.
 
 
 
Slika 6. Kvantifikacija uz primjenu ImageJ različitih razina intenziteta hibridizacijskog signala pomoću neradioaktivne in situ hibridizacije. Relativna izraženost Collagen1a1 (A) i Osteocalcin (B) mRNA sa slike 5. kvantificirana je u odontoblastima i osteoblastima. Crna pruga na grafikonu predstavlja gotovo najviši mogući (95%) hibridizacijski signal dobiven pomoću Collagen1a1 mRNA u odontoblastima, označen tamno plavom strelicom kao na slici 5. Osteokalcinska mRNA izražena u odontoblastima, označena tamno sivom prugom u grafikonu i crvenom strelicom na slici 5. predstavlja još uvijek vrlo visok hibridizacijski signal (80% najvišeg signala), iako niži od prethodnoga u odontoblastima obilježenog pomoću Collagen1a1. Slijedeća svijetlo siva pruga u grafikonu koja pokazuje 45% najvišeg hibridizacijskog signala predstavlja izraženost uz Collagen1a1 u osteoblasima, označeno svijetlo plavom strelicom u slici 5. Još uvijek dobro vidljiv (23% najvišeg signala) hibridizacijski signal prikazan bijelom prugom na grafikonu predstavlja osteoblaste hibridizirane osteokalcinskom probom i označene svijetlo crvenom strelicom na slici 5. Zapaža se dobra korelacija hibridizacijskog signala, plave boje u slici 5. s mogućim rasponom kvantifikacije pomoću ImageJ u slici 6.
 
 
Osjetljivost metoda neradioaktivne in situ hibridizacije
Za ispitivanje osjetljivosti naših metoda neradioaktivne in situ hibridizacije u usporedbi s radioaktivnim in situ postupkom uz uporabu tkiva zuba i alveolarne kosti proveli smo hibridizaciju trima različitim neradioaktivnim metodama i radioaktivnom metodom uz primjenu triju različitih probi: BMP2, Col1 i OPN. Probu BMP2 rabili smo kao reprezentativnu za lokaliziranje jedne od mRNA prisutne u najmanjoj količini u kosti. Najbolji hibridizacijski signal neradioaktvnim in situ postupkom dobili smo pomoću 2. metode uz primjenu probe BMP2 obilježene digoksigeninom uz pojačavanje signala tiramidom i otkrivanje alkalnom fosfatazom (Slika 7B.). Intenzitet ovoga signala BMP2 usporediv je s 4. metodom, radioaktivnom in situ hibridizacijom (Slika 7D. i 7E.). Lokalizacija transkripata BMP2 mRNA uz pojačavanje signala tiramidom i otkrivanje fluorescencije cijaninom 5 (3. metoda) pokazala je minimalan hibridizacijski BMP2 signal (Slika 7C.). Neradioaktivni in situ postupak uz otkrivanje alkalnom fosfatazom bez pojačavanja (1. metoda) nije pokazao nikakav hibridizacijski signal za BMP2 (Slika 7A.). Ova 1. metoda nije bila dovoljno osjetljiva da bi obilježila rijetke transkripte BMP2 mRNA.
 
 
 
Slika 7. Izraženost mRNA koštanog morfogenetskog proteina 2 (BMP2) (A-E), Collagen1a1 (Col1) (F-J) i osteopontina (OP) (K-O) u reprezentativnim rezovima mišje maksile izvedena pomoću četiri različite metode in situ hibridizacije: 1. neradioaktivnim in situ postupkom pomoću digoksigeninom obilježenih probi uz otkrivanje alkalnom fosfatazom (A, F, K); 2. neradioaktivnim in situ postupkom pomoću digoksigeninom obilježenih probi uz pojačavanje signala tiramidom i otkrivanje alkalnom fosfatazom (B, G, L); 3. neradioaktivnim in situ postupkom pomoću digoksigeninom obilježenih probi uz pojačavanje signala tiramidom i cijanin 5 flurescenciju (C, H, M); i 4. radioaktivnim in situ postupkom pomoću 32P obilježenih probi i autoradiografskim otkrivanjem (D, I, N, snimci u tamnom polju; E, J, O, snimci u svijetlom polju).
Kod neradioaktivne in situ hibridizacije uz otkrivanje alkalnom fosfatazom (1. i 2. metoda) pozitivni hibridizacijski signal je predstavljen plavom bojom, a crvena boja je kontrabojenje nuklearnog crvenog (A, B, F, G, K, L). Kod neradioaktivne in situ hibridizacije pomoću fluorescencije cijaninom 5 za otkrivanje (4. metoda) pozitivni signal je predstavljen svijetlo crvenom bojom (C, H, M). Bijela srebrnasta zrnca predstavljaju pozitivan hibridizacijski signal na autoradiografima radioaktivne in situ hibridizacije (3. metoda) primjenom prikaza u tamnom polju (D, I, N), a crna srebrnasta zrnca primjenom prikaza u svijetlom polju (E, J, O).
Najbolji hibridizacijski signal za probu BMP2 dobiven je (2. metoda) neradioaktivnim in situ postupkom pomoću digoksigeninom obilježenih probi uz pojačavanje signala tiramidom i otkrivanje alkalnom fosfatazom (B) i (4. metoda) radioaktivnom in situ hibridizacijom (D, E). Zapaža se prednost neradioaktivne lokalizacije BMP2 mRNA na razini stanica (B) u usporedbi s radioaktivnom (D, E). Lokalizacija transkripata BMP2 mRNA pomoću pojačavanja signala tiramidom i cijanin 5 fluorescencije (3. metoda) pokazala je minimalan hibridizacijski signal za BMP2 (C). Neradioaktivni in situ postupak uz otkrivanje alkalnom fosfatazom bez pojačavanja (1. metoda) nije pokazao nikakav hibridizacijski signal za BMP2 (A).
Hibridizacijski signal za probu Col1 lokaliziran je svim četirima in situ metodama (F-O).
Hibridizacijski signal za OP u osteocitima također je nađen svim četirima in situ metodama (F-O).
Opis obilježavanja: d, dentin; PD, periodont; b, kost; OC, osteociti.
 
Probu Col1 rabili smo kao pozitivnu kontrolu, jer ona predstavlja jednu od mRNA prisutne u najvećoj količini u kosti. Hibridizacijski signal Col1 lokaliziran je svim ispitivanim in situ metodama u visokom intenzitetu (Slike 7F. do 7O.).
Probu OP rabili smo kao biljeg za osteocite, koštane stanice uklopljene u matriks. Ovaj gen je znatno manje obilan u kostima nego Col1, ali puno više od BMP2. Hibridizacijski signal za OP u osteocitima također smo našli svim ispitivanim in situ metodama (Slike 7F. do 7O.).
 
Rasprava
Razvili smo visoko osjetljivu metodu in situ hibridizacije na razini s radioaktibnim protokolima, s identifikacijskim fazama koje su presudne za lokaliziranje malog broja kopija mRNA u demineraliziranom tkivu uklopljenom u parafin, uz gotovo nepostojeću pozadinu i s mogućnošću kvantificiranja. Dosad je kvantificiranje za neradioaktivnu in situ hibridizaciju uz pomoć analizatora prikaza opisano samo na japanskom (24), iako je za radioaktivni in situ postupak objavljeno prije 22 godine (25).
Kako bismo ispitali snagu ove tehnike odabrali smo probe koje obilježavaju koštane stanice u zubima i mekom tkivu. Takve probe uključuju Col1, za koju se zna da je prisutna u velikoj količini, dok se OC i OP nalaze uz manji broj kopija, ali se BMP2 nalazi u vrlo malom broju kopija u usporedbi s Col1 u istom tkivu. Kako bismo postigli visoku osjetljivost potrebnu za mRNA prisutnu u maloj količini, optimirali smo presudne faze hibridizacije i otkrivanja da bismo postigli najbolji mogući omjer signala i buke, usporediv s radioaktivnom in situ hibridizacijom. Svi ovi pokusi izvedeni su na sličnim rezovima alveolarne kosti s koštanim, zubnim i periodontnim PDL kao mekim tkivom. To nam je omogućilo laku i jasnu usporedbu hibridizacijskog signala u istim stanicama te između radioaktivne i neradioaktivne hibridizacijske tehnike.
Utvrdili smo kako su slijedeće faze neradioaktivne in situ hibridizacije presudne:
1. kvaliteta fiksiranog tkiva;
2. obilježavanje probe i određivanje koncentracije;
3. prodiranje probe u tkivo;
4. odgovarajuće razrjeđenje anti-digoksigeninskih antitijela;
5. dostatna duljina razvijanja boje kod enzimatske reakcije.
Dobra kvaliteta tkiva za in situ hibridizaciju čuva cjelovitost ciljne mRNA u tkivu uz primjenu odgovarajuće fiksacije bez RNAza, što daje najbolji hibridizacijski signal. Premala fiksacija, međutim, može dovesti do gubitka tkiva i mRNA, dok prekomjerna fiksacija može uzrokovati pretjerano križno povezivanje, što može citoplazmu učiniti relativno nepropusnom za sve probe.
Svi naši protokoli obuhvaćaju postupke sasvim bez RNAza: predhibribridizacijske i hibridizacijske reagense uključujući posude i sve suđe koje će doći u doticaj s tkivom prije ili tijekom hibridizacije. Postupci su već prije opisani (17). Ove mjere opreza u vezi s RNAza su bitni, jer onečišćenje RNAzom može potpuno uništiti ciljne mRNA.
Priprema probi je veoma važna. Prije transkripcije digoksigeninom plazmide koji sadrže umetke cDNA probe treba linearizirati odgovarajućom restrikcijskom endonukleazom kako bi se stvorila samo sekvenca cDNA probe. Važno je da se restrikcijska digestija provede u potpunosti. Mala količina nedigestirane plazmidne DNA može rezultirati ne samo transkriptima probe, nego i vrlo dugim transkriptima cijelog plazmida koji mogu sadržavati znatan odsječak digoksigeninom obilježenog rNTP. Takva vrst obilježene probe neće biti specifična i neće hibridizirati specifične ciljne mRNA. Hibridizacijsko in situ obilježavanje neće postojati ili neće biti specifično. Slični će se rezultati dobiti ako kalup koji se rabi za in vitro transkripciju ne nosi izbočene 5’ krajeve ili ako nemaju slijepe završetke, kako je opisano u literaturi (26). Zbog ovih smo razloga izbjegavali primjenu enzima koji stvaraju izbočene 3’ krajeve, kao što su: Aat II, Bgl I, Cfo I, Hha I, Pvu I, Sfi I, Apa I, Bsp 1286 I, Hae II, Kpn I, Sac I, Sph I, Ban II, Bstx I, HgiA I, Pst I i Sac II. Ako nismo mogli naći odgovarajući enzim, digestiju smo izvodili s enzimima koji stvaraju uvučene 3’ izbočene krajeve, takve završetke treba ispuniti polimeraznom aktivnošću Klenowljeva odsječka DNA polimeraze I E. coli u prisutnosti odgovarajućih deoksinukleotida (dNTP) (17). Smatramo kako su ostali razlozi zbog kojih transkripcijska reakcija izostane ili je slaba slijedeći:
1. odrezana plazmidna DNA koja se rabi kao kalup za transkripciju nije dovoljno čista, stoga treba provesti ponovnu ekstrakciju fenolom/kloroformom i spektrofotometrom provjeriti koncentraciju i čistoću;
2. previše je DNA u transkripcijskoj reakciji, pa je potrebna manja količina DNA;
3. upotrebljena je kriva polimeraza, stoga treba primijeniti ispravnu polimerazu.
Drugi problem može nastati ako proba nije potpuno otopljena i resuspendirana. Prema proizvođačima, nešto je teže raditi s RNA obilježenom digoksigeninom nego s redovnom RNA, vjerojatno zbog hidrofobičnosti haptena što ga čini manje topljivim. Zbog toga ekstrakcija RNA obilježene DIG fenolom/kloroformom dovodi do većih gubitaka i treba ju izbjegavati; međutim, precipitate RNA obilježene DIG može ponekad biti teško ponovno otapati i to može zahtijevati zagrijavanje do 65 °C kroz 20 minuta uz vorteksiranje, miješanje i/ili dodavanje SDS do 0,1% kako bi se pripomoglo topljivosti.
Kod in situ hibridizacije sposobnost probi da prožmu rezove ima velik učinak na jačinu hibridizacijskog signala. Za postizanje najučinkovitijeg signala primjenjuju se tri različite tehnike: s Tritonom, proteazom i proteinazom K (18,27-29). Prema našem iskustvu, Triton dolazi u obzir za smrznute rezove, no za parafinske rezove je proteinaza K pravi izbor. Mi smo upotrijebili 5 mg/mL za obje metode (19). Postoji stanovita dogma za in situ hibridizaciju na rezovima, prema kojoj za dobar prodor duljina obilježene RNA probe treba biti kratka; stoga je optimalna duljina probe 50–150 baznih parova (18). Međutim, obilježena RNA proba može se obraditi blagom lužinom kako bi se hidrolizirala na optimalnu duljinu (valja napomenuti kako se ovom obradom ne uništava digoksigeninski hapten). Međutim, mi smo ustanovili kako smanjenje veličine probe možda i nije tako važno u ovom hibridizacijskom postupku sve dok je veličina probe manja od 1 kb (10).
Iako se prema postojećim protokolima za neradioaktivnu in situ hibridizaciju s digoksigeninom rabe različita razrjeđenja anti-digoksigeninskim antitijela, o toj se količini ili razrjeđenju nije raspravljalo. Mi smo ustanovili kako je nemoguće otkriti mali broj kopija ciljne mRNA uz razrjeđenje 1:5000 anti-digoksigeninskih antitijela (odsječci anti-DIG Fab), kako to preporučuju neki in situ protokoli. Otkrivanje hibridizacijskog signala uvelike ovisi o kopijama mRNA razrjeđenju odjsečaka anti-DIG Fab. Proizvođač za in situ hibridizaicju savjetuje 1:20 do 1:100, ali većina protokola rabi veća razrjeđenja. Možda razlozi visoke pozadine postaju problem u nekim tkivima uz nisko razrjeđenje antitijela i vrijeme razvijanja duže od 1 sata. Mi također mislimo kako je kod razvijanja boje dužeg od 1 sata veoma važno dodati 2 mM levamisola, endogenog inhibitora alkalne fosfataze, kako je to prije preporučeno (27) i 10 mM N-etil maleimida za inhibiciju reakcije „ništa dehidrogenaze“ (22).
Duljina vremena razvijanja obojene reakcije kod digoksigeninske in situ hibridizacije veoma je važna za kvantifikaciju. Za kvantifikaciju treba treba pažljivo motriti razvijanje boje, jer prekomjerno razvijanje boje može dostići najviši mogući intenzitet i podcijeniti najvišu izraženost u usporedbi s drugim nižim izražajnostima mRNA koje s vremenom još uvijek razvijaju boju. Ranije su se in situ kvantifikacije radile samo radioaktivnim i fluorescentnim metodama. Mi smo ovdje pokazali kako našom metodom neradioaktivne in situ hibridizacije možemo kvantificirati različite razine plavog obojenja koje predstavljaju različite razine izražajnosti mRNA te ovu izražajnost uspoređivati u rasponu od 0–100% ili u formatu od 8 bitova od 0 do 256. Ovo je dosad prvi opisani protokol neradioaktivne in situ kvantifikacije.
Naši rezultati pokazuju sličan model in situ hibridizacije kao kod ranije opisane radioaktivne i neradioaktivne in situ hibridizacije (30). Naša 2. metoda neradioaktivne in situ hibridizacije pokazuje hibridizacijski signal kod BMP2, mRNA prisutne u vrlo maloj količini, jednako učinkovit kao signal kod radioaktivne metode. Mi smatramo da su probe obilježene digoksigeninom (ili druge haptenom obilježene probe) bolje u usporedbi s radio-obilježenim probama za svaki pokus, i to zbog stabilnosti probe i mogućnosti njezina čuvanja mjesecima (31). Ostale prednosti neradioaktivnih probi su brže vrijeme do postizanja rezultata i manji broj dana za postupak s digoksigeninom u usporedbi s 3 tjedna za radioaktivni postupak (30). Daljnja prednost je bolja prostorna rezolucija otkrivanja enzima pomoću neradioaktivnih postupaka negoli s radioaktivnošću, što dopušta precizniju lokalizaciju ciljne sekvence (vidi Slike 3., 4., 5. i 7). Nadalje, sve ispitane tehnike neradioaktivne hibridizacije pokazuju jedinstvenu izraženost na razini jedne stanice bez pozadine. Ovdje opisani neradioaktivni postupci ispitani su s velikim uspjehom uz više drugih probi (Slika 7.). Mi smo lokalizirali BMP2 mRNA, poznatu kao jednu od vrlo rijetkih u kosti, pomoću 2. metode (Slika 7B.), uz intenzitet radioaktivno in situ postupka (Slike 7D. i 7E.). Uz primjenu iste probe lokalizirali smo BMP2 u istom tkivu 3. metodom uz nizak intenzitet (Slika 7C.), dok 1. metodom nismo lokalizirali BMP2 (Slika 7A.). Osjetljivost 2. metode jednaka radioaktivnoj metodi (4. metoda) postiže se dvama tehničkim koracima: jedan korak je dodavanje polivinil alkohola (PVA) koji se rabi za pojačanje razvijanja boje tijekom reakcije otkrivanja alkalne fosfataze, gdje BICP (supstrat AP) nakon defosforilacije daje tamno-plavu indigo boju kao oksidacijski proizvod koji se nadalje intenzivira oksidacijom NTB, druge sastavnice supstrata AP. PVA priječi difuziju tamno-plave indigo boje kao proizvoda reakcije AP i to je ono što pojačava obojeni signal. Drugi korak je primjena TSA (pojačavanje signala tiramidom), čime se značajno pojačavaju kromogeni i fluorescentni signali. Za in situ otkrivanje signala tehnologija TSA rabi hrenovu peroksidazu (HRP) pripojenu digoksigeninskim antitijelima vezanima za digoksigeninom obilježene probe za lokaliziranje mRNA, kako bi katalizirala odlaganje dinitrofenilom (DNP) obilježen reagens za pojačavanje neposredno uz imobilizirani enzim peroksidazu iz hrena. Ova DNP obilježja mogu se tada indirektno otkriti pomoću anti-DNP-alkalna fosfataza antitijela i konačno slijedi enzimsko otkrivanje boje. Fluorescentna 3. metoda također upotrebljava tehnologiju TSA. Ovom metodom dobili smo in situ hibridizacijski signal pomoću BMP2 probe, relativno slabo zastupljen u kosti. Intenzitet signala pomoću 3. metode bio je niži nego uz pomoć 2. metode. Razlog: 3. metoda rabi fluorescentno otkrivanje, a ne alkalnu fosfatazu. Fluorescentna 3. metoda također rabi reagens TSA, ali izravno obilježen fluoroforom, što pojednostavljuje otkrivanje za neposredno prikazivanje fluorescentnim mikroskopom. Otkrivanje alkalnom fosfatazom za 2. metodu je osjetljivije nego fluorescentno otkrivanje, jer je nakon reagensa TSA konačno otkrivanje neizravno, uz primjenu dodatnih anti-DNP-alkalna fosfataza antitijela i razvijanja PVA uz AP pojačavanje boje, što traje od 30 minuta do preko noći, a oboje dodatno povećava osjetljivost. Pomoću 1. metode nismo lokalizirali BMP2; ova metoda rabi osjetljivo otkrivanje boje enzimom AP, ali ne rabi TSA umnažanje, što značajno pojačava in situ signal. Naša je procjena da je neradioaktivna 2. metoda najmanje 10 puta osjetljivija od neradioaktivne 1. metode i 3-5 puta osjetljivija od 3. metode. Prednost neradioaktivne lokalizacije BMP2 mRNA pomoću 2. metode je signal na razini stanica (slika 7B.), u usporedbi s radioaktivnom (slike 7D. i 7E.). Razlog za nepreciznu lokalizaciju radioaktivnog signala na razini stanice je širenje energije 32P na okolna područja, što utječe na izloženost fotografske emulzije koja se rabi za otkrivanje hibridizacijskog signala. Rezultat je mnoštvo raspršenih srebrnih zrnaca na izvoru signala radioaktivne hibridizacije i oko njega, što omogućava otkrivanje na razini jedne stanice.
U našem konačnom ispitivanju tehnike in situ hibridizacije rabili smo osteopontinsku (OP) probu kao biljeg relativno slabo prisutne mRNA za osteocite – koštane stanice uklopljene u matriks. Pomoću ove probe lokalizirali smo signale u osteocitima svim neradioaktivnim metodama (Slika 7K., 7L. i 7M.). Intenzitet dobivenog signala bio je usporediv s onim dobivenim radioaktivnom metodom (Slika 7N. i 7O.), dajući tako konačan dokaz korisnosti naših metoda neradioaktivne in situ hibridizacije u različitim stanicama i tkivima.
Smatramo kako primjena ovih neradioaktivnih in situ hibridizacijskih analiza uz naš novi protokol kvantifikacije nudi veće mogućnosti za stjecanje novih bioloških saznanja u mnogim područjima uključujući istraživanje i kliničku kemiju.
 
Zahvala
Studija je provedena uz potporu NIH (National Institutes of Health), NIDCR R03 DE16949 i AR46798.
 
Literatura
1.    Wilkinson DG., ed. In situ hybridization, a practical approach. 1st ed. Oxford: Oxford University Press; 1992.
2.    Polak JM, McGee JO’D. mRNA in situ hybridization and the study of development. In: Wilkinson DG, ed. In situ hybridization, principles and practice. Oxford: Oxford University Press; 1991. p. 113-24.
3.    Gall JG, Pardue ML. Nucleic acid hybridization in cytological preparations. Methods Enzymol 1971;38:470-80.
4.    Somi S, Klein AT, Houweling AC, Ruijter JM, Buffing AA, Moorman AF, van den Hoff MJ. Atrial and ventricular myosin heavy-chain expression in the developing chicken heart: strengths and limitations of non-radioactive in situ hybridization. J Histochem Cytochem 2006;54: 649-64.
5.    Kerekes N, Landry M, Hokfelt T. Leukemia inhibitory factor regulates galanin/galanin message-associated peptide expression in cultured mouse dorsal root ganglia; with a note on in situ hybridization methodology. Neuroscience 1999;89:1123-34.
6.    Wu Y, Peng S, Sheng H. A study of the gene encoding Ki-67 antigen in human pancreatic cancer using non-radioactive in situ hybridization and immunohistochemistry. Chin J Surg 1998; 36(12):732-4.
7.    Wilkinson DG. RNA detection using non-radioactive in situ hybridization. Curr Opin Biotechnol 1995;6:20-3.
8.    Clavel C, Binninger I, Boutterin M-C, Polette M, Birembaut P. Comparison of four nonradioactive and 32S-based methods for the detection of human papillomavirus DNA in situ hybridization. J Virol Methods 1991;33.
9.    Prentice AI. Bone autofluorescence and mineral content. Nature 1965;206:1167.
10. Yang H, Wanner IB, Roper SD, Chaudari N. An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs. J Histochem Cytochem 1999;47:431-45.
11. Haupt C, Tolner EA, Heinemann U, Witte OW, Frahm C. The combined use of non-radioactive in situ hybridization and real-time RT-PCR to assess gene expression in cryosections. Brain Res 2006;1118:232-8.
12. Hoffman GE, Le WW. Just cool it! Cryoprotectant anti-freeze in immunocytochemistry and in situ hybridization. Peptides 2004;25:425-31.
13. Larochelle R, Magar R. Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in paraffin-embedded tissues: comparison of immunohistochemistry and in situ hybridization. J Virol Methods 1997;63:227-35.
14. Reijnders CM, Bravenboer N, Tromp AM, Blankenstein MA, Lips P. Effect of mechanical loading on insulin-like growth factor-I gene expression in rat tibia. J Endocrinol 2007;192:131-40.
15. Schmidt BF, Chao J, Zhu Z, DeBiasio R, Fisher G. Signal amplification in the detection of single-copy DNA and RNA by enzyme-catalyzed deposition (CARD) of the novel fluorescent reporter substance Cy3.29-tyramide. J Histochem Cytochem 1997;45:365-73.
16. Melton DA, Krieg PA, Rebagliati MR, Maniatis T, Zinn K, Green MR. Efficient in vivo synthesis of biologically active RNA and RNA hybridization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6promoter. Nucleic Acids Res 1984;12:7035-56.
17. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, eds. Molecular Cloning; A laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1994.
18. Baumgart E, Schad A, Volkl A, Fahimi HD. Detection of mRNAs encoding peroxisomal proteins by non-radioactive in situ hybridization with digoxigenin-labelled cRNAs. Histochem Cell Biol 1997;108:371-9.
19. Shibata Y, Fujita S, Takahashi H, Yamaguchi A, Koji T. Assessment of decalcifying protocols for detection of specific RNA by non-radioactive in situ hybridization in calcified tissues. Histochem Cell Biol 2000;113:153-9.
20. Wilkinson DG, Nieto MA. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol 1993;225:361-73.
21. De Block M, Debrouwer D. RNA-RNA in situ hybridization using digoxigenin labeled probes: the use of high-molecular-weight polyvinyl alcohol in the alkaline phosphatase indoxyl-nitroblue tetrazolium reaction. Anal Biochem 1993;215:86-9.
22. Van Noorden CJF, Kooij A, Vogels IMC, Frederiks WM. On the nature of ‘nothing dehydrogenase’ reaction. Histochem J 1985;17:1111-8.
23. Gluhak-Heinrich J, Ye L, Bonewald LF, Feng JQ, MacDougall M, Harris SE, Pavlin D. Mechanical loading stimulates dentin matrix protein 1 (DMP1) expression in osteocytes in vivo. J Bone Miner Res 2003;18:807-17.
24. Shin M, Izumi S, Nakane PK. ŠQuantitative non-radioactive in situ hybridization for measurement of specific mRNA using image analyzerĆ. Nippon Rinsho 50(10):2510-4 1992;50:2510-4.
25. Lawrence JB, Singer RH. Quantitative analysis of in situ hybridization methods for the detection of actin gene expression. Nucleic Acid research 1985;13:1777-99.
26. Schenborn ET, Mierendorf RCJ. A novel transcription property of SP6 and T7 RNA polymerases: dependence on template structure. Nucleic Acids Res 1985;13:6223-36.
27. Panoskaltsis-Mortari A, Buci RP. In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts. Bio Techniques 1995;18:300-7.
28. Schaeren-Wiemers N, Gerfin-Moser A. A single protocol to detect transcripts of various types and expression level in neutral tissue and culture cells: in situ hybridization using digoxigenin labeled cRNA probes. Histochemistry 1993;100:431-40.
29. Singer RH, Lawrence JB, Villnave C. Optimization of in situ hybridization using isotopic and non-isotopic detection methods. Bio Techniques 1986;4:230-50.
30. Pohle T, Shahin M, Gillessen A, Schuppan D, Herbst H, Domschke W. Expression of type I and IV collagen mRNAs in healing gastric ulcers--a comparative analysis using isotopic and non-radioactive in situ hybridization. Histochemistry & Cell Biology 1996;106:413-8.
31. Gandrillon O, Solari F, Legrand C, Jurdic P, Samarut J. A rapid and convenient method to prepare DIG-labelled RNA probes for use in non-radioactive in situ hybridization. Mol Cell Probes 10(1):51-5 1996;10:51-5.