Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Izvorni stručni članak

 
Eloísa Urrechaga. Ocjena HPLC sustava Primus Ultra2 za mjerenje koncentracije HbA2 i probir na β-talasemiju. Biochemia Medica 2008;18(3):351-60.
Hematology Laboratory, Hospital Galdakao-Usansolo, Galdakao, Vizcaya, Španjolska
*Adresa za dopisivanje: eloisa [dot] urrechagaigartua [at] osakidetza [dot] net
 
Sažetak
Uvod: Primus Ultra2 je analizator na kojem se metodom tekućinske kromatografije visoke djelotvornosti (engl. high-performanceliquidchromatography, HPLC) pomoću ionske izmjene obavlja kvantitativna i kvalitativna analiza frakcija hemoglobina: u 4 minute moguće je odrediti točnu koncentraciju HbF, HbA2, HA0 i detektirati druge vrste hemoglobina. Cilj istraživanja je ocjena analitičkog učinka analizatora Primus Ultra2 u rutinskoj procjeni sadržaja HbA2, najvažnijeg testa za identifikaciju nosioca β-talasemije.
Materijali i metode: Provedena su istraživanja nepreciznosti, linearnosti i netočnosti prema CLSI standardima (engl. Clinical Laboratory Standards Institute, CLSI) i smjernicama proizvođača. Pouzdanost mjerenja koncentracije HbA2 u svrhu određivanja β-talasemije ispitana je na 300 uzoraka bolesnika s prethodno postavljenom dijagnozom β-talasemije.
Rezultati: Nepreciznost. Koeficijent varijacije (engl. coefficient of variation, CV) unutar serije kod normalne koncentracije HbA2 (2,2%) iznosio je 1,9%, a kod povišene koncentracije (5,5%) 1,3%. CV iz serije u seriju iznosili su 2,4% (normalna koncentracija) i 1,7% (povišena koncentracija). CV iz dana u dan bili su 3,0% (normalna koncentracija) i 2,7% (povišena koncentracija). Ukupni koeficijenti varijacije bili su 4,4% (normalna koncentracija) i 3,5% (povišena koncentracija). Linearnost. Y = 1,089x + 0,01; R2=0,992 (raspon 2,4–5,0%). Izmjerene su vrijednosti dobro korelirale s očekivanima; prosječno iskorištenje bio je 99%. Netočnost. Kod kontrolnog uzorka normalne koncentracije greška je iznosila 1,6% ± 0,26%, a kod kontrolnog uzorka povišene koncentracije 5,2% ± 0,19%. Referentni raspon bio je 0,9–3,0% (srednja vrijednost 1,9%, ± 2,5 SD). Svi ispitani nosioci β-talasemije imali su povećanu koncentraciju HbA2 u krvi [4,7% (3,3–6,9%)].
Zaključak: Analizator Primus Ultra2 omogućuje brzo i pouzdano razdvajanje različitih frakcija hemoglobina. Mjerenje koncentracije HbA2 točno je i ponovljivo, što je neophodno zbog male razlike između normalnih i patoloških vrijednosti. Postoji jasna razlika u koncentracijama HbA2 između zdravih ispitanika i nosioca β-talasemije. Granična se vrijednost za zdravu populaciju može se postaviti na 3,3% HbA2. Određivanje koncentracije HbA2 na analizatoru Primus Ultra2 je pogodna metoda za brzo probiranje unutar populacije na nosioce β-talasemije.
Ključne riječi: HbA2, probir na β-talasemiju, HPLC
Pristiglo: 11. siječnja 2008.                                                                                       Prihvaćeno: 27. lipnja 2008.
 
 
Uvod
Otkrivanje i određivanje točne koncentracije frakcija hemoglobina klinički je važno u dva slučaja. Jedan je određivanje točne koncentracije HbA1c, glavnog glikiranog oblika HbA, što je korisno u kliničkoj obradi šećerne bolesti. Metode za određivanje HbA1c su imunološke ili kromatografske. Drugi je određivanje točne koncentracije HbA2 i HbF te otkrivanje i određivanje točne koncentracije varijanata hemoglobina, što je glavni postupak u dijagnostici hemoglobinopatija (npr. talasemije ili anemije srpastih stanica).
Beta-talasemija je nasljedni oblik anemije, koja nastaje zbog poremećene sinteze globinskog β-lanca.
Određivanje HbA2 je najvažniji test za prepoznavanje nositelja β-talasemije, budući da je povećanje ove frakcije hemoglobina najvažnija dijagnostička značajka heterozigotne β-talasemije. HbA2 je otkriven prije više od 50 godina, te je drugi hemoglobin po redu otkriven u krvi odraslih osoba (1) koji predstavlja oko 3% ukupnog hemoglobina. Kasnija istraživanja pokazala su da je koncentracija HbA2 povećana kod talasemije (2), te da se HbA2 sastoji od 2 α- i 2 δ-globinska lanaca, što je navelo Ingrama i Strettona da pretpostave kako se koncentracija HbA2 u β-talasemiji povećava zbog smanjene sinteze globinskog β-lanca (3). Takvo povećanje nije specifično, budući da su povišene koncentracije nađene i kod drugih stanja (4-6). No, zajedno s eritrocitnim konstantama, HbA2 ostaje standardni biološki biljeg probira na β-talasemiju u odraslih osoba.
Talasemija je u skupini najčešćih genetskih poremećaja diljem svijeta; 1,7% svjetske populacije su nosioci genetskih promjena povezanih s talasemijom (7). Talasemija je učestala u nekim dijelovima svijeta (mediteranska regija do 8%; zemlje Srednjeg Istoka do 10%; Indija 3–15%; Jugoistočna Azija do 9%), gdje predstavlja veliki javno-zdravstveni problem. No, i u zemljama koje nisu s tog područja, poput zemalja sjeverne Europe i Sjeverne Amerike, bolest se također javlja kao rezultat demografskih promjena uzrokovanih migracijom etničkih manjinskih skupina s visokom učestalošću mutacija povezanih s talasemijom (8). Podaci nedavno provedenog epidemiološkog ispitivanja ukazuju na to da u Europi postoji približno 15.000 osoba s talasemijom major koja se javlja kod transfuzije krvi (9-11).
Prema tome, određivanje koncentracije HbA2 igra ključnu ulogu u programima probira na β-talasemiju, budući da povećanje te frakcije hemoglobina omogućuje prepoznavanje heterozigota. Međutim, mogu se pojaviti neke dijagnostičke poteškoće pri identifikaciji atipičnih nosilaca s neznatno povišenim sadržajem HbA2. Pojava tih graničnih slučajeva nije rijetka zbog velike heterogenosti genotipova β-talasemije ili moguće istodobne prisutnosti drugih stečenih ili genetskih stanja (npr. manjak željeza, δ-talasemija) koja mogu prikriti dijagnozu heterozigotne β-talasemije (12-14). Stoga je, zbog teškog razlikovanja između normalnih i patoloških koncentracija HbA2, za točnu dijagnozu ključna visoka analitička kvaliteta mjerenja koncentracije HbA2, pogotovo pri genetskom savjetovanju kod kojeg se moraju identificirati parovi s povećanim rizikom od nastanka bolesti kod potomstva.
Metode za ispitivanje hemoglobinopatija tradicionalno uključuju alkalnu i kiselu elektroforezu hemoglobina u kombinaciji s određivanjem točne koncentracije HbA2 (elektroforeza ili kromatografija) i HbF (alkalna denaturacija, elektroforeza ili kromatografija). Sve se nabrojene metode izvode ručno i dugotrajne su. Posljednjih desetljeća razvijaju se automatizirane tehnike za određivanje frakcija hemoglobina, koje kliničarima daju zadovoljavajuće rezultate, te poboljšavaju djelotvornost laboratorija i kvalitetu rezultata.
Tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti (HPLC) kationske izmjene potpuno je automatiziran sustav kvalitativne i kvantitativne analize frakcija hemoglobina, pogodan za laboratorije s velikim obujmom posla (16,17). Uzorci se ubrizgavaju u kromatograf opremljen kolonom za izmjenu iona, koja je uravnotežena prema pH i ionskoj snazi. Odvajanje vrsta hemoglobina postiže se upotrebom gradijenta između dviju mobilnih faza koje se razlikuju po koncentraciji soli i pH. Fizičke značajke kao što su promjene na površini te prisutnost hidrofilnih i hidrofobnih skupina određuju stopu migracije svake vrste hemoglobina. U usporedbi sa zahtjevnim konvencionalnim tehnikama, HPLC metode imaju znatne prednosti, kao što su precizno određivanje koncentracije, ušteda vremena i potpuna automatizacija. Danas HPLC tehnike predstavljaju najpouzdanije metode za razdvajanje, identifikaciju i određivanje koncentracije frakcija hemoglobina, ali imaju i potencijalna ograničenja poput lažne interpretacije u prisutnosti patoloških hemoglobina.
 
Materijali i metode
HPLC sustav Primus Ultra2
Analizator Primus Ultra2 (Primus Corporation, Kansas City, Kansas, SAD) rabi načela HPLC ionske izmjene i spektrofotometrijskog otkrivanja. Sustav je načinjen tako da pruži najveću moguću količinu podataka u najkraćem vremenu. Ova metoda kombinira osjetljivost i specifičnost HPLC s automatskim programom za obradu i pruža pomoć u procjeni podataka.
Uzorci se obrađuju u serijama i svaka serija započinje FASC kontrolom kao biljegom retencijskih vremena za poznati hemoglobin koji sadrži: HbF, HbA0, HbC i HbS, kako mu ime FASC govori (slike 1. i 2.). FASC kontrola osigurava optimalan rad sustava. Kao uzorci su prikladne i puna i hemolizirana krv.
 
 
Slika 1. Kromatogram PRIMUS Ultra2, FASC kontrola, metoda brzog probira (Quick Scan assay). Metoda brzog probira: za probiranje uzoraka bolesnika. Vrijeme analize iznosi 4 minute, sustav određuje koncentraciju HbF, HbA2, HbA0 i označuje vrške drugih vrsta hemoglobina; FASC kontrola je biljeg retencijskih vremena za poznate hemoglobine: HbF, HbA0, HbC i HbS.
 
 
 
Slika 2. Kromatogram PRIMUS Ultra2, FASC kontrola, metoda visoke rezolucije (High Resolution assay). Metoda visoke rezolucije: u 10,5 minuta rastavlja druge vrste hemoglobina kao pomoć pri njihovoj identifikaciji.
 
Pet mikrolitara pune krvi automatski se sakuplja, hemolizira i ubrizgava u kolonu kojom protječe mješavina pufera (mobilne faze 1 i 2). Nakon ispiranja s kolone sastavnice uzorka prolaze kroz spektrofotometrijski detektor gdje se na valnoj duljini od 413 ± 2 nm otkrivaju pojedine frakcije.
Postoje dvije metode analize: metoda brzog probira (engl. Quick Scan Method) – za probir uzoraka bolesnika. Vrijeme analize je 4 min, sustav određuje koncentraciju HbF, HbA2, HbA0 i označuje vrijednosti izvan granica normale. Metoda visoke rezolucije (engl. High Resolution Method): u 10,5 minuta rastavlja druge vrste hemoglobina kao pomoć pri identifikaciji. Ovom metodom može se prepoznati i identificirati i do 100 varijanata hemoglobina. Svaka se metoda može rabiti za određivanje točne koncentracije HbA2 i HbF ukoliko se u seriji odrede i kontrolni uzorci.
Istodobno dok se uzorak analizira, na monitoru se prikazuje kromatogram u stvarnom vremenu. Računalo tiska izvještaj s informacijama o uzorku, datumom i vremenom, nakon čega slijedi kromatogram s retencijskim vremenima označenima kod svakog vrška. Na kraju se tiska objedinjen izvještaj za svaki vršak s apsolutnim i relativnim retencijskim vremenom, postotkom površine i komentarima za svaki vršak u kromatogramu.
Cilj ovoga istraživanja bila je ocjena analitičkog rada i kvalitete rezultata dobivenih sustavom Primus Ultra2 za rutinsko određivanje HbA2 i probir na β-talasemiju.
Bolesnici
U istraživanje je bilo uključeno 150 uzoraka krvi naizgled zdravih ispitanika, dobivenih iz Zavoda za transfuziju krvi, kako bi se odredio referentni raspon, prema standardima CLSI. Kompletna krvna slika i parametri metabolizma željeza bili su unutar referentnog raspona. Pouzdanost mjerenja koncentracije HbA2 sustavom Primus Ultra2 za otkrivanje β-talasemije određena je analizom 300 uzastopnih uzoraka odraslih bolesnika s prethodno dijagnosticiranom β-talasemijom (53% muškaraca, 47% žena; raspon dobi 18–95 godina, srednja dob 49 godina). U tablici 1. prikazane su vrijednosti biokemijskih parametara za zdrave ispitanike i ispitanike s talasemijom. Na slici 3. prikazan je kromatogram nosioca β-talasemije.
 
Tablica 1. Hematološki i biokemijski parametri referentne skupine i kod 300 ispitanika s β-talasemijom.
 
 
 
 
Slika 3. Kromatogram PRIMUS Ultra2, nosilac β-talasemije. Kromatogram s istaknutim retencijskom vremenima kod svakog vrška. Nakon kromatograma ispisuje se objedinjen izvještaj za svaki vršak s apsolutnim i relativnim retencijskim vremenom, postotkom površine i komentarima za svaki vršak u kromatogramu.
 
Probir na β-talasemiju obavljen je rutinski u našem laboratoriju mjerenjem eritrocitnih konstanti i koncentracije HbA2. Molekularna karakterizacija mutacija obavljena je tehnikom PCR-ASO (engl. polymerase chain reaction – allele-specific oligonucleotide hybridization, PCR-ASO).
Slijedeći naš protokol, dijagnosticirali smo skupinu nosioca β-talasemije: eritrocitne konstante određene su analizatorom LH750 Beckman-Coulter (Beckman Coulter, Inc., Miami, FL, SAD).
Uzorci s eritrocitozom (RBC > 5,8 x 1012/L) i mikrocitozom (MCV < 70 fL) odabrani su za određivanje koncentracije HbA2 na HPLC analizatoru HA 8160 Menarini (Menarini Diagnostics, Firenca, Italija).
Kod bolesnika s koncentracijom HbA2 višom od referentne vrijednosti (3,5%) postoji klinička sumnja na β-talasemiju te su njihovi uzorci poslani na molekularnu analizu.
DNA je dobivena pročišćavanjem na kolonama pomoću GenerationR Capture Column kita (Gentra Systems, Minneapolis, MN, SAD).
Molekularna analiza otkrivanja prisutnosti najčešće mediteranske točkaste mutacije obavljena je setom testova mDxR BeTha Gene 1 (Bio Rad Laboratories, Hercules, CA, SAD), prema načelu ASO hibridizacije.
U tablici 2. prikazane su ispitane mutacije te rezultate dobiveni za 300 nosioca β-talasemije. Svi su bili heterozigoti.
 
Tablica 2. Distribucija mutacija β-talasemije izraženih kao postotak u ukupnom broju ispitanika (300 nosioca β-talasemije)
 
 
Analitička ocjena
Netočnost
Netočnost se određivala analizom dvaju komercijalnih kontrolnih uzoraka po seriji u više od 20 dana. Izračunate su srednja vrijednost, standardna devijacija te koeficijent varijacije.
Nepreciznost u seriji
Dva su uzorka (jedan zdravog ispitanika, drugi nosioca β-talasemije) analizirana 10 puta unutar iste serije te su izračunate srednje vrijednosti, SD i CV.
Nepreciznost iz dana u dan
Dva su uzorka testirana 3 puta 7 dana za redom, te su izračunate srednja vrijednost, SD i CV dnevnih srednjih vrijednosti za tih 7 dana.
Ispitivanje iskorištenja
Ispitivanje iskorištenja miješanjem uzoraka načinjeno je kako bi se ocijenila sposobnost otkrivanja povećane koncentracije HbA2 analizatora Primus Ultra2. Normalna krv (2,4% HbA2) i uzorak krvi nosioca β-talasemije (5,0% HbA2) pomiješani su u omjerima 9:1, 8:2…1:9 te je analizirano jedanaest uzoraka. Za usporedbu očekivanih i izmjerenih vrijednosti napravljen je linearni regresijski test (statistički program Method Validator 1.15, P. Marquis, Metz, Francuska).
 
Rezultati
Referentni raspon
Srednja vrijednost koncentracije HbA2 u krvi bila je 1,9%, a referentni interval 0,9–3,0% (srednja vrijednost ± 2,5 SD). Svi ispitani nosioci β-talasemije imali su povišenu koncentraciju HbA2 u krvi, uz raspon vrijednosti od 3,3% do 6,9% i srednju vrijednost 4,7%.
Netočnost
Netočnost je određena analizom dvaju komercijalnih kontrolnih uzoraka po seriji u vremenu od preko 20 dana. Izračunate su srednja vrijednost i SD dobivenih rezultata, koje su iznosile 1,6% ± 0,26% za kontrolni uzorak normalne koncentracije i 5,2% ± 0,19% za kontrolni uzorak povišene koncentracije.
Nepreciznost
Nepreciznost je ispitana obradom uzoraka s normalnim i visokim koncentracijama HbA2. Preciznost unutar serije: dva uzorka (jedan zdravog ispitanika, drugi nosioca β-talasemije) analizirani su 10 puta unutar iste serije te su se izračunate srednje vrijednosti, SD i CV. Preciznost iz dana u dan: dva uzorka (jedan zdravog ispitanika, drugi nosioca β-talasemije) testirani su više od 7 dana za redom, 3 puta svakog dana. Uzorci su pohranjeni na 4 °C. Za svaki je dan izračunata srednja vrijednost i CV dnevne srednje vrijednosti. CV unutar serije bio je 1,9% kod normalne koncentracije HbA2 (2,2%) i 3,3% kod povišene koncentracije HbA2 (5,5%). CV iz serije u seriju bio je nešto viši i iznosio je 2,4% (normalna koncentracija) i 1,7% (povišena koncentracija). CV iz dana u dan bio je 3,0% (normalna koncentracija) i 2,7% (povišena koncentracija).
Ukupni koeficijent korelacije bio je 4,4% (normalna koncentracija) i 3,5% (povišena koncentracija).
Ispitivanje iskorištenja
Ispitivanje iskorištenja miješanjem uzoraka napravljeno je kako bi se ocijenila sposobnost otkrivanja povećanih koncentracija analita HbA2 za analizator Primus Ultra2. Normalna krv (2,4% HbA2) i uzorak nosioca β-talasemije (5,0% HbA2) pomiješani su u omjerima 9:1, 8:2…1:9 i jedanaest je uzoraka analizirano.
Za usporedbu teoretski očekivanih i izmjerenih vrijednosti napravljen je linearni regresijski test (statistički program Method Validator 1.15, P. Marquis, Metz, Francuska). Najbolji pravac i pravac linearne regresije dobiven za iskorištenje bio je: y=1,089x+0,01, R2 = 0,992.
Izmjerene vrijednosti bile su u dobroj korelaciji s očekivanima i prosječan omjer iskorištenja bio je 99% (tablica 3.).
 
Tablica 3. Rezultati istraživanja iskorištenja
 
 
Rasprava
Iako je talasemija globalno najzastupljenija na Mediteranu i zemljama Dalekog Istoka, zbog populacijskih migracija doslovce ne postoji zemlja na svijetu u kojoj barem mali postotak stanovnika ne boluje od talasemije. Kao i za sve kronične bolesti tako je i u slučaju talasemije važna cjelovita obrada bolesti: odgovarajući probir, otkrivanje bolesnika i savjetovanje parova s povećanim rizikom bitni su postupci za smanjenje pobola i smrtnosti bolesnika (18).
β-talasemija se sa sigurnošću može dijagnosticirati u slučaju povišene koncentracije HbA2, broja eritrocita većeg od 5 x 1012/L, mikrocitoze i normalne koncentracije feritina u serumu. Iako se dobivene vrijednosti koncentracije HbA2 trebaju interpretirati zajedno s ostalim parametrima, npr. koncentracijom željeza, eritrocitnim konstantama ili obiteljskom anamnezom, zbog kliničke važnosti određivanja HbA2 u probiru na β-talasemiju i ozbiljnih posljedica uslijed netočne dijagnoze, dobiveni rezultati moraju biti visoke kvalitete. Imajući to na umu treba napomenuti kako još ne postoje konačno definirani analitički ciljevi mjerenja koncentracije HbA2. Ipak, dobro je da se rabe sastavnice biološke varijacije kako bi se utvrdile specifikacije analitičke kvalitete za preciznost, sustavnu i ukupnu pogrešku kliničko-laboratorijskih postupaka. Intra- i inter-individualne sastavnice varijacije izražene kao koeficijenti varijacije (CVw, intra-individualne i CVg, inter-individualne) rabe se za izračunavanje ukupne pogreške (engl. total error, TE) prema formuli:
 
 
gdje je cilj preciznosti postavljen na osnovi intra-individualne varijabilnosti CVa < 0,5 CVw (19). Pretpostavljajući da intra-individualna varijabilnost koncentracije HbA2 može biti slična koncentraciji HbA0 (CVI između 2,8% i 3,4%) (20), analitički cilj za preciznost može se utvrditi između 1,4% i 1,7%. Zbog te inter-individualne varijabilnosti znanstvena literatura još ne nudi opširnije podatke. Gruba procjena može se ekstrapolirati iz referentnog raspona gdje se izračuna prosječna koncentracija HbA2 u zdravih odraslih osoba i time se dobiva ukupna dozvoljena pogreška od 7,8% (21).
Važno je naglasiti da referentni raspon dobiven u ovoj ocjeni (srednja vrijednost 1,9%, raspon ± 2,5 SD 0,9–3,0%), slično rasponu što ga navodi proizvođač (srednja vrijednost 1,9%, raspon ± 2,5 SD 0,7–3,1%), ima niže vrijednosti nego što se mogu dobiti na drugim HPLC sustavima (srednja vrijednost 2,5%, raspon ± 2,5 SD 2,5–3,5%) (22). Ove bi se vrijednosti mogle objasniti niskom procjenom sustava integriranja površine vršaka. Ukupna dozvoljena pogreška ekstrapolirana iz referentnog raspona 0,9–3,0%, CVg 15,2%, iznosi 6,5%. Ukupni koeficijenti varijacije dobiveni ispitivanjem preciznosti niži su od ove granice. U pogledu ponovljivosti testa HbA2, analizator Tosoh G7 je postigao dobru preciznost unutar serije, malo više od željenog cilja testa i nešto višu preciznost između serija.
Sustav Primus Ultra2 pruža brzo i pouzdano razdvajanje i određivanje relativnog postotka različitih tipova hemoglobina, osobito HbA2. Dobiveni su rezultati točni i ponovljivi. Omogućeno je dobro razlikovanje zdravih osoba i nosioca β-talasemije. Granična se vrijednost može postaviti na 3,3%, s time da se svi bolesnici s vrijednostima višim od 3,3% identificiraju kao nosioci β-talasemije.
Lakoća rada i potreba ograničenog tehničkog znanja čine ovaj analizator pogodnim za laboratorije s velikim obujmom posla, poboljšavajući njihovu djelotvornost i smanjujući troškove probira na talasemiju i hemoglobinopatije. Naše istraživanje je pokazalo kako je ova metoda primjerena za brz probir populacije na nositelje β-talasemije i pouzdana za određivanje točne koncentracije HbA2 u krvi. Stoga se smatra prikladnom za rutinsku kliničko-laboratorijsku upotrebu, no, kao što je to slučaj sa svim laboratorijskim testovima prvoga stupnja za karakterizaciju varijanata hemoglobina, ovaj HPLC sustav ima potencijalno ograničenje lažne interpretacije vršaka u prisutnosti patoloških hemoglobina. U tim se slučajevima preporučaju laboratorijski testovi drugoga stupnja, npr. molekularna analiza ili obiteljska ispitivanja za konačnu identifikaciju varijante hemoglobina.
 
Literatura
1.    Kunkel HG, Wallenius G. New hemoglobin in normal adult blood. Science 1955;122:288.
2.    Kunkel HG, Ceppellini R, Muller-Eberhard U, Wolf J. Observations on the minor basic hemoglobin component in the blood of normal individuals and patients with thalassaemia. J Clin Invest 1957;36:1615-25.
3.    Ingram VM, Stretton AOW. Human hemoglobin A2: chemistry, genetics and evolution. Nature 1961;190:1079-84.
4.    Gasperini D, Cao A, Paderi L, Barella S, Paglietti E, Perseu L, et al. Normal individuals with high HbA2 levels. Br J Haematol 1993;84:166-86.
5.    Steinberg MH, Adams III JG. Hemoglobin A2: origin, evolution and aftermath. Blood 1991;78:2165-77.
6.    Howard J, Henthorn JS, Murphy S, Davies SC. Implication of increased hemoglobin A2 values in HIV positive women in the antenatal clinic. J Clin Pathol 2005;58:556-8.
7.    Rund D, Rachmilewitz E. β thalassemia. N Engl J Med 2005;353: 1135-46.
8.    Weatherall DJ, Clegg JB. Inherited hemoglobin disorders: an increasing global health problem. Bull World Health Organ 2001;79:704-12.
9.    Galanello R, Eleftheriou A, Traeger-Synodinos J, Old J, Petrou M, Angastiniotis M. Prevention of thalassemias and other hemoglobin disorders. Nicosia: Thalassemia International Federation, 2003.
10. Angastiniotis M, Modell B. Global epidemiology of hemoglobin disorders. Ann N Y Acad Sci 1998;850:251-69.
11. Modell B, Darlison M, Birgens H, Cario H, Faustino P, Giordano PC, et al. Epidemiology of hemoglobin disorders in Europe: an overview. Scand J Clin Lab Invest 2007;67:39-69.
12. Giambona A, Lo Gioco P, Marino M, Abate I, Di Marzo R, Renda M, et al. The great heterogeneity of thalassemia molecular defects in Sicily. Hum Genet 1995;9:526-30.
13. Galanello R, Barella S, Ideo A, Gasperini D, Rosatelli C, Paderi L, et al. Genotype of subjects with borderline hemoglobin A2 levels: implication for β thalassemia carrier screening. Am J Hematol 1994;46:79-81.
14. Skarmoutsou C, Papassotiriou I, Traeger-Synodinos J, Stamou H, Ladis V, Metaxotou-Mavrommati A, et al. Erythroid bone marrow activity and red cell hemoglobinization in iron sufficient β-thalassemia heterozygotes as reflected by soluble transferrin receptor and reticulocyte hemoglobin in content. Correlation with genotypes and HbA2 levels. Haematologica 2003;88:631-6.
15. Fairbanks VF, Klee GG. Biochemical aspects of haematology. In: Burtis CA, Ashwood ER, editors. Tietz textbook of clinical chemistry. Philadelphia: Saunders, 1994: pp. 1974-2072.
16. Galanello R, Barella S, Gasperini D, Perseu L, Paglietti E, Sollaino C, et al. Evaluation of an automatic analyser for thalassemia and hemoglobin variants screening. J Autom Chem 1995;17:73-6.
17. Lafferty JD, McFarlane AG, Chui DH. Evaluation of a dual HbA2/A1C quantitation kit on the BioRad Variant II automated analyser. Arch Pathol Lab Med 2002;126:1494-500.
18. Giordano PC, Bouva MJ, Harteveld CL. A confidential inquiry estimating the number of patients affected with sickle cell disease and thalassemia major confirms the need for a prevention strategy in the Netherlands. Hemoglobin 2004;28:287-96.
19. Ricos C, Baadenhuijsen H, Libeer JC, Petersen PH, Stockl D, Thienpont L, Fraser CC. External quality assessment: currently used criteria for evaluating performance in European countries and criteria for future harmonization. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1996;34:159-65.
20. Mosca A, Paleari R, Scime-Degani V, Leone L, Leone D, Ivaldi G. Inter-method differences and commutability of control material for HbA2 measurement. Clin Chem Lab Med 2000;38:997-1002.
21. Paleari R, Cannata M, Leto F, Maggio A, Demartis FR, Desogus MF, et al. Analytical evaluation of Tosoh HLC-723 G7 automated HPLC analyzer for hemoglobin A2 and F determination. Clin Biochem 2005;38:159-65.
22. Tietz NW. Clinical guide to laboratory tests. 3rd ed. Philadelphia: WB Saunders Company; 1995: p. 316.