Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Izvorni stručni članak

 

Mojca Stegnar, Mojca Božič. Određivanje koncentracije D-dimera različitim kvantativnim testovima – vježba harmonizacije. Biochemia Medica 2008;18(2):216-23.

Klinika za vaskularne bolesti, Sveučilišni medicinski centar Ljubljana, Ljubljana, Slovenija

 *Corresponding author: mojca [dot] stegnar [at] kclj [dot] si

 

Sažetak

Uvod: Koncentracija D-dimera izmjerena različitim testovima pokazuje značajnu varijabilnost zbog nedostatka standardizacije. Opisujemo harmonizaciju koju smo proveli kako bi pokušali smanjiti tu varijabilnost koristeći uzorke plazme s visokom koncentracijom D-dimera.

Materijali i metode: Sudjelovalo je pet laboratorija s nekoliko različitih kvantitativnih D-dimer testova: Vidas D-dimer Exclusion (proizvođača Biomerieux), Auto-Dimer (Biopool), D-dimer Plus, Acute Care D-dimer (oba Dade Behring) i Hemosil D-Dimer (Instrumentation Laboratory). Za harmonizaciju je pripremljen set od šest plazmi: smjesa (engl. pool) normalnih plazmi i uzoraka A-E, pripremljenih miješanjem normalne plazme s rastućim udjelom (1, 2, 3, 8 i 14,7) smjese plazme bolesnika s visokom koncentracijom D-dimera. Za validaciju se koristilo 15 uzoraka plazme od bolesnika s venskom tromboembolijom.

Rezultati: Izračunat je referentni regresijski pravac kroz srednje vrijednosti koncentracije D-dimera u uzorcima A-E te je korišten za harmoniziranje rezultata 15 validiranih uzoraka. Nakon harmonizacije su se koeficijenti varijacije znatno poboljšali s 89% na 19% (srednje vrijednosti) za validirane uzorke s visokom koncentracijom D-dimera. Za validirane uzorke s niskom koncentracijom D-dimera (normalna ili približno granična) koeficijenti varijacije su se čak povisili sa srednje vrijednosti od 86% prije harmonizacije na srednju vrijednost od 224% nakon harmonizacije.

Zaključak: Proces harmonizacije znatno je smanjio varijabilnost između različitih testova kod uzoraka s visokom koncentracijom D-dimera. Međutim kod uzoraka s koncentracijom D-dimera oko granične, što je kritično za kliničku primjenu, nismo primjetili poboljšanje.

Ključne riječi: D-dimer, harmonizacija, validacija

Pristiglo: 28. veljače 2008.                                                                                                                        Prihvaćeno: 18. travnja 2008.

 

 

Uvod

Koncept mjerenja koncentracije D-dimera kao indikatora aktivacije koagulacije in vivo predstavljen je prije više od 20 godina (1,2). Danas su mjerenja koncentracije D-dimera postala bitan element u dijagnostici duboke venske tromboze i plućne embolije (3-6).

Primjećeno je da rezultati različitih brojčanih testova za određivanje D-dimera značajno variraju (7). Uglavnom su tome uzrok heterogenost fibrinskih razgradnih produkata u uzorcima bolesnika (8), kao i specifičnost različitih antitijela korištenih u tim testovima (9). Testovi za određivanje D-dimera pokazuju različitu reaktivnost prema različitim vrstama fibrinskih derivata, kao što su npr. visoko- i nisko molekularni fibrinski derivati, ili unakrsnu reaktivnost s nepoprečno povezanim fibrinogenskim i fibrinskim razgradnim produktima. Nedostatak standardizacije i različiti tipovi kalibratora koje koriste proizvođači dodatni su čimbenici koji utječu na rezultate testova (10).

U pokušaju standardiziranja testova za određivanje D-dimera koristili su se različiti standardi kao npr. pročćeni D-dimer, lizat pune krvi i x-oligomeri, ali neuspješno (11,12). Stoga se čini da je druga mogućnost standardizacije harmonizacija testova za D-dimere za koju se kao referentna priprema koristi smjesa (engl. pool) plazme bolesnika s visokom koncentracijom D-dimera (13).

Ovaj se pristup harmonizaciji rezultata kvantitativnih testova za D-dimere koristeći smjesu plazme bolesnika s visokom koncentracijom D-dimera (14) koristio u Sveučilišnom kliničkom centru Ljubljana, gdje se u nekoliko laboratorija različitih klinika provodi određivanje D-dimera. Pretpostavljalo se da će postupak harmonizacije povećati usporedivost rezultata D-dimera dobivenih u različitim laboratorijima istog medicinskog instituta.

 

Materijali i metode

Priprema plazme

Za pripremu smjese normalne plazme krv je bila sakupljena od 25 naizgled zdravih dobrovoljaca, uglavnom osoblja laboratorija i studenata. Izvađena krv iz kubitalne vene stavljena je u vakutejnere od 5 mL koji su sadržavali 0,5 mL natrijevog citrata koncentracije 0,109 mol/L (Becton Dickinson, Vacutainer System Europe, Heidelberg, Njemačka), dobro promješana s antikoagulansom, pohranjena odmah u ledenu vodu i centrifugirana 30 minuta na +4 °C i 2000 x g unutar 4 sata od vađenja krvi. Plazma je bila izvađena, pomiješana, alikvotirana, zamrznuta u tekućem dušiku i pohranjena na -70 °C do analize. Za pripremu harmoniziranih uzoraka pohranjeni su uzorci plazme 25 bolesnika s venskom tromboembolijom i visokom koncentracijom D-dimera (znatno iznad granične vrijednosti) bili odmrznuti i pomiješani (smjesa plazme bolesnika). U tim se uzorcima koncentracija D-dimera odredila Auto-Dimerom (Biopool Trinity Biotech, Umea, Švedska). Set od pet harmoniziranih uzoraka plazme s rastućom koncentracijom D-dimera pripremljen je miješanjem smjese normalne plazme s rastućim udjelom (1, 2, 3, 8 i 14,7) smjese plazme bolesnika (harmonizirani uzorci A-E). Uzorci su alikvotirani i zamrznuti u tekućem dušiku. Miješanje 6,35 mL smjese normalne plazme s 0,15 mL smjese plazme bolesnika (uzorak A) je određeno kao jedan udio. Za validaciju postupka harmonizacije korišteno je 15 pohranjenih uzoraka plazme (različite od one korištene za harmonizirane uzorke) s različitom koncentracijom D-dimera od bolesnika s venskom tromboembolijom (validirani uzorci V01-V15). Zamrznuti alikvoti smjese normalne plazme, harmonizirani uzorci A-E i validirani uzorci V01–V15 dopremljeni su laboratorojima koji su sudjelovali u istraživanju na Sveučilišnom kliničkom centru Ljubljana. Nakon odmrzavanja uzorci su se analizirali u roku od dva sata. Svi su uzorci plazme bolesnika korišteni za harmonizaciju i validaciju dobiveni na isti način kao što je opisano za smjesu normalne plazme.

 

Metode

Pet je laboratorija Sveučilišnog kliničkog centra Ljubljana sudjelovalo u istraživanju. Pet različitih kvantitativnih testova za određivanje D-dimera koristilo se rutinski ili samo za ovo istraživanje: Vidas D-dimer Exclusion on a Vidas analyser (oba od proizvođača: BioMerieux, Durham, North Carolina, SAD, laboratorij 1), Auto-Dimer (Biopool Trinity Biotech, Umea, Švedska, laboratorij 1) i D-dimer Plus (Dade Behring, Marburg/Lahn, Njemačka) na Behring Coagulation Timer (BCT, Dade Behring, Marburg/Lahn, Njemačka, laboratorij 1 i laboratorij 4) i na Behring Coagulation System (BCS, Dade Behring, Marburg/Lahn, Njemačka, laboratorij 2), Acute Care™ D-Dimer na Stratus CS (oba od proizvođača: Dade Behring, Marburg/Lahn, Njemački, laboratorij 1 and laboratorij 3), Hemosil D-dimer test na ACL 7000 (laboratorij 4) i na ACL 9000 (svi od proizvođača: Instrumentation Laboratory, Warrington, Ujedinjeno Kraljevstvo, laboratorij 5).

 

Postupak harmonizacije i validacije te drugi izračuni

Svi su laboratoriji tri puta testrali smjesu normalne plazme i harmonizirane uzorke A-E. Izračunate su srednje vrijednosti svakog testa posebno (Tablica 1.) i korigirane za udio D-dimera u smjesi normalne plazme. Korištena je regresijska analiza kako bi se izračunali regresijski pravci svakog testa i opći referentni regresijski pravac kroz medijane svakog testa te cjelokupni medijan posebno za svaki uzorak (Tablica 2.).

Validirani uzorci V01-V15 testirani su dva puta i rezultati su iskazani kao srednje vrijednosti. Rezultati su harmonizirani kao što je prethodno opisano (14) prema nagibu (a) i odsječku na osi y (b) regresijskog pravca za svaki test (m) i referentnog regresijskog pravca cijelokupnog medijana (h) prema formuli:

Npr. harmonizirana je vrijednost uzorka V08 određena Vidas D-dimer Exclusion testom (Tablica 3.) izračunata kao:

gdje je 6831 µg/L bio sirovi rezultat za uzorak V08 dobiven testom Vidas D-dimer Exclusion, a 2037 µg/L je izračunato kao harmonizirani rezultat.

Varijabilnost rezultata izražena je u postotku kao koeficijent varijacije. Za sva se računanja koristio Excel 97 (Microsoft Corporation, Orlando, Florida, SAD).

 

Rezultati

Tablica 1 pokazuje dobivenu srednju vrijednost koncentracije D-dimera (µg/L) kod harmoniziranih uzoraka A-E za svaki test. Vrijednosti smjese normalne plazme dobivene svakim testom oduzete od sirovih podataka vrijednosti uzoraka A-E također su prikazane u Tablici 1. U Tablici 2 prikazani su nagib, odsječak na osi y i koeficijenti regresije linearne regresijske analize kroz vrijednosti svakog testa te cjelokupni medijan.

 

Tablica 1. Koncentracija D-dimera pojedinog testa (µg/L) u smjesi normalne plazme (NPP) i kod harmoniziranih uzoraka A–E.

 

Tablica 2. Nagib, odsječak na osi y i koeficijenti linearne regresije kroz vrijednosti pojedinačnog testa te sveukupni medijan.

 

Najviša koncentracija D-dimera registrirana je s testom Acute Care™ D-Dimer na instrumentu Stratus CS, dok su približno 18-26 puta niže vrijednosti koncentracije bile zabilježene testom D-dimer Plus na instrumentu BCT ili BCS, a ostale vrijednosti koncentracije D-dimera ostale su između.

Kao što je očekivano, rezultati mjerenja koncentracije D-dimera u validacijskim uzorcima V01-V15 različitim testovima pokazali su značajnu varijabilnost prije harmonizacije. Općenito, harmonizacija je rezultirala značajno smanjenom varijabilnosti koncentracije D-dimera u validaciji uzoraka plazme V01-V15. Za sve se validacijske uzorke srednja vrijednost koeficijenta varijacije snizila s 89% prije harmonizacije na 60% nakon harmonizacije. Veće sniženje varijacije s 89% na 19% (oba se postotka odnose na srednju vrijednost) zabilježeno je za validacijske uzorke V04-V15 s visokom koncentracijom D-dimera. S druge strane, za tri validacijska uzorka V01-V03 s normalnom koncentracijom D-dimera i onom koja se kreće oko graničnih vrijednosti, koeficijenti varijacije čak su porasli sa srednje vrijednosti od 86% prije harmonizacije na srednju vrijednost od 224% nakon harmonizacije (Tablica 3.).

 

Tablica 3. Koncentracija D-dimera (µg/L) kod validacijskih uzoraka V01–V15 dobivena različitim testovima prije i poslije harmonizacije. Koeficijenti varijacije (CV) prikazani su za svaki validacijski uzorak.

 

Rasprava

Ovo je ispitivanje pokazalo da je harmonizacija rezultata kvantitativnih testova za određivanje D-dimera bila moguća sa smjesom plazme bolesnika, no bila je ograničena na visoke koncentracije D-dimera. U području koncentracije oko granične vrijednosti harmonizacija nije smanjila varijabilnost rezultata.

Inicijativa za harmonizacijom potaknuta je činjenicom da se nekoliko testova za određivanje D-dimera u istom medicinskom institutu. Budući da rezultati dobiveni tim testovima nisu usporedivi, liječenje bolesnika neće biti optimalno, ukoliko liječnici nisu svjesni odstupanja između različitih testova i time različite granične vrijednosti njihovih rezultata. Štoviše, razmjena rezultata za D-dimere između bolnica često je otežana. Preporuča se da se zbog razlike u monoklonalnim antitijelima, tehnologijama testova i kalibraciji, rezultati različitih testova za određivanje D-dimera ne koriste u kliničkim istraživanjima te da se, ne samo u znanstvenim publikacijama, već i u kliničkoj rutini, jasno navodi test koji je korišten kako bi se omogućila odgovarajuća interpretacija izmjerenih koncentracija D-dimera (10).

Budući da antigen D-dimera nije homogeni analit, već predstavlja koglomerat fibrinskih derivata različitih veličina i struktura molekula (15), standardizacija testova za određivanje D-dimera je teška (13,16,17). Trenutno se mjerenja D-dimera zasnivaju na referentnim krivuljama svakog pojedinačnog testa, a kalibracija se odabire od svakog pojedinačnog proizvođača. Brojčani se rezultati izražavaju kao koncentracija D-dimera, koja se zasniva na kalibraciji s pročćenim D-dimerom, ili u jedinicama FEU (engl. fibrinogen-equivalent units) koje se zasnivaju na broju pročćenog fibrinogena korištenog za pripremu poprečno povezanog fibrinskog ugruška, kojega tada plazmin razlaže te se koristi se kao kalibrator. Treća vrsta kalibratora koji koriste neki proizvođači zasniva se na smjesi plazme bolesnika s povišenom koncentracijom D-dimera (10). Budući da su različiti pristupi kalibraciji doveli do promjenjivih rezultata koncentracije D-dimera, konsenzusom je odlučeno da je potreban univerzalni kalibrator. Taj bi kalibrator trebao odražavati heterogenost spojeva koji sadržavaju antigen D-dimera nađen u kliničkim uzorcima krvi, što predstavlja cilj koji još nije postignut (18).

Drugi pristup usporedivim vrijednostima koncentracije D-dimera dobivenih različitim testovima jest harmonizacija korištenjem smjese plazme bolesnika (13,17). Harmonizacija se zasniva na matematičkoj transformaciji regresijskih pravaca koji prolaze kroz vrijednosti svakog pojedinačnog testa provedenog na setu uzoraka plazmi s različitom koncentracijom D-dimera u referentni regresijski pravac koji prolazi kroz cjelokupnu srednju vrijednosti svih testova koji se harmoniziraju (14,19). Prednost ovog pristupa je da će se u smjesi plazme bolesnika pojaviti sve različite vrste razgradnih produkata fibrina, a ograničenje je da bi se rezultati pojedinačnih bolesnika ili specifičnih grupa bolesnika (npr. bolesnici s dubokom venskom trombozom ili bolesnici s diseminiranom intravaskularnom koagulacijom) mogli ponašati različito. Budući da ne postoji referentni test za određivanje D-dimera, kao nezavisna varijabla koristi se udio smjese plazme bolesnika koja se dodaje smjesi normalne plazme. Vrijednosti pojedinačnih testova korištene u ovom modelu harmonizacije odražavaju odgovor različitih testova na vrstu D-dimera korištenu u smjesi plazme bolesnika. Ako u ovoj harmonizaciji sudjeluje velik broj laboratorija, tada procijenjene i prihvaćene vrijednosti pojedinačnog testa postaju pouzdane aproksimacije takozvanih „analitički točnih vrijednosti“ za te uzorke.

U ovom je istraživanju izvedena harmonizacija rezultata različitih testova za određivanje D-dimera kao što je objavljeno (14). U usporedbi s jednom objavljenom harmonizacijom (14) koja je dovela do smanjenja varijabilnosti s oko 75% na 5,5%, u našem je istraživanju smanjenje bilo puno manje (s oko 89% na oko 60%) za sve validirane uzorke, no bilo je znatno bolje za uzorke s visokom koncentracijom D-dimera (V04-V15) (sniženje s oko 89% na 19%). Za uzorke s koncentracijom D-dimera oko i ispod granične vrijednosti (V01-V03), koeficijent varijacije čak je porastao nakon harmonizacije (s oko 86% na oko 224%). U spomenutom, objavljenom istraživanju (14) sudjelovalo je više od 500 laboratorija i korišteno je više od 20 različitih testova. Iako je u postavljanju modela harmonizacije upotrebljeno samo sedam najčće korištenih testova, broj rezultata bio je bitno viši u usporedbi s našim istraživanjem u kojem je sudjelovalo samo pet laboratorija. Iako se postupak harmonizacije proveden u našem istraživanju ne bi mogao primijeniti u izvještavanju o rezultatima iz raznih laboratorija, on je predstavio prikaz (ne)kompatibilnosti rezultata D-dimer testova koje koristi naš medicinski institut.

 

Zaključak

Zaključno, usvojeni postupak harmonizacije značajno je poboljšao usporedivost različitih testova za određivanje D-dimera kod uzoraka s visokom koncentracijom D-dimera. Međutim, kod uzoraka s normalnom koncentracijom D-dimera i onom blizu granične vrijednosti nije primjećeno smanjenje varijabilnosti rezultata. Tome je vjerojatno djelomično pridonio mali broj laboratorija koji su sudjelovali, ali i mali broj harmoniziranih uzoraka u rasponu od normalnih do oko graničnih vrijednosti koncentracije D-dimera. Budući da su vrijednosti koncentracije D-dimera oko granične ključne za isključivanje dijagnoze duboke venske tromboze i plućne embolije ovaj postupak harmonizacije nije mogao biti usvojen u izvještavanju o rezultatima iz raznih laboratorija.

 

Zahvale

Autori zahvaljuju voditeljima laboratorija Katarini Lenart, Nadi Snoj, Alenki Trampuš Bakija i Jani Kralj te tehničarima istih laboratorija za izvanrednu tehničku pomoć, i slovenskom predstavništvu tvrtke Dade Behring i tvrtkama Dipros i Mikro+Polo za opskrbu reagenasima i analizatorima.

 

Literatura

1.     Gaffney PJ. Distinction between fibrinogen and fibrin degradation products in plasma. Clin Chim Acta 1975;65:109-15.

2.     Gaffney PJ, Lane DA, Kakkar VV, Brasher M. Characterisation of a soluble D dimer-E complex in crosslinked fibrin digests. Thromb Res 1975;7:89-99.

3.     Heim SW, Schectman JM, Siadaty MS, Philbrick JT. D-dimer testing for deep venous thrombosis: a metaanalysis. Clin Chem 2004;50:1136-47.

4.     Perrier A, Roy PM, Aujesky D, Chagnon I, Howarth N, Gourdier AL, et al. Diagnosing pulmonary embolism in outpatients with clinical assessment, D-dimer measurement, venous ultrasound, and helical computed tomography: a multicenter management study. Am J Med 2004;116:291-9.

5.     Perrier A, Palareti G. D-dimer testing and venous thromboembolism: four view points. J Thromb Haemost 2005;3:382-4.

6.     Michiels JJ, Freyburger G, van der Graaf F, Janssen M, Oortwijn W, van Beek EJ. Strategies for the safe and effective exclusion and diagnosis of deep vein thrombosis by the sequential use of clinical score, D-dimer testing, and compression ultrasonography. Semin Thromb Hemost 2000;26:657-67.

7.     Janssen MC, Wollersheim H, Verbruggen B, Novakova IR. Rapid D-dimer assays to exclude deep venous thrombosis and pulmonary embolism: current status and new developments. Semin Thromb Hemost 1998;24:393-400.

8.     Dempfle CE. Validation, calibration, and specificity of quantitative D-dimer assays. Semin Vasc Med 2005;5:315-20.

9.     Reber G, de Moerloose P. D-dimer assays for the exclusion of venous thromboembolism. Semin Thromb Hemost 2000;26:619-24.

10.   Dempfle CE. D-dimer assays: the current status and new assay technologies. Thromb Res 2006;118:569-71.

11.   Koopman J, Haverkate F, Koppert P, Nieuwenhuizen W, Brommer EJ, Van der Werf WG. New enzyme immunoassay of fibrin-fibrinogen degradation products in plasma using a monoclonal antibody. J Lab Clin Med 1987;109:75-84.

12.   Gaffney PJ, Edgell T, Creighton-Kempsford LJ, Wheeler S, Tarelli E. Fibrin degradation product (FnDP) assays: analysis of standardization issues and target antigens in plasma. Br J Haematol 1995;90:187-94.

13.   Nieuwenhuizen W. A reference material for harmonisation of D-dimer assays. Fibrinogen Subcommittee of the Scientific and Standardization Committee of the International Society of Thrombosis and Haemostasis. Thromb Haemost 1997;77:1031-3.

14.   Meijer P, Haverkate F, Kluft C, de Moerloose P, Verbruggen B, Spannagl M. A model for the harmonisation of test results of different quantitative D-dimer methods. Thromb Haemost 2006;95:567-72.

15.   Gaffney PJ. Fibrin degradation products. A review of structures found in vitro and in vivo. Ann N Y Acad Sci 2001;936:594-610.

16.   Dempfle CE, Zips S, Ergul H, Heene DL. The fibrin assay comparison trial (FACT): correlation of soluble fibrin assays with D-dimer. Thromb Haemost 2001;86:1204-9.

17.   Dempfle CE, Zips S, Ergul H, Heene DL. The Fibrin Assay Comparison Trial (FACT): evaluation of 23 quantitative D-dimer assays as basis for the development of D-dimer calibrators. FACT study group. Thromb Haemost 2001;85:671-8.

18.   Dempfle CE. D-dimer: standardization versus harmonization. Thromb Haemost 2006;95:399-400.

19.   Meijer P, Kluft C. The harmonization of quantitative test results of different D-dimer methods. Semin Vasc Med 2005;5:321-7.