Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Izvorni znanstveni članak

 

Margareta Radić Antolic1, Renata Zadro1*, Dubravka Sertić2, Boris Labar2. Praćenje odgovora bolesnika oboljelih od kronične mijeloične leukemije na liječenje inhibitorima tirozin-kinaze kvantitativnom lančanom reakcijom polimeraze u stvarnom vremenu. Biochemia Medica 2009;19(1):63-72.
 
1Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinički bolnički centar Zagreb, Zagreb
2Klinika za unutarnje bolesti, Klinički bolnički centar Zagreb, Zagreb
Corresponding author*:  rzadro [at] mef [dot] hr
 
Sažetak
 
Uvod: Kroz povijest je terapija kronične mijeloične leukemije (engl. chronic myeloid leukemia, CML) imala puno revolucionarnih pomaka,među kojima je najvažniji uvođenje imatinib mesilata (engl. imatinib mesylate, IM). Preciznija procjena terapijskog odgovora na IM i točno mjerenje stupnja smanjenja prijepisa BCR-ABL, može se postići upotrebom kvantitativne lančane reakcije polimeraze u stvarnom vremenu (engl. real-time quantitative polymerase chain reaction, RQ-PCR).
Cilj: Kvantificirati prijepise BCR-ABL kod bolesnika s CML i promatrati odgovor na liječenje inhibitorima tirozin-kinaze.
Materijali i metode: U istraživanje je bio uključen 31 bolesnik liječen pomoću IM. Napravljena je RQ-PCR prema protokolu Europe Against Cancer s ABL kao „kućepaziteljskim” genom (engl. housekeeping gene) i izračunat je omjer BCR-ABL/ABL. Bolesnici su podijeljeni u skupine prema kriterijima Europske mreže za leukemiju (engl. European Leukemia Net) za postizanje značajnog molekularnog odgovora (engl. major molecular response, MMoR). I. skupina sastojala se od 11 bolesnika sa smanjenjem višim od 3 log, II. skupina od 13 bolesnika sa smanjenjem nižim od 3 log, a III. skupina od 7 bolesnika koji su bili manje od 18 mjeseci na kontrolama i praćenju.
Rezultati: Bolesnici I. skupine, koji su bili pozitivni ili negativni na prijepis BCR-ABL, odgovarali su na terapiju u vremenu od 2 godine praćenja i kontrola te su ispunili kriterije za povoljnu dugoročnu prognozu. Bolesnici II. skupine nisu odgovarali na terapiju pomoću IM te su zahtijevali drugačiji terapijski pristup, višu dozu istog inhibitora tirozin-kinaze ili drugu generaciju lijeka. Sedmoro bolesnika III. skupine kojima je nedavno dijagnosticirana bolest, praćeni su manje od 18 mjeseci pa im se MMoR nije mogao procijeniti. Primjenom iste analogije kao kod prve dvije skupine, može se napraviti prognoza tijeka bolesti.
Zaključak: Naši rezultati pokazuju da je RQ-PCR obvezna metoda za pažljivo promatranje odgovora na liječenje inhibitorima tirozin-kinaze, radi omogućavanja ispravne terapije te kako bi se odlučilo treba li mijenjati terapiju, a u slučaju da treba, kada to učiniti.
Ključne riječi:kronična mijeloična leukemija; imatinib mesilat; kvantitativna lančana reakcija polimeraze; značajni molekularni odgovor.
 
Pristiglo: 6. lipnja 2008.                                                                                                           Prihvaćeno: 19. studenog 2008.
 
Uvod
 
Kronična mijeloična leukemija (engl. chronic myeloid leukemia, CML) otkrivena je u prvoj polovini 19. stoljeća (1). Ovaj tip leukemije obilježava pojačana granulocitopoeza u koštanoj srži i perifernoj krvi. Bitan znak CML je tzv. filadelfijski kromosom (engl. Philadelphia chromosome, Ph chromosome), rezultat translokacije t(9;22) najvjerojatnije u jednoj hematopoetskoj matičnoj stanici. Taj tip preraspodjele gena s uskog dijela kromosoma (engl. breakpoint cluster region, BCR) na kromosomu 22 na područje kinaze ABL na kromosomu 9, rezultira stvaranjem fuzijskog gena BCR-ABL. Proizvod fuzijskog gena je protein BCR-ABL, čija prejaka tirozin-kinazna aktivnost stimulira povećano stvaranje stanica (2).
Kroz povijest je bilo puno revolucionarnih pomaka u terapiji CML. Jedan od najčešće upotrebljavanih lijekova 50-ih godina prošloga stoljeća bio je busulfan, no nakratko je zamijenjen hidroksikarbamidom. Za interferon-alfa, koji je uveden u terapiju 80-tih godina, dokazano je da dovodi do negativnog nalaza Ph kromosoma u koštanoj srži. Između 1980. i 2000. presađivanje koštane srži bila je prva terapijska opcija kod mladih bolesnika s HLA-podudarnim darivateljima (engl. HLA-matched donors). Najvažnije otkriće u liječenju bio je inhibitor tirozin-kinaze ABL, imatinib mesilat (engl. imatinib mesylate, IM). IM je 2-fenilaminopirimidinski spoj, mala molekula koja uspješno blokira kinaznu aktivnost proteina BCR-ABL. IM zauzima mjesto vezanja ATP u proteinu BCR-ABL, uzrokujući zatvorenu konfiguraciju i inhibiciju enzimske aktivnosti proteina (2). IM se uzima oralno s početnom dozom od 400 mg na dan i zlatni je standard za prvu terapiju kod bolesnika s tek dijagnosticiranom CML, zbog ograničene toksičnosti i visoke stope povoljnog terapijskog odgovora.
Učestalost potpunog citogenetičkog odgovora (engl. complete cytogenetic response, CCyR) vrlo je visoka kod bolesnika koji su uzimali IM, što se vidi iz činjenice da u praćenim uzorcima nije nađena pozitivna Ph metafaza. Jednom kada bolesnik postigne CCyR, kvantitativna lančana reakcija polimerazom u stvarnom vremenu (engl. real-time quantitative polymerase chain reaction, RQ-PCR) je metoda koja daje najviše informacija o količini prijepisa BCR-ABL (1,4). Kod ove je metode broj prijepisa BCR-ABL u korelaciji s brojem prijepisa kontrolnog gena (ABL), koji je u stanicama zahvaćenim leukemijom izražen u približno istoj količini kao i u zdravim stanicama. Općenito se rezultat izražava kao logaritam smanjenja omjera BCR-ABL/ABL. Smanjenje od 3 ili više log omjera BCR-ABL/ABL unutar 18 mjeseci zove se značajnim molekularnim odgovorom (engl. major molecular response, MMoR) (2,4). Pokazalo se da je točno mjerenje smanjenja prijepisa BCR-ABL obrnuto proporcionalno s vjerojatnošću progresije bolesti (1).
Nadalje, bolesnici koji su odgovorili na terapiju mogu ostati pozitivni i stabilni ili negativni za prijepis BCR-ABL tijekom kontrola i praćenja. Za bolesnike koji ne odgovaraju na lijek ili za one koji nikada ne odreagiraju na terapiju, praćenje omjera BCR-ABL/ABL od velike je važnosti, kako bi se mogla revidirati strategija terapije. Velik dio tih bolesnika razvija otpornost na lijek, što je uzrokovano mutacijama na području kinaze ABL (5) ili pokazuju nedefinirane individualne farmakokinetičke varijacije. Moguće liječenje takvih bolesnika jest povećanje doze IM (600 ili 800 mg na dan), korištenje inhibitora tirozin-kinaze druge generacije (nilotinib, dasatinib) ili presađivanje koštane srži (2).
Cilj ovoga istraživanja bio je procijeniti djelotvornost protokola liječenja i postići bolju procjenu odgovora pojedinih bolesnika na liječenje pomoću IM primjenom osjetljive tehnike mjerenja omjera BCR-ABL/ABL metodom kvantitativne lančane reakcije polimeraze, kako bi se bolesnici stratificirali prema riziku od relapsa bolesti te kako bi se individualizirao protokol liječenja.
 
Materijali i metode
 
U istraživanje je bio uključen 31 bolesnik (13 žena i 18 muškaraca) s dijagnozom CML. Desetoro bolesnika bilo je prethodno liječeno busulfanom ili interferonom-alfa, dok je kod 21 bolesnika CML bila tek nedavno dijagnosticirana. Postavljanje dijagnoze i liječenje odvijalo se na Klinici za unutarnje bolesti Kliničkog bolničkog centra Zagreb. Početna doza IM za sve bolesnike bila je 400 mg na dan. Bolesnici su praćeni 39 mjeseci (medijan; raspon 3–81).
RNA je izolirana iz koštane srži ili stanica periferne krvi pomoću komercijalnog reagens paketa QuickPrep mRNA purification kit (GE Healthcare, UK) prema uputama proizvođača. RQ-PCR je provedena prema protokolu EAC uz primjenu tehnologije TaqMan (LightCycler, Roche) (6). Reverzna transkripcija RNA odvijala se u volumenu reakcijske smjese od 20 μL uporabom FirstStrand cDNA synthesis kit (Amersham Biosciences, UK). Amplifikacija fuzijskog gena BCR-ABL i ABL kao kontrolnog gena (RQ-PCR) napravljena je setom FusionQuantKit za analizu gena BCR-ABL metodom RQ-PCR Mbcr (Ipsogen, France) prema uputama proizvođača. Svi su uzorci fuzijskog gena BCR-ABL i gena ABL analizirani tri puta te je izračunat omjer BCR-ABL/ABL (7).
Od neliječenih bolesnika pri dijagnozi je iz odnosa BCR-ABL/ABL dobivena standardizirana osnovna vrijednost koja je zatim upotrebljena za izračun log vrijednosti pada fuzijskog prijepisa u svim uzorcima u vremenu praćenja (1,6)
Bolesnici su podijeljeni u skupine prema izračunatom log smanjenju omjera BCR-ABL/ABL tijekom 18 mjeseci promatranja na IM terapiji. U I. skupini bilo je 11 bolesnika koji su postigli više od 3 log smanjenja u 18 mjeseci, u II. skupini bilo je 13 bolesnika koji su imali smanjenje manje od 3 log u 18 mjeseci terapije pomoću IM, dok je u III. skupini bilo 7 bolesnika koji su bili na promatranju manje od 18 mjeseci.
 
Rezultati
 
Ukupno je 31 bolesnik s dijagnosticiranom CML započeo terapiju pomoću IM (400 mg na dan) i bio na promatranju 39 mjeseci (medijan; raspon 3–81). Tijekom razdoblja promatranja i odlazaka na kontrole 6 od 31 bolesnika bilo je negativno za prijepis BCR-ABL, što je izmjereno pomoću RQ-PCR. Rezultati stope terapijskog odgovora na IM unutar 18 mjeseci za I. i II. skupinu te posljednji uzorak promatranja III. skupine prikazani su na slici 1.
 
 
Slika 1. Log smanjenje omjera BCR-ABL/ABL u ispitivanim grupama dosegnuto u 18 mjeseci (grupa I i II) i u uzorcima praćenim <18 mjeseci (grupa III). MMoR – glavni molekularni odgovor.
 
Rezultati 11 bolesnika (I. skupina) koji su postigli smanjenje od 3 ili više log i time ispunili kriterije za MMoR prikazani su u tablici 1. Shematski prikaz promatranja IM terapije i reakcije na terapiju u toj skupini nalazi se na slici 2a. Ti su bolesnici bili promatrani tijekom 39 mjeseci (medijan; raspon 22–63) a MMoR su zadržali 21 mjesec (medijan; raspon 4–45). Od trenutka postizanja MMoR kod šestoro tih bolesnika, uključujući i troje prethodno liječenih busulfanom i interferonom-alfa, prijepis BCR-ABL je bio negativan tijekom 25 mjeseci (medijan; raspon 4–45). Niti kod jednog od tih bolesnika nije bilo recidiva bolesti. Ostalih četvoro bolesnika bilo je periodično pozitivno na prijepis BCR-ABL u promatranom vremenu od 29 mjeseci (medijan; raspon 11–42). Jedan od njih više nije reagirao na terapiju te je, nakon 11 mjeseci promatranja i kontrola, došlo do recidiva. Samo je jedan bolesnik pozitivan za prijepis BCR-ABL odgovorio na terapiju tijekom 14 mjeseci, u jednom trenutku odgovor se izgubio, no nije došlo do recidiva.
 
Tablica 1. Rezultati praćenja grupe I
 
 
Rezultati 13 bolesnika (II. skupina) koji u 18 mjeseci nisu odgovorili na IM terapiju prikazani su u tablici 2. Shematski prikaz promatranja IM terapije bez postignutog MMoR u II. skupini nalazi se na slici 2b. Kod ovih bolesnika promjene u terapiji dogodile su se nakon 27-mjesečnog promatranja (raspon 7–67 mjeseci) kad je šest bolesnika započelo s povećanom dozom IM (600 ili 800 mg na dan). U razdoblju praćenja od 15 mjeseci (raspon 6–41) nitko od njih nije pozitivno odgovorio na terapiju. Jedan od ovih bolesnika započeo je uzimati dasatinib, nakon što se pokazalo da IM terapija nije uspješna (vrijeme praćenja 41 mjesec) i u 9 mjeseci je postigao više od 3 log smanjenja. Ostala dva bolesnika na terapiji dasatinibom postigla su manje od jednog log smanjenja u 14, odnosno 25 mjeseci praćenja i dolazaka na kontrolu. Druga su dva bolesnika bila na terapiji nilotinibom, od kojih je jedan u 10 mjeseci postigao smanjenje od samo 0,2 log, a drugi 2,2 log u 5 mjeseci. Bolesnik negativan za prijepis BCR-ABL, kod kojega nije došlo do odgovora na IM terapiju, bio je 11 mjeseci kasnije podvrgnut presađivanju koštane srži. Sedmoro bolesnika iz ove skupine bilo je prethodno liječeno busulfanom i interferonom-alfa. Petoro od njih, kao i dvoje od šestoro bolesnika sa novodijagnosticiranom CML, nisu odgovorili na promjenu terapije. Za dva bolesnika koji su prethodno liječeni busulfanom i interferonom-alfa ne postoje podaci o tijeku terapije.
 
 
Tablica 2. Rezultati praćenja grupe II
 
 
 
 
Slika 2. Praćenje bolesnika na terapiji s IM: a) odgovor na terapiju IM u grupi I, b) bez odgovora na terapiju IM u grupi II. BMT – transplantacija koštane srži, MMoR – glavni molekularni odgovor
 
 
III. skupina uključivala je sedam bolesnika kojima je nedavno dijagnosticirana CML (Tablica 3.) i koji su bili na promatranju manje od 18 mjeseci (medijan 8 mjeseci, raspon 3–12 mjeseci) te im se stoga MMoR nije mogao procijeniti. Dvoje od njih postiglo je smanjenje 3 log u 3, odnosno 10 mjeseci praćenja, ostalo dvoje postiglo je smanjenje od 2 log u 3, odnosno 8 mjeseci. Posljednja 3 bolesnika postigla su smanjenje manje od 2 log u 6 mjeseci (medijan, raspon 3–12).
 
Tablica 3. Rezultati praćenja grupe III
 
 
Rasprava
 
U hematologiji su metode mjerenja osnovni alati, naročito u slučaju leukemije, gdje su brojanje i identifikacija stanica u krvi i koštanoj srži tradicionalne metode (8). Dugo se odgovor na terapiju za CML mjerio brojem stanica zahvaćenih leukemijom koje potiču od pojačane granulocitopoeze. S vremenom je poboljšanje terapije počelo zahtijevati osjetljivije tehnike za bolju procjenu odgovora (9). Šezdesetih godina prošloga stoljeća otkrivena je specifična anomalija kromosoma u CML, poznata kao Ph kromosom. Identifikacija i kvantifikacija Ph pozitivnih metafaza postala je dragocjen podatak pri potvrđivanju dijagnoze i praćenju terapijskog odgovora (1,2). Međutim, želja za daljnjim unapređenjem osjetljivosti dovela je do uvođenja molekularnih tehnika za mjerenje prijepisa BCR-ABL. Otkriće inhibitora tirozin-kinaze ABL, imatinib mesilata, bila je revolucionaran korak u liječenju CML a jedina metoda za mjerenje razine postignute remisije je kvantitativna lančana reakcija polimerazom u stvarnom vremenu (2,7,11). Mjerenje razine prijepisa BCR-ABL, izraženog kao log smanjenja omjera BCR-ABL/ABL, rabi se u svrhu omogućavanja bolje procjene terapijskog odgovora na IM pojedinačnih bolesnika te za ocjenu djelotvornosti protokola liječenja. Može se rabiti i za stratifikaciju bolesnika prema riziku od pojave recidiva, a presudan je u preispitivanju terapijske strategije.
Iako potpuna procjena odgovora prema udruženju Europske mreže za leukemiju (engl. European Leukemia Net) uključuje kliničku procjenu, krvnu sliku, citogenetičku analizu koštane srži i izračunavanje omjera BCR-ABL/ABL svaka 3 mjeseca od početka terapije (2), u ovom istraživanju je za promatranje bolesnika s CML u standardnom protokolu liječenja pomoću IM primijenjeno samo log smanjenje omjera BCR-ABL/ABL. Općenito, smanjenje omjera BCR-ABL/ABL u bliskoj je uzajamnoj vezi s zadovoljavajućim hematološkim i citogenetičkim odgovorom. Poznato je da je smanjenje omjera BCR-ABL/ABL od 2 log tijekom 12 mjeseci promatranja u skladu s Ph negativnim nalazom u koštanoj srži (CCyR) (10). U tom je razdoblju RQ-PCR jedini način za daljnje promatranje molekularnog odgovora koji ovisi o stopi i stupnju smanjenja prijepisa BCR-ABL (2,11).
Bolesnici I. skupine odgovorili su na terapiju i bili su pozitivni ili negativni za prijepis BCR-ABL tijekom dvogodišnjih dolazaka na kontrolu i promatranja te su ispunili kriterije za povoljnu dugoročnu prognozu prema navodima iz literature (10). Unatoč tome, praćenje treba provoditi neograničeno dugo te uključiti i bolesnike s negativnim prijepisom BCR-ABL što je različito od potpune molekularne remisije jer je RQ-PCR nedovoljno osjetljiva metoda (2,11). Rezultati I. skupine pokazuju, da čak i kod takvih bolesnika, terapijski odgovor (MMoR) može izostati te mogu doživjeti recidiv zbog stečene otpornosti na IM ili zbog interakcija s drugim lijekovima. Jedan od bolesnika nije više odgovarao na terapiju u trenutku kad je počeo uzimati kompetitivni lijek (tamsulosin hidroklorid). Taj je bolesnik, kad je prestao uzimati tamsulosin hidroklorid, postao opet negativan za prijepis BCR-ABL. Teoretski, mehanizam reakcije mogao bi biti kompeticija s IM za prenosioce te posljedično tome stanična raspoloživost IM. Još je jedan bolesnik pozitivan za prijepis BCR-ABL, koji je pozitivno odgovarao na terapiju, doživio recidiv nakon 11 mjeseci, što predstavlja razlog više da ove bolesnike valja pažljivije promatrati, kako bi se mogao predvidjeti tijek bolesti i mogući recidiv.
Bolesnici iz II. skupine nisu reagirali na terapiju pomoću IM. Većini je CML dijagnosticirana godinama prije uvođenja IM u terapiju CML, pa su uzimali busulfan i interferon-alfa u različitim razdobljima, te stoga nisu reprezentativni za procjenu djelotvornosti liječenja. Za mali broj bolesnika iz ove skupine kojima je nedavno dijagnosticirana CML i kod kojih uzimanjem IM nije došlo do reakcije bio je, prema navodima iz literature, potreban drukčiji pristup: viša doza IM i drugih inhibitora tirozin-kinaze (10). Naši su rezultati pokazali da je povećana doza IM izazvala trenutan odgovor kod malog broja bolesnika, no niti jedan od njih nije dugoročno odgovorio na terapiju (Tablica 2.). S druge strane, uvođenje i upotreba druge generacije inhibitora tirozin-kinaze ABL, dasatiniba i nilotiniba, što ovisi o dokazanoj točkastoj mutaciji kod bolesnika otpornog na IM (s iznimkom mutiranog klona T315I), daje snažnu stopu povoljnog terapijskog odgovora (2). Rezultati dvaju bolesnika koji su reagirali na terapiju u manje od godinu dana nakon početka terapije, jedan dasatinibom, a drugi nilotinibom, potvrđuju djelotvornost ovih lijekova. Potaknuta su daljnja istraživanja kako bi se ispitala dugoročna djelotvornost ovih lijekova i moguće neželjene nuspojave. Da je presađivanje koštane srži još uvijek terapija prvoga izbora kod mladih bolesnika otpornih na IM s HLA-odgovarajućim darivateljem, potvrđuje slučaj bolesnika iz II. skupine. Taj bolesnik nije reagirao na terapiju IM, no nakon transplatacije je u godinu dana praćenja postigao i zadržao MMoR.
 
Ako se upotrijebi analogija dviju posljednjih skupina, može se zaključiti da bi se daljnji tijek bolesti mogao predvidjeti i za bolesnike III. skupine, za sedmoro bolesnika kojima je nedavno dijagnosticirana CML i kod kojih je primijenjen IM kao prva linija terapije. Dva bolesnika postigla su smanjenje više od 3 log jedan u 6, a drugi u 10 mjeseci. Druga dva su u 3, odnosno 8 mjeseci postigli smanjenje više od 2 log. Razumno je očekivati da ti bolesnici postignu i zadrže MMoR. Zadnja su tri bolesnika u 6 mjeseci imali smanjenje manje od 2 log, ali je još uvijek prerano predviđati neuspjeh, usprkos slabom terapijskom odgovoru na IM.
Zaključno, uspjeh terapije pomoću IM u liječenju CML potaknuo je izradu preporuka koje se temelje na objavljenim istraživanjima (1,2,6,7). Bolesnici kojima je dijagnosticirana CML, trebali bi proći početno liječenje pomoću IM (početna doza 400 mg na dan) i u slučaju pozitivne reakcije, terapiju treba nastaviti bez vremenskog ograničenja. Svi se bolesnici trebaju pratiti u određenim razdobljima, što uključuje izradu kliničke procjene, krvne slike, citogenetičke procjene koštane srži i mjerenja fuzijskog prijepisa BCR-ABL svaka 3 mjeseca, kako bi se na svakoj kontroli odredilo radi li se o osobi koja ne odgovara na terapiju pomoću IM i otporna je na IM. Bolesnici kod kojih terapija pomoću IM nema uspjeha ili koji više ne reagiraju na nju, moraju proći probir na mutacije kinaze ABL, kako bi se omogućila odgovarajuća promjena u terapiji. Uvođenje i upotreba druge generacije inhibitora tirozin-kinaze ovisi o točkastoj mutaciji otkrivenoj na genu ABL te se ne preporuča bolesnicima s mutiranim klonom T315I. Takvi bolesnici imaju mogućnost presađivanja koštane srži ili primjene kemoterapije (hidroksikarbamid, interferon-alfa ili citarabin).
Rezultati zabilježeni u ovom istraživanju potvrđuju da pridržavanje preporuka omogućuje optimalno liječenje bolesnika s CML.
 
Literatura
 
 1.   Hughes T, Deininger M, Hochhaus A, Branford S, Radich J, Kaeda J, et al. Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood 2006;108:28-37.
 2.   Goldman JM. How I treat chronic myeloid leukemia in the imatinib era. Blood 2007;110: 2828-37.
 3.   Kantarjian HM, Cortes J, Guilhot F, Hochhaus A, Baccarani M, Lokey L. Diagnosis and management of chronic myeloid leukemia: a survey of American and European practice patterns. Cancer 2007;109:1365-75.
 4.   Baccarani M, Saglio G, Goldman J, Hochhaus A, Simonsson B, Appelbaum F, et al. Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European Leukemia Net. Blood 2006;108:1809-20.
 5.   De Keersmaecker K, Cools J. Chronic myeloproliferative disorders: a tyrosine kinase tale. Leukemia 2006;20:200-5.
 6.   Gabert J, Beillard E, van der Velden VH, Bi W, Grimwade D, Pallisgaard N, et al. Standardization and quality control studies of ‘real-time’ quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia 2003;17:2318-57.
 7.   Branford S, Cross NC, Hochhaus A, Radich J, Saglio G, Kaeda J, et al. Rationale for the recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts in patients with chronic myeloid leukaemia. Leukemia 2006;20:1925-30.
 8.   Morley A. Quantifying leukemia. N Engl J Med 1998;339:627-9.
 9.   Cross NC. Minimal residual disease in chronic myeloid leukaemia. Hematol Cell Ther 1998;40:224-8.
10.   Hochhaus A, Druker B, Sawyers C, Guilhot F, Schiffer CA, Cortes J, et al. Favorable long-term follow-up results over 6 years for response, survival, and safety with imatinib mesylate therapy in chronic-phase chronic myeloid leukemia after failure of interferon-alpha treatment. Blood 2008;111:1039-43.
11.   Marušić Vrsalović M, Kušec R, Pejša V, Romić Ž. Comparison of sensitivity of nested PCR and quantitative PCR in Bcr-Abl p210 transcript detection in chronic myelogenous leukemia. Biochemia Medica 2007;17:109-15.