Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Izvorni znanstveni članak:

Hadi Parsian1, Mohammad Nouri1*, Mohammad Hossein Somi2, Ali Rahimipour1, Durdi Qujeq3,
Mehrdad Kashi Fard4, Karim Agcheli5 and Golnar Majidi2.
Odnos između koncentracije hijaluronske kiseline u serumu i stadija jetrene fibroze kod bolesnika s kroničnim hepatitisom. Biochemia Medica 2009;19(2):154-65.
 
1Odjel za biokemiju, Sveučilište medicinskih znanosti u Tabrizu, Tabriz, Iran
2Centar za istraživanje gastrointestinalnih bolesti i bolesti jetre, Sveučilište medicinskih znanosti u Tabrizu, Tabriz, Iran
3Odjel za biokemiju i biofiziku, Sveučilište medicinskih znanosti u Babolu, Babol, Iran
4Bolnica Yahya Nezhad, Sveučilište medicinskih znanosti u Babolu, Babol, Iran
5Centar za gastroenterološka istraživanja, Sveučilište medicinskih znanosti u Golestanu, Gorgan, Iran
Corresponding author*: nourimd2 [at] yahoo [dot] com
 
Sažetak
 
Uvod: Biopsija jetre je zlatni standard u procjeni stadija bolesti jetre, no podložna je brojnim komplikacijama. Predlažu se neke neinvazvne metode kao zamjenski biljezi umjesto biopsije jetre. Prikazano je da koncentracije hijaluronske kiseline (engl. hyaluronic acid, HA) rastu sa stadijem težine fibroze jetre. Cilj ovoga istraživanja bio je utvrditi razliku u koncentraciji HA između bolesnika s fibrozom jetre i zdravih ispitanika koji nemaju znakove jetrene bolesti, kao i optimalnu graničnu vrijednost za razlikovanje tih dviju skupina ispitanika u populaciji Irana.
Materijali i metode: Serumska koncentracija HA kod bolesnika s kroničnim hepatitisom (N = 62) i kontrolnih ispitanika (N = 20) uspoređena je metodom ELISA, a stadij fibroze određen je prema modificiranom Knodellovu indeksu.
Rezultati: Srednja vrijednost koncentracije HA u serumu bolesnika (113,4 ± 59,2 ng/mL) bila je viša od one kod kontrolne skupine (46,0 ± 10,5 ng/mL; P < 0,001). Bolesnici s višim stupnjem i stadijem nekrotičnih oštećenja jetre imali su više koncentracije HA u serumu. Razlike između različitih stadija jetrene fibroze i koncentracije HA u serumu bile su statistički značajne kod svih stadija fibroze u usporedbi s kontrolnom skupinom (P < 0,05). Granična vrijednost koncentracije HA u serumu (59,5 ng/mL) pokazala je dobru osjetljivost (80,3%) i specifičnost (85%).
Zaključak: Postoji jaka korelacija između koncentracije HA u serumu i stupnja nekrotičnih oštećenja jetre. Naši rezultati ukazuju na to da je povećanje koncentracija HA u serumu iznad prediktivne vrijednosti povezano s jetrenom fibrozom te se može rabiti kao neinvazivni indeks razlikovanja između bolesnika s jetrenom fibrozom i zdravih ispitanika.
Ključne riječi: kronični hepatitis; stupanj upale jetre; stupanj jetrene fibroze; hijaluronska kiselina
 
Pristiglo: 26. studenog 2008.
Prihvaćeno: 3. travnja 2009.
 
Uvod
 
Jetrena fibroza obilježena je pojačanim odlaganjem izvanstaničnog matriksa (engl. extracellular matrix, ECM) uključujući molekularnu i histološku preraspodjelu raznih vrsta kolagena, glikoproteina i proteoglikana/glikozaminoglikana (1,2). Odlaganje ECM u Disseovu prostoru jetre (perisinusoidna fibroza), stvaranje (nepotpunih) subendotelnih bazalnih membrana i onemogućavanje funkcioniranja hepatocita iz okolnog matriksa ne nanose štetu samo protoku krvi kroz organ, nego i biosintetičkoj funkciji hepatocita i sposobnosti uklanjanja tih i ostalih stanica. Stoga je postavljanje dijagnoze, praćenje kliničke slike i terapije fibrogeneze klinički vrlo važno (3).
Značajna sastavnica u kliničkoj obradi jetrene fibroze je klinička procjena težine bolesti. Histologija jetre često se smatra zlatnim standardom za određivanje težine upale i jetrene fibroze. Međutim, biopsija jetre je invazivan postupak koji može izazvati neželjene pojave kao što su bol u 20% do 30% slučajeva, veće komplikacije u 0,5% slučajeva, pa čak i smrt. Zbog komplikacija izazvanih postupkom i činjenice da bolesnici rijetko prihvaćaju biopsiju, troškovi takvih postupaka su visoki (4). Stoga se zamjenski biljezi jetrene fibroze mogu smatrati primjerenima za smanjenje broja postupaka biopsije jetre kod bolesnika s hepatitisom.
Među brojnim serumskim biljezima jetrene fibroze, hijaluronska kiselina (engl. hyaluronic acid, HA) je pokazatelj ciroze jetre i značajno doprinosi neželjenom ishodu kroničnih jetrenih bolesti. HA je nerazgranati anionski polisaharid velike molekularne težine i vrlo važna sastavnica izvanstaničnih matriksa (5). U jetri HA uglavnom sintetiziraju jetrene zvjezdaste stanice, a razgrađuju ju sinusoidne endotelne stanice. Koncentracija HA u serumu izravno raste s napredovanjem kronične jetrene bolesti. Iako je HA uzajamno povezana s fibrozom, nije izravno povezana s upalom i nekrozom (6-8). Kod bolesnika s kroničnim virusom hepatitisa C (engl. chronic hepatitis C virus, HCV) koncentracije HA rastu s višim stadijem fibroze jetre. Štoviše, kod bolesnika oboljelih od ciroze, koncentracija HA je u uzajamnoj vezi s kliničkom težinom bolesti (9,10).
Postoji nekoliko objavljenih istraživanja (11,12) provedenih na populaciji Irana o odnosu između serumske koncentracije HA i stadija jetrene fibroze ili stupnja upale kod bolesnika s kroničnim hepatitisom. Ta su istraživanja provedena na bolesnicima s kroničnim hepatitisom B, a značenje takvih biljega kod bolesnika s kroničnim hepatitisom C i autoimunim hepatitisom (engl. autoimmune hepatitis, AIH), naročito u području sjevernog Irana, još je uvijek nejasan. U njima se jetrena fibroza procjenjivala Ishakovom ljestvicom (13) u biopsiji jetre pa nema podataka o odnosu između serumske koncentracije HA i nekrotičnih oštećenja jetre prema Knodellovu indeksu (14). Stoga je naš cilj bio utvrditi razlike u koncentracijama HA između bolesnika s jetrenom fibrozom (bolesnici s kroničnim hepatitisom B, C i AIH) i zdravih ispitanika koji nemaju znakova jetrene bolesti, te naći optimalnu graničnu vrijednost za razlikovanje između dviju skupina ispitanika iz sjevernog Irana. Kao dodatak ovom istraživanju u promatranje je uključena histološka procjena rezultata biopsije jetre prema modificiranom Knodellovu indeksu.
 
Materijali i metode
Ispitanici
U ovom retrospektivnom istraživanju parova sudjelovala su je 62 bolesnika (35 muškaraca i 27 žena; medijan dobi (raspon): 35 (15-65) godina), među kojima je 35 bolesnika imalo hepatitis B, 14 hepatitis C i 13 je imao AIH. Ispitanici su odabirani u razdoblju od svibnja 2007. do srpnja 2008. iz niza bolesnika upućenih u Centar za gastroenterološka istraživanja u Tabrizu i na Sveučilište medicinskih znanosti u Gorganu (Gonbadu). Bolesnici su uključeni u istraživanje ako su bili pozitivni na HBs-Ag ili na antitijela virusa hepatitisa C (HCV) te im je aktivnost trajno povišenih serumskih aminotransferaza bila 1,5 puta viša od gornje granice referentnog raspona barem zadnjih 6 mjeseci. Bolesnicima s AIH dijagnoza je postavljena prema protokolu Međunarodne skupine za autoimuni hepatitis (engl. International Autoimmune Hepatitis Group Report) (15). Za određivanje indeksa jetrene fibroze, svim je bolesnicima napravljena biopsija jetre kao dio standardnog dijagnostičkog postupka te su raspoređeni u podskupine prema rezultatima indeksa histološke aktivnosti (engl. histological activity index, HAI).
Bolesnici s poviješću gastrointestinalnog krvarenja i nekih kroničnih jetrenih bolesti (Wilsonova bolest, hemokromatoza, nedostatak alfa1-antitripsina, karcinom jetre), aktivnom intravenskom zlouporabom droge i transplatiranom jetrom bili su izuzeti iz istraživanja.
Kontrolni serumi za određivanje koncentracije HA dobiveni su od 20 zdravih dobrovoljnih davatelja koji su upućeni na Sveučilište medicinskih znanosti u Tabrizu (10 žena i 10 muškaraca; medijan dobi (raspon): 41 (20-69) godina). Budući da je kod zdravih ispitanika aktivnost serumske aminotransferaze i alkalne fosfataze (ALP) bila u granicama normale, oni nisu trebali proći biopsiju jetre. Prema podacima iz upitnika, ispitanici nisu imali povijest gastrointestinalnog krvarenja niti neke od kroničnih jetrenih bolesti, nisu nikada pušili niti uzimali alkohol, u obitelji nisu imali slučajeve hepatitisa niti jetrenih bolesti, nisu aktivno intravenski uzimali drogu niti im je transplatirana jetra. Osobe koje su pušile (> 1 cigareta/dan) i pile alkohol (> 5 g/dan) razvrstane su kao pušači i osobe koje uživaju alkohol.
Svi bolesnici su pismeno dali svoj obaviješteni pristanak da se njihovi podaci rabe u znanstvene svrhe. Istraživanje je odobrio Etički odbor Medicinskog sveučilišta u Tabrizu.
Metode
Uzorci krvi (5 mL) sakupljani su ujutro natašte. Serum je odvojen (na 2500 x g 5 minuta) u roku od jednog sata od uzimanja krvi. Na alikvotima svakog seruma napravljene su standardne pretrage funkcije jetre uključujući određivanje aktivnosti aspartat-aminotransferaze (AST), alanin-aminotransferaze (ALT), alkalne fosfataze (ALP) i serološka dijagnostika hepatitisa komercijalno dostupnim testovima. Ukratko, aktivnosti AST i ALT izmjerene su kako su opisali Reitman i Frankel kolorimetrijskim testom (Ziestchem kit, Tehran, Iran) s 2,4 DNPH (2,4 dinitrofenilhidrazon), a aktivnost ALP testirana je pomoću PNPP (engl.para-nitrophenylphosphate) kao supstratom (Ziestchem kit, Tehran, Iran) na spektrofotometru Apel (PD303S, Japan).
Serološki biljezi hepatitisa analizirani su na čitaču ELISA mikrotitarskih pločica (Norahan Fajr, Iran) i priborom opisanim u nastavku. Analizirani su slijedeći serumski biljezi za AIH: antinuklearna antitijela (ANA; Biazyme ELISA kit, Birmingham, UK) i anti-LKM-1 (antitijela na mikrosome jetre i bubrega) (engl. type 1 liver and kidney microsomes, LKM-1, Euroimmun ELISA kit, Njemačka), serološki biljezi hepatitisa B bili su: hepatitis B površinski antigen (engl. hepatitis B surface antigen, HBsAg; Diakey, Shinjin Medics Inc. ELISA kit, Koreja), antitijelo na HBsAg (engl.hepatitis B surface antibody, HBsAb; Diakey, Shinjin Medics Inc. ELISA kit, Koreja) i antitijelo na HBc (engl.hepatitis B core antibody, HBcAb; Dia-Pro ELISA kit, Italija). Serološki biljeg hepatitisa C bilo je antitijelo na hepatitis C virus (HCV) (engl. HCV antibody, HCVAb; Diakey, Shinjin Medics Inc. ELISA kit, Koreja). Za otkrivanje HCV u serumu rabio se reagens za lančanu reakciju polimeraze (engl. polymerase chain reaction, PCR) za određivanje HCV (PCR kit za određivanje HCV) koja se temelji na umnažanju specifične cDNA (engl. complemetary DNA) reverznom transkriptazom od 5’ kraja HCV genoma. Izolacija RNA napravljena je priborom Accuprep viral RNA extraction kit (Bioneer Corporation, Koreja) prema uputama proizvođača. Za PCR umnažanje korišten je komercijalni kit (PCR kit, Roche Diagnostics, Mannheim, Njemačka) na uređaju Eppendorf Thermocycler (Mastercycler Personal) prema uputama proizvođača. Rabljene su dvije početnice (Sinagene, Tehran, Iran) sa sekvencama kako slijedi: za prvu početnicu: 5’-GCA GAA AGC GTC TAG CCA TGG CGT-3’ i za drugu početnicu: 5’-CTC GCA AGC ACC CTA TCA GGC AGT-3’.
Ostatak uzoraka krvi pohranjen je na -20 °C. Isti postupak proveden je s uzorcima kontrolnih ispitanika.
Koncentracija HA u serumu odredila se na čitaču ELISA mikrotitarskih pločica (Immunoscan, Lab System, Švicarska) i priborom HA-ELISA Kit (HA-test, broj: K-1200, Echelon Bioscience Inc., SAD). Metoda HA-ELISA je kompetitivna ELISA metoda u kojoj je kolorimetrijski signal bio obrnuto proporcionalan koncentraciji HA u uzorku. Koncentracija HA u uzorcima određena je iz kalibracijske krivulje sa slijepom probom (0 ng HA/mL) i kalibratorima HA različitih koncentracija (50, 100, 200, 400, 800 i 1600 ng HA/mL). Koncentracija HA u serumu određena je u jednoj analitičkoj seriji unutar jednog radnog dana. Varijabilnost unutar serije izražena kao koeficijent varijacije (CV) za tu metodu prema navodu proizvođača iznosi 5%.
Histološka procjena oštećenja jetre
Kod 62 bolesnika napravljena je perkutana biopsija jetre (biopsijskom iglom Tru-Cut broj 16, uz kontrolu ultrazvukom tipa B) kako bi se procijenila prisutnost i težina jetrene bolesti. Uzorci biopsije jetre bili su fiksirani 12 sati u 10%-tnoj otopini formalina i stavljeni u parafin. Presjeci tkiva obojani su hematoksilin-eozinom, Massonovom trikromnom bojom i retikulinskom bojom za histološki pregled i za određivanje stupnja oštećenja jetre.
U uzorcima dobivenim biopsijom jetre određen je stupanj težine bolesti i stadij proširenosti prema modificiranom Knodellovu indeksu koji označava stupanj upale (14). Bodovna ljestvica od 0-18 temeljena je na zbroju bodova svih četiriju indeksa:
1) periportalni ili periseptalni interface hepatitis (piecemal nekroze, bodovi 0-4);
2) konfluirajuća nekroza (bodovi, 0-6);
3) žarišna (mjestimična) litična nekroza, apoptoza, žarišna upala (bodovi 0-4);
4) portalna upala (bodovi 0-4).
Stadij fibroze određen je temeljem slijedećih uputa:
stadij 0 – nema fibroze;
stadij 1 – fibrozno širenje nekih portalnih područja s kraćim fibroznim septumima ili bez njih;
stadij 2 – fibrozno širenje većine portalnih područja s kraćim fibroznim septumima ili bez njih;
stadij 3 – fibrozno širenje većine portalnih područja s mjestimičnim portalno-portalnim (P-P) premoštenjima;
stadij 4 – fibrozno širenje portalnih područja s izrazitim premoštenjima Športalno-portalnim (P-P) kao i portalno-centralnim (P-C) Ć;
stadij 5 – izrazito premoštavanje (P-P i/ili P-C) s mjestimičnim kvržicama (nepotpuna ciroza);
stadij 6 – vjerojatna ili potvrđena ciroza (15).
Statistička analiza
Statistička analiza napravljena je statističkim programskim paketom SPSS 12.0 (SPSS for Windows 12.0, SPSS, Chicago, IL, SAD). Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD ili medijan i raspon, a vrijednost P < 0,05 se smatrala statistički značanjom. Razlike u koncentraciji HA u serumu bolesnika s različitim tipovima kroničnog hepatitisa i kontrolnih ispitanika analizirani su analizom varijance ANOVA. Za višestruke usporedbe rabili smo post hoc test najmanje značajne razlike (engl. least square differences, LSD) kako bismo usporedili koncentracije HA kod različitih stadija fibroze s vrijednostima kontrolne skupine. Korelacija između koncentracija HA u serumu, stadija jetrene fibroze i stupnja upale izražena je Spearmanovim koeficijentom korelacije (rS).
Kako bi se procijenila dijagnostička točnost koncentracije HA za razlikovanje bolesnika s jetrenom fibrozom i zdravih ispitanika, načinjena je ROC analiza (engl. receiver operating characteristic) te za usporedbu izračunata površina ispod krivulje (engl. area under the curve, AUC) (16). Vrijednost AUC od 1 je značajka idealnog testa, dok vrijednost 0,5 ukazuje na test bez dijagnostičke vrijednosti (17,18).
 
Rezultati
 
Značajke bolesnika i kontrolnih ispitanika uključenih u ovo istraživanje prikazane su u tablici 1., gdje se vidi da je kod bolesnika koncentracija HA u serumu bila viša nego u skupini kontrolnih ispitanika (P < 0,001). 56,4% bolesnika imalo je kronični hepatitis B, 22,6% kronični hepatitis C i 20,9% AIH. Histološkim pregledom jetre za bodovanje fibroze otkriveno je da 35% bolesnika ima teži stadij fibroze (stadij ≥3).
 
Tablica 1. Značajke bolesnika i kontrolne skupine
 
 
Koncentracija HA u serumu kod bolesnika s HBV, HCV i AIH prikazana je u tablici 2. Ovi rezultati pokazuju statistički značajno povišene koncentracije HA u serumu bolesnika u usporedbi s kontrolnom skupinom (P < 0,001). Usporedba serumske koncentracije HA analizom varijance ANOVA i post hoc LSD testom pokazala je da nema statistički značajnih razlika među podskupinama s različitim tipovima hepatitisa (HBV u usporedbi s HCV: P = 0,400; HBV u usporedbi s AIH: P = 0,599; HCV u usporedbi s AIH: P = 0,803).
 
Tablica 2. Usporedba koncentracije HA kod bolesnika s različitim tipovima hepatitisa sa kontrolnom skupinom.
 
 
Tablica 3. prikazuje koncentracije HA u serumu kod različitih stadija jetrene fibroze. Razlike u koncentraciji HA u serumu dobivene ANOVA post hoc LSD testom kod bolesnika u usporedbi s kontrolnom skupinom bile su statistički značajne (P < 0,001) kod gotovo svih stadija jetrene fibroze, osim stadija 0 jetrene fibroze gdje se serumska koncentracija HA nije statistički značajno razlikovala (P = 0,439) od one u kontrolnoj skupini. Istodobno provedene višestruke usporedbe koncentracija HA u serumu kod svih 6 stadija jetrene fibroze pokazale su statistički značajne razlike serumske koncentracije HA za sve stadije jetrene fibroze na razini značajnosti < 0,001, uz tri iznimke: usporedba stadija 0 sa stadijem 1 (P = 0,003), stadija 1 sa stadijem 2 (P = 0,006) i stadija 2 sa stadijem 3 (P = 0,040). Samo je jedan bolesnik imao stadij 6 jetrene fibroze, stoga njegove rezultate nismo statistički uspoređivali sa skupinom zdravih ispitanika. Bolesnici s višim stadijem jetrene fibroze imali su više koncentracije HA u serumu. Ova je korelacija bila linearna i vrlo snažna (rS = 0,850; P < 0,001) (Slika 1.).
Korelaciju koncentracije HA u serumu sa stupnjem upale (rS= 0,685; P < 0,001) prikazana je na slici 2. Bolesnici s višim stupnjem upale imaju višu koncentraciju HA u serumu.
 
Tablica 3. Usporedbe koncentracije HA u serumu kod bolesnika u šest stadija fibroze jetre s kontrolnom grupom
 
 
 
Slika 1. Korelacija između koncentracija HA u serumu i stadija fibroze prema rezultatima biopsije jetre. Korelacije između tih parametara izračunate su Spearmenovim koeficijentom korelacije (rS = 0,850, P < 0,001).
 
 
Slika 2. Korelacija između srednje vrijednosti koncentracija HA u serumu i stupnja upale prema rezultatima biopsije jetre (rS = 0,685, P < 0,001)
 
Rezultati ROC analize (granična vrijednost, osjetljivost i specifičnost) prikazani su u tablici 4. Granična vrijednost je odabrana prema najvećoj vrijednosti osjetljivosti i specifičnosti.
 
Tablica 4. ROC analiza koncentracije HA u serumu za razlikovanje bolesnika s fibrozom jetre i kontrolnih ispitanika
 
 
 
Rasprava
 
Postoji nekoliko istraživanja (11,12) provedenih na populaciji Irana o povezanosti serumske koncentracije HA i nekrotičnih oštećenja jetre kod bolesnika s kroničnim hepatitisom, a niti jedno od njih nije provedeno na populaciji sjevernog Irana. Stoga je ovo istraživanje provedeno u dvije sjeverne pokrajine Irana (Istočni Azerbejdžan i Golestan) kako bi se naglasila povezanost koncentracije HA u serumu i nekrotičnih oštećenja jetre, te istražilo može li se na temelju koncentracije HA u serumu razlikovati između fibroze jetre bolesnika s kroničnim hepatitisom i zdravih osoba.
Koncentracija HA u serumu bila je značajno viša kod bolesnika nego kod zdravih ispitanika (P < 0,001). Naši se podaci slažu s radovima drugih autora koji također izvještavaju o povišenoj koncentraciji HA u serumu kod kronične bolesti jetre, poglavito kod bolesnika s cirozom (19-22). U ranijim istraživanjima provedenim na populaciji Irana u bolesnika s kroničnim hepatitisom B (11,12) izmjerena je viša koncentracija HA u serumu nego kod zdravih ispitanika, no čini se da se koncentracija HA u serumu iz našeg istraživanja razlikuje od one iz ranijih istraživanja. Bolesnici pušači i oni koji su uzimali alkohol imali su više koncentracije HA u serumu, što je ukazivalo na mogućnost da pušenje i unos alkohola mogu promijeniti jetreni metabolizam HA (22).
Koncentracije HA u serumu bile su povišene u skupini bolesnika s HBV, HCV i AIH u odnosu na kontrolnu skupinu. McHutchinson i sur. izvijestili su da je koncentracija HA u serumu kod bolesnika s HCV viša nego kod kontrolnih ispitanika te da su najviše vrijednosti koncentracije izmjerene kod bolesnika s cirozom (23).
Pronašli smo statistički značajnu razliku u koncentraciji HA u svim stadijima jetrene fibroze u odnosu na kontrolnu skupinu, osim u bolesnika sa stadijem 0 (bez fibroze; P = 0,439). Usporedba koncentracija HA u serumu kod raznih stadija fibroze jetre otkrila je da su razlike između svih stadija statistički značajne (P < 0,05) i da bolesnici s višim stadijem jetrene fibroze imaju višu koncentraciju HA u serumu. To ukazuje na poremećen jetreni metabolizam HA, bez obzira na stupanj oštećenja jetre. Murawaki i sur. (24) su mjerili koncentracije HA u serumu bolesnika oboljelih od kroničnog hepatitisa C i ustanovili visoke koncentracije HA u serumu, pri čemu su razlike među bolesnicima s različitim stadijima jetrene fibroze bile statistički značajne; autori su zaključili kako bi određivanje koncentracije HA u serumu mogao biti od kliničkog značenja za procjenu stupnja težine i stadija bolesti kod tih bolesnika.
Postoji snažna pozitivna korelacija između koncentracije HA u serumu i stadija jetrene fibroze. Takva ja korelacija ustanovljena između srednje vrijednosti koncentracije HA u serumu i stupnja upale jetre; bolesnici s višim stupnjevima upale imali su više koncentracije HA u serumu. Korner i sur. izvješćuju kako među brojnim serumskim parametrima (kao što su laminin, A1-apolipoprotein i protrombinsko vrijeme) koncentracija HA najjače korelira s nekrotičnim oštećenjem jetre te se može rabiti za dugoročno praćenje napredovanja bolesti (25). Kupcova i sur. (26) izvješćuju da koncentracija HA raste u ranijim stadijima kronične bolesti jetre te da se najviše koncentracije mogu izmjeriti kod aktivne ciroze jetre i aktivnog kroničnog hepatitisa. U svom istraživanju provedenom u 141 bolesnika s kroničnim hepatitisom Tao i sur. (27) su utvrdili kako samo u 14,16% bolesnika koncentracija HA nije u skladu s njihovim histološkim stadijem jetrene fibroze te da je koncentracija HA u serumu bila u pozitivnoj korelaciji sa stupnjem upale. U drugom istraživanju koje su proveli Pilette i sur. (28) koncentracije HA u serumu bile su u najvišoj korelaciji s histološkim indeksima. U svojem su istraživanju Zhang i sur. (29) zaključili da serumska koncentracija HA raste s povišenjem stadija jetrene fibroze, dok Zheng i sur. (30) izvješćuju da su koncentracije HA u serumu porasle s težim stupnjem upale. Cai i sur. (31) opisuju kako su koncentracije HA u serumu bile u korelaciji s histopatološkim oštećenjima jetre i stupnjem upale.
Granična vrijednost od 59,5 ng/mL HA za razlikovanje između bolesnika s jetrenom fibrozom i zdravih ispitanika pokazala je dobru osjetljivost i specifičnost. AUC koncentracije HA u serumu kod analize krivuljom ROC bila je 0,932, što znači da se koncentracija HA može rabiti kao kriterij razlikovanja bolesnika s jetrenom fibrozom od zdravih osoba koje nemaju znakove bolesti. Slični su rezultati dobiveni u drugim istraživanjima za dijagnozu jetrene fibroze kod iste granične vrijednosti (odnosno 50 ng/mL) (23,32).
Nekoliko bi mehanizama moglo doprinositi povišenoj koncentraciji HA u serumu kod tih bolesnika. U početnom stadiju bolesti pojačana proizvodnja HA u aktiviranim zvjezdastim stanicama jetre mogla bi biti odgovorna za povišenje njene koncentracije u serumu (33). Kasnije, u naprednim stadijima bolesti kada se uspostavi sinusoidna kapilarizacija jetre i ciroza, smanjena razgradnja HA koju provode sinusoidne endotelne stanice može biti uzrokom povišenja koncentracije HA (34). Kao što smo pokazali u ovom istraživanju, u ranom stadiju jetrene fibroze (stadiji 0-2) i stupnjevima upale (stupnjevi 0-5; slika 2.) koncentracije HA u serumu bile su visoke, a najviše vrijednosti koncentracije HA u serumu izmjerene su kod fibroze stadija ≥ 3 i stupnja upale ≥ 6. Čini se da je napredovanje jetrene fibroze (i upale) bilo udruženo s poremećajem funkcije endotelnih stanica jetre, a time i sa smanjenom razgradnjom ovog heteropolisaharida, što naposljetku rezultira povišenjem koncentracije HA u serumu.
U ovom smo istraživanju primijetili da je koncentracija HA u serumu kod bolesnika s kroničnim hepatitisom – u populaciji sjevernog Irana – viša nego kod kontrolnih ispitanika, no čini se da se koncentracije razlikuju od onih iz ranijih istraživanja koja su provedena na području srednjeg i južnog Irana. Stoga su potrebna daljnja istraživanja kako bi se utvrdila točna razlika u serumskoj koncentraciji HA među populacijama raznih dijelova Irana.
Zaključujemo kako rezultati ovoga istraživanja ukazuju na to da se na temelju mjerenja koncentracije HA u serumu mogu razlikovati bolesnici s jetrenom fibrozom od zdravih ispitanika i da ta mjerenja mogu pružiti podatke o progresivnim promjenama u jetri sa smanjenom funkcijom endotelnih stanica jetre. Čini se da je serumska koncentracija HA uglavnom pokazatelj smanjene funkcije jetrenih endotelnih stanica kod kronične bolesti jetre te da je povezana s histopatološkim promjenama kod kronične bolesti jetre prema modificiranom Knodellovu indeksu. Nadalje, čini se da je povišenje koncentracije HA u serumu iznad granične vrijednosti (59,5 ng/mL) povezano s jetrenom fibrozom. Stoga se određivanje koncentracije HA u serumu može smatrati dodatnim kliničkim postupkom procjene jetrene fibroze u slučajevima kada je biopsija jetre kontraindicirana i ne može se provesti.
Naše je istraživanje imalo stanovita ograničenja. Ono ispituje koncentraciju HA u serumu u jednoj vremenskoj točki u životu bolesnika oboljelih od kronične jetrene bolesti. Kada bi se ovi bolesnici pratili i kada bi se biopsija jetre ponovila tijekom protokola liječenja, mogli bismo dobiti bolji uvid u metabolizam HA. Potrebno je daljnje prospektivno istraživanje kako bi se dobio cjelovit uvid u koncept metabolizma HA. S obzirom da naša kontrolna skupina nije bila ujednačena sa skupinom bolesnika prema statusu pušenja i unosu alkohola, moguće je da su pušenje i unos alkohola kod ispitanika sa bolešću jetre dodatno utjecali na koncentraciju HA u serumu.
 
Zahvala
 
Ovo je istraživanje potpomognuto stipendijom Gastroenterološkog centra za istraživanje u Tabrizu, Medicinskog fakulteta u Tabrizu i Medicinskog sveučilišta u Tabrizu, Iran. Srdačno zahvaljujemo prof. dr. Mahmoodu Vessalu na reviziji članka. Također zahvaljujemo dr. Hamedu Tabeshu na korisnim primjedbama i savjetima u vezi sa statističkom analizom podataka.
 
Literatura
 
1.     Gressner AM, Bachem MG. Cellular sources of noncollagenous matrixproteins: role of fat-storing cell in fibrogenesis. Semin Liver Dis 1990;10:30-46.
2.     Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury. J Biol Chem 2000;275:2247-50.
3.     Gressner OA, Weiskirchen R, Gressner AM. Biomarkers of liver fibrosis: clinical translation of molecular pathogenesis or based on liver-dependent malfunction tests. Clin Chim Acta 2007;381:107-13.
4.     Forns X, Ampurdanes S, Lovet J, Aponte J, Martinez-Bauer E, Bruguera M, et al. Identification of chronic hepatitis C patients without hepatic fibrosis by a simple predictive model. Hepatology 2002;36:4:986-92.
5.     Mason RM. Recent advances in the biochemistry of hyaluronan. Prog Clin Biol Res 1981;54:87-112.
6.     Collier JD, Woodall T, Wight D, Shore S, Gimson AE, Alexander G. Predicting progressive hepatic fibrosis stage on subsequent liver biopsy in chronic hepatitis C virus infection. J Viral Hepat 2005;12:74-80.
7.     Iushchuk ND, Znoiko O, Safiullina NK, Dudina KR, Kelli EI, Klimova EA, et al. Diagnostic significance of type IV collagen and hyaluronic acid in the serum of patients with chronic hepatitis C for staging hepatic fibrosis. Ter Arkh 2005;77:50-5.
8.     Ninomiya T, Yoon S, Hayashi Y, Sugano M, Kumon Y, Seo Y, et al. Clinical significance of serum hyaluronic acid as a fibrosis marker in chronic hepatitis C patients treated with interferon-alpha: histological evaluation by a modified histological activity index scoring system. J Gastroenterol Hepatol 1998;13:68-74.
9.     Halfon P, Bourlier M, Penaranda G, Deydier R, Renou C, Botta-Fridlund D, et al. Accuracy of hyaluronic acid level for predicting liver fibrosis stages in patients with hepatitis C virus. Comp Hepatol 2005,4:6.
10.   Fontana RJ, Lok AS. Noninvasive monitoring of patients with chronic hepatitis C. Hepatology 2002;36(5 Suppl 1):S557-64.
11.   Geramizadeh B, Janfeshan K, Saberfiroozi M. Serum hyaluronic acid as a noninvasive marker of hepatic fibrosis in chronic hepatitis B. Saudi J Gastroenterol 2008;14:174-7.
12.   Montazeri Gh, Estakhri A, Mohamadnejad M, Nouri N, Montazeri F, Mohammadkani A, et al. Serum hyaluronate as a non-invasive marker of hepatic fibrosis and inflammation in HBeAg-negative chronic hepatitis B. BMC Gastroenterol 2005;5:32.
13.   Ishak K, Baptista A, Bianchi L, Callea F, De Groote J, Gudat F, et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol 1995;22:696-9.
14.   Knodell RG, Ishak KG, Black WC, Chen TS, Craig R, Kaplowilz N, et al. Formulation and application of a numerical scoring system for assessing histological activity in symptomatic chronic active hepatitis. Hepatology 1981;1:431-5.
15.   Alvarez F, Berg P, Bianchi F, Bianchi L, Burroughs A, Cancado E, et al. International Autoimmune Hepatitis Group Report: review of criteria for diagnosis of autoimmune hepatitis. J Hepatol 1999;31:5:929-38.
16.   Zweig MH, Campbell G. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine. Clin Chem 1993;39(4):561-77.
17.   Huguet J, Castineiras MJ, Fuentes-Arderiu X. Diagnostic accuracy evaluation using ROC curve analysis. Scand J Clin Lab Invest 1993;53(7):693-9.
18.   Raslich MA, Market RJ, Stutes SA. Selecting and interpreting diagnostic tests. Biochemia Medica 2007;17(2):151-61.
19.   Xie S, Zheng R, Peng X, Gao Z. Accurate diagnosis of stage of hepatic fibrosis by measuring levels of serum hyaluronic acid, procollagen type III, and collagen type IV. Zhonghua Ganzangbing Zazhi 2001;9:334-6.
20.   Lebensztejn DM, Skiba E, Sobaniec-Lotowska ME, Kaczmarski M. Serum hyaluronan and laminin level in children with chronic hepatitis B during long-term lamivudine treatment. Hepatogastroenterology 2007;54:834-8.
21.   Korner T, Kropf J, Kosche B, Kristahl H, Jaspersen D, Gressner AM. Improvement of prognostic power of the Child-Pugh classification of liver cirrhosis by hyaluronan. J Hepatol 2003;39:947-53.
22.   Wong SM, Gibson R. Effects of eating on plasma hyaluronan in patients with cirrhosis: its mechanism and influence on clinical interpretation. J Gastroenterol Hepatol 1998;13:1218-24.
23.   McHutchison JG, Blatt LM, Medina M, Craig JR, Conrad A, Schiff ER, Tong MJ. Measurement of serum hyaluronic acid in patients with chronic hepatitis C and its relationship to liver histology. Consensus Interferon Study Group. J Gastroenterol Hepatol 2000;15(8):819-21.
24.   Murawaki Y, Ikuta Y, Okamoto K, Koda M, Kawasaki H. Diagnostic value of serum markers of connective tissue turnover for predicting histological staging and grading in patients with chronic hepatitis C. J Gastroenterol 2001;36:399-406.
25.   Korner T, Kropf J, Gressner AM. Serum laminin and hyaluronan in liver cirrhosis: markers of progression with high prognostic value. J Hepatol 1996;25:684-8.
26.   Kupcova V, Turecky L, Uhlikova E, Valkova M, Ilavaska S, Jahnova E. Changes of N-acetylglycosaminidase, hyaluronic acid and alpha-2-macroglubolin in patients with chronic viral hepatitis treated by interferon alpha. Physiol Res 2004;53:20p.
27.   Tao J, Peng H, Cai W, Dong F, Weng H, Liu R. Influence factors of serum fibrosis markers in liver fibrosis. World J Gastroenterol 2003;9(11): 2497-500.
28.   Pilette C, Rousselet M, Bedossa P, Chappard D, Oberti F, Rifflet H, et al. Histopathological evaluation of liver fibrosis: quantitative image analysis vs semi-quantitative scores. Comparison with serum markers. J Hepatol 1998;28:439-46.
29.   Zhang YX, Wu WJ, Zhang YZ, Feng YL, Zhou XX, Pan Q. Noninvasive assessment of liver fibrosis with combined serum aminotransferase/platelet ratio index and hyaluronic acid in patients with chronic hepatitis B. World J Gastroenterol 2008;14(46):7117-21.
30.   Zheng M, Cai W, Weng H, Liu HR. ROC curves in evaluation of serum fibrosis indices for hepatic fibrosis. World J Gastroenterol 2002;8(6):1073-6.
31.   Cai WM, Zhang BB, Weng HL, Hu ZR, Lv J, Zheng M, Liu RH. The diagnostic value of eight serum indices for liver fibrosis. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi 2004;12(4):219-22.
32.   Stickel F, Poeschl G, Schuppan D. Serum hyaluronate correlates with histological progression in alcoholic liver disease. Eur J Gastroenterol Hepatol 2003;15:945-50.
33.   Murawaki Y, Ikuta Y, Koda M, Nishimura Y, Kawasaki H. Clinical significance of serum hyaluronan in patients with chronic viral liver disease. J Gastroenterol Hepatol 1996;11:459-66.
34.   Guechot J, Poupon RE, Poupon R. Serum hyaluronan as a marker of liver fibrosis. J Hepatol 1995;22:103-6.