Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

S01-1

 Malenica B. S01-1: Imunodijagnostika paraneoplastičkog sindroma. Biochemia Medica 2009;19(Suppl1):S18.
 
Zavod za imunologiju i referentni centar za kliničko-laboratorijsku imunodijagnostiku imunoloških i hematoloških bolesti Ministarstva zdrastva RH i Kliničkog zavoda za laboratorijsku dijagnostiku Kliničkog bolničkog centra Zagreb, Zagreb
 
Adresa za dopisivanje: : b_malenica [at] yahoo [dot] com
 
Sažetak
Paraneoplastički neurološki sindromi (PNS) veoma rijetko se javljaju u bolesnika sa stanovitim zloćudnim tumorima, a nisu uzrokovani izravnim širenjem ili metastaziranjem tumora, popratnim infekcijama, krvnožilnim ili metaboličkim poremećajima, niti neurotoksičnošću standardnih vidova liječenja tumora, kao što su radioterapija i kemoterapija. Predmnijeva se da je imunosna reakcija važan čimbenik u patogenezi paraneoplastičkih sindroma. Naime, autoimunosnu reakciju potaknula bi ektopička ekspresija normalnih tkivnih neuronskih antigena u tumorskim stanicama, a efektorski mehanizmi te protutumorske imunoreakcije (stanični i humoralni) protiv takvih „onkoneuralnih“ antigena prouzročili bi oštećenja normalnog živčanog tkiva sa posljedičnom kliničkom simptomatologijom paraneoplastičkih sindroma u bolesnika sa stanovitim histološkim tipom zloćudnog tumora. Klinički simptomi mogu biti posljedica oštećenja središnjeg i perifernog živčanog sustava. Tehnikom serološkog pretraživanja ekspresijske knjižnice komplementarne DNA (cDNA) definirana su specifična antitijela protiv brojnih onkoneuralnih autoantigena. U laboratorijskoj imunodijagnostičkoj praksi ta se antitijela detektiraju indirektnom imunofluorescencijom (IIF) na tkivnim preparatima malog mozga, perifernog živca i fetalnog crijeva primata na kojima pokazuju karakteristični uzorak imunofluorescencije (pregledni test) i metodom Westernblota koja otkriva vezanje specifičnog antitijela za ciljni antigen (potvrdni test). Dobro okarakterizirana antitijela protiv onkoneuralnih antigena prepoznaju proteine u neuronskoj jezgri (anti-Hu-ANNA-1; anti-Ri-NOVA1, NOVA2-ANNA-2; anti-MA2) i proteine u neuronskoj citoplazmi (anti-Yo-CDR2-PCA-1; anti-Tr-PCA-Tr; anti-CV2-CRMP5; anti-amfifizin). Sva spomenuta anti-neuronska antitijela sastavni su dio dijagnostičkih kriterija na temelju kojih se postavlja „konačna“ ili samo „vjerojatna“ dijagnoza paraneoplastičkog sindroma u dotičnog bolesnika. Nalaz stanovitog antitijela, ili više njih istodobno, karakterizira određeni paraneoplastički sindrom i zloćudni tumor koji je najčešće s njim udružen.
 
 
S01-2
Kulić A1, Vrbanec D2. S01-2: Uloga autoantitijela u ranom otkrivanju karcinoma. Biochemia Medica 2009;19(Suppl1):S19.
 
1Zavod za patofiziologiju, Klinički bolnički centar Zagreb, Zagreb
2Klinika za onkologiju, Klinički bolnički centar Zagreb, Zagreb
 
Adresa za dopisivanje: ana [dot] kulic1 [at] zg [dot] t-com [dot] hr
 
Sažetak
Idealni tumorski marker bio bi onaj koji bi se mogao odrediti jednostavnim testom iz krvi, kojim bi se mogao otkriti rak i čija razina u krvi bi korelirala sa stadijem i napredovanjem maligne bolesti. Tijekom posljednjih trideset godina različiti proteini, hormoni i enzimi su se koristili kao tumorski markeri. Međutim, zbog nedostatne osjetljivosti i specifičnosti niti jedan od njih nije zadovoljio kriterije za idealni tumorski marker. Otkriće različitih protutijela u serumu bolesnika s tumorima otvorilo je nove mogućnosti u dijagnostici raka. Ta protutijela su nađena u krvi bolesnika s različitim vrstama tumora. Čimbenici koji mogu imati ulogu u patogenezi autoantitijela u bolesnika s rakom su slijedeći: imunosna reakcija domaćina na tumor-specifične antigene, destrukcija tumorske stanice zbog koje dolazi do otpuštanja antigena i poremećaji regulacije imunosnog sustava domaćina potaknuti neoplastičkim procesom. Regulacija i lokalizacija različitih proteina može biti različita u tumorskim stanicama u odnosu na normalne stanice. Tako su dva tipa enzima cAMP-ovisne protein kinaze A (PKA) u normalnim stanicama smješteni isključivo unutar stranice, dok maligne stanice PKA izlučuju u medij u kojem rastu. Taj secernirani oblik je nazvan ekstracelularna protein kinaza A (ECPKA) i povezan je s imunosnom reakcijom domaćina. Protutijela na ECPKA mogu se utvrditi korištenjem enzimskog imunotesta (EIA). Ta protutijela su utvrđena u različitim tumorima uključujući karcinome pluća, dojke i prostate. EIA metodom mjere se IgG protutijela na ECPKA. Ta metoda je pokazala 90% osjetljivost i 87% specifičnost, dok enzimski test kojim se određuje sama PKA pokazuje 83% osjetljivosti i 80% specifičnosti. Veća osjetljivost i specifičnost pokazana je i u istraživanjima autoantitijela protiv drugih tumorskih markera (VEGF, CA125, AFP) u odnosu na određivanje samih antigena. Pokazano je i da detekcija autoantitijela može biti korisna u razlikovanju povišene razine tumorskih markera u bolesnika s karcinomom u odnosu na povišenje uvjetovano upalom. Određivanje autoantitijela u serumu bolesnika može doprinijeti ranom otkrivanju maligne bolesti. Prednosti ovog pristupa u odnosu na dosadašnje je veća osjetljivost i specifičnost.
 
 
S01-3
Tešija Kuna A. S01-3: Novosti u serološkoj dijagnostici celijakije. Biochemia Medica 2009;19(Suppl1):S20.
 
Klinički zavod za kemiju, Klinička bolnica Sestre milosrdnice, Zagreb
 
Adresa za dopisivanje: andrea [dot] kuna [at] gmail [dot] com
 
Sažetak
Celijakija je kronična upalna autoimuna bolest koju u genetski predisponiranih osoba uzrokuje gluten (mješavina proteina prisutnih isključivo u žitaricama), uz djelovanje drugih okolišnih čimbenika. Bolest karakterizira atrofija resica sluznice tankog crijeva, povećanje broja intraepitelnih limfocita i hiperplazija kripti između resica. Uslijed izrazito raznolike kliničke prezentacije, koja varira od asimptomatske do klasičnog oblika sa simptomima teške malapsorpcije, celijakija je bolest koja često biva neprepoznata pa je stoga njezina prevalencija u općoj populaciji uvelike podcijenjena. Iako je serologija prijeko potreban segment u dijagnostičkoj evaluaciji celijakije, karakterističan histološki nalaz u bioptatu sluznice tankog crijeva još predstavlja zlatni standard za potvrdu dijagnoze. Razvojem novih testova i tehnologija unaprijeđeno je serološko testiranje pri sumnji na celijakiju. Danas je određivanje antitijela usmjerenih na nativni glijadin (AGA) izgubilo svoju ulogu u dijagnostici celijakije zbog nedovoljne osjetljivosti i specifičnosti. Nove preporuke za probirni panel na celijakiju uključuju mjerenje koncentracije ukupnog IgA (u svrhu isključivanja IgA deficita) te koncentracije IgA autoantitijela na tkivnu transglutaminazu (anti-tTG), testom u kojem se kao antigen koristi rekombinantni ili pročišćeni humani tTG. Iako se pokazalo da antiendomizijska autoantitijela (EMA) imaju malo veću specifičnost za celijakiju u odnosu na anti-tTG, interpretacija rezultata testa je subjektivna i stoga se sve češće zamjenjuje s anti-tTG testom. Oba testa imaju vrlo visoku negativnu prediktivnu vrijednost, a pozitivan rezultat identificira pacijente kojima se preporučuje biopsija tankog crijeva u svrhu potvrde celijakije. U slučaju dokazanog IgA deficita preporučuje se mjerenje anti-tTG IgG klase. Nedavno su opisana specifična antitijela usmjerena na glijadinske peptide deamidirane tkivnom transglutaminazom (DGP). Prema trenutnim saznanjima, anti-DGP test ima podjednaku osjetljivost i specifičnost za celijakiju kao i anti-tTG, a dijagnostički je najkorisniji ponajprije u slučaju negativnog ili graničnog rezultata anti-tTG uz izrazitu kliničku sumnju na celijakiju. S druge strane, anti-DGP antitijela pokazala su se boljim biljegom za kontrolu pridržavanja bezglutenske prehrane i oporavka crijevne sluznice u odnosu na anti-tTG.
 
 
S01-4
Salamunić I. S01-4: Laboratorijska dijagnostika autoimunih bolesti – nove tehnologije, stare dileme. Biochemia Medica 2009;19(Suppl1):S21-S22.
 
Odjel za medicinsku laboratorijsku dijagnostiku, Klinički bolnički centar Split, Split
 
Adresa za dopisivanje: ilza [dot] salamunic [at] gmail [dot] com
 
Sažetak
Autoimune bolesti posljedica su imunološke reakcije protiv vlastitih antigena. Karakterizira ih pojava specifičnih autoantitijela. Dijagnoza se postavlja na temelju kliničkih simptoma i detektiranjem specifičnih autoantitijela.
U rutinskom radu imunološkog laboratorija koriste se brojne tehnike i metode za dokazivanje ponajprije autoantitijela, a rjeđe antigena. Konvencionalne metode u detekciji autoantitijela javljaju se 1957. godine, te su od tada razvijane brojne tehnike i metode koje se primjenjuju u kliničkoj i laboratorijskoj praksi. Imunokemijske metode kao indirektna imunofluorescencija (IIF), pasivna aglutinacija (PA), imunodifuzija (ID), imunoprecipitacija (IPA) i imunoblot (IB) daju kvalitativne rezultate, a imunometrijske metode kao radioimunološka (RIA), enzimskoimunokemijska (EIA), fluoroimunokemijska (FIA) i kemiluminiscentna imunoanaliza (CLIA) daju kvantitativne rezultate za određeno autoantitijelo. U detekciji antinuklearnih antitijela (ANA), najčešće prvoj pretrazi u dijagnostici autoimunih bolesti, kao metoda probira se koristi IIF na supstratu stanične kulture HEp-2 stanica. IIF je osjetljiva i specifična, ali nedovoljno reproducibilna metoda. EIA za dokazivanje ANA koristi antigene pripremljene iz HEp-2 stanica je automatizirana, reproducibilna i donekle standardizirana. Međutim, u kliničkoj evaluaciji dobro definiranih pacijenata sa sklerodermom analiza ANA HEp-2 EIA testom daje manje pozitivnih rezultata u odnosu na ANA IIF. Za točno određivanje pojedinačnog autoantitijela važno je prepoznavanje kliničkih simptoma i poznavanje biokemijskih karakteristika ciljnog antigena, kako bi se izabrao odgovarajući test. Mnoge studije ukazuju na značajnu analitičku varijabilnost standardiziranih testova različitih proizvođača. Ovakvi rezultati ukazuju na potrebu standardizacije procesa analize te primjenu neovisnoga ili internacionalnog standarda.
Nova, multipleks-tehnologija, koja se koristi u detekciji autoantitijela, omogućuje spajanje višestrukih testova i istovremeno mjerenje više analita u jednom uzorku. No, brojni podaci o usporedivosti metode s IIF ili EIA ukazuju na postojanje lažno pozitivnih ili lažno negativnih rezultata.
Rezultati različitih laboratorija ili kliničkih studija često nisu usporedivi što slabi značaj medicine temeljene na dokazima (engl. evidence-based medicine, EBM).
Primjena tehnologija proteomike kao nove mogućnosti možda će izazvati preokret u pristupu i kliničkoj i laboratorijskoj dijagnostici autoimunih bolesti.
Standardizacija u detekciji autoantitijela bilo „starih“ ili „novih“ metoda i tehnologija je neophodna zbog postavljanja ispravnih dijagnoza i liječenja autoimunih bolesti. Zbog toga se mnoge institucije bave problemom standardizacije. Među njima je i Odbor za standardizaciju autoantitijela (engl. The Autoantibody Standardisation Committe, ASC) koji je još osamdesetih godina prošloga stoljeća uočio potrebu za referentnim serumom humanoga porijekla u standardizaciji. Prije nekoliko godina osnovana grupa Europske inicijative za standardizaciju u dijagnostici autoimunih bolesti (engl. The European Autoimmunity Standardisation Initiative, EASI) ima za cilj potaknuti interakciju laboratorija i kliničke prakse, harmonizirati detekciju autoantitjela te doprinijeti konceptu standardizacije i dijagnostičke strategije u području dijagnostike autoimunih bolesti.
 
 
S01-5
Matišić D. S01-5: Nova strategija u dijagnostici monoklonskih gamapatija. Biochemia Medica 2009;19(Suppl1):S22-S23.
 
Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku Medicinskoga fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, Klinički bolnički centar Zagreb, Zagreb
 
Adresa za dopisivanje: : dmatisic [at] kbc-zagreb [dot] hr
 
Sažetak
Monoklonske gamapatije (MG) spadaju u skupinu imunoproliferativnih bolesti koje karakterizira prisutnost monoklonskih komponenti u serumu i/ili mokraći koje stvara klon B-stanica podvrgnut genetičkoj transformaciji. Takvo stanje može biti posljedica benigne ili maligne bolesti koja se onda manifestira kliničkim simptomima od asimptomatskoga neprogresivnog stadija do malignog agresivnog multiplog mijeloma ili limfoma.
Laboratorijska dijagnostika MG obuhvaća određivanje ukupnih proteina u serumu, elektroforezu serumskih proteina (SPE), imunoglobulina G, A i M (IgG, IgA, IgM), definiranje razreda i tipa eventualno prisutnoga monoklonskog imunoglobulina (M Ig), beta-2-mikroglobulina, kreatinina i kalcija u serumu, te potvrđivanje monoklonskih slobodnih lakih lanaca (BJP) imunofiksacijom (IF) u serumu i 24-satnoj mokraći.
Razvoj reagensa Free Light Chain omogućio je rutinsko kvantitativno određivanje BJP tipa kapa i lambda te povećao kliničku važnost BJP.
Serumska koncentracija BJP korelira samo s aktivnošću koštane srži, što znači da njihov nalaz može biti neovisan biljeg MG. Jedan posebno važan aspekt BJP je njihov kratak poluživot: 2-3 sata za kapu i 5-6 sati za lambdu, što je 150 puta kraće vrijeme od 21 dana koliko je, primjerice, poluživot IgG. Tako koncentracija BJP omogućuje vrlo brzu procjenu učinka kemoterapije: 92-128 dana brže nego koncentracija M Ig.
Koncentracija BJP ovisi o stvaranju plazma-stanica, ali isto tako i o bubrežnom klirensu. Uz poliklonsku sintezu imunoglobulina i/ili bubrežnog oštećenja, naći ćemo 10-20 puta povećanu koncentraciju BJP u serumu. Bubrežno izlučivanje BJP raste s koncentracijom u serumu, ali značajno opada kada je visoka koncentracija kombinirana s bubrežnim oštećenjem.
Katzmann JA. i Hill PG. pokazali su na velikom broju bolesnika, u dvije odvojene studije, da zbog oštećenja bubrega u približno 25% bolesnika s MG možemo naći lažno pozitivne nalaze BJP u serumu, odnosno lažno negativne u mokraći.
Odlaganje BJP je izravno odgovorno za patološke procese tubulointersticijskog oštećenja. Nakon filtracije, BJP se vežu na heteromerične receptore koji se sastoje od kubilina i megalina i time injiciraju reapsorpciju u proksimalne tubule. Poslije endocitoze i hidrolize BJP se vraćaju kao aminokiseline u cirkulaciju. BJP su otrovni zbog potencijalnih interakcija sa svim dijelovima nefrona. Nefrotoksični potencijal BJP ovisan je o njihovom fizikalno-kemijskom sastavu kao i utjecaju okoliša u kojem se nalaze.
Skupljanje 24-satne mokraće je mukotrpno za bolesnike i uglavnom netočno. Laboratorijski postupak evaluacije monoklonskog proteina znatno se produljuje zbog obrade 24-satne mokraće. Stoga mnogi kliničari predlažu da se obrada 24-satne mokraće ukloni iz postupnika za definiranje M Ig. Mokraća će se obrađivati diskontinuirano, tj. kod raznih disproteinemija kao i za praćenje bolesti jednom kad je monoklonski protein već identificiran.
Primjenjujući program određivanja ukupnih proteina u serumu, SPE, kvantitativnog određivanja BJP tipa kapa i lambda u serumu kao i njihovog omjera eliminiramo potrebu prikupljanja 24-satne mokraće, što znatno skraćuje proces definiranja monoklonskih komponenti.
 
 
S01-6
Dodig S. S01-6: Interferencije svojstvene imunokemijskim metodama. Biochemia Medica 2009;19(Suppl1):S24-S253.
 
Dječja bolnica Srebrnjak, Referentni centar Ministarstva zdravstva za kliničku alergologiju djece, Zagreb
 
Adresa za dopisivanje:slavica.dodig@zg.t-com.hr
 
Sažetak
Osnovno svojstvo svih imunokemijskih metoda – od imunoprecipitacijskih do biočip metoda – jest da reagens, kojim se otkriva ili kvantitativno određuje ciljni analit (antigen), sadrži antitijelo. Iako je nekovalentna veza između analita i antitijela specifična, moguće su brojne interferencije, bilo lažno povećane bilo lažno smanjene. Interferencije u imunokemijskim metodama mogu se otkriti: A. u tijeku razvoja/evaluacije metode i B. u svakodnevnom radu. Ove potonje su: 1. križna reaktivnost s endogenim i egzogenim substancijama koje nemaju strukturu antitijela, 2. križna reaktivnost s endogenim i egzogenim substancijama koje imaju strukturu antitijela, 3. prozonski učinak i 4. utjecaj matriksa.
1. Križna reaktivnost s endogenim i egzogenim substanijama koje nemaju strukturu antitijela: Križna je reaktivnost (najčešća interferencija u kompetitivnim metodama) podrazumijeva nespecifičan utjecaj tvari u uzorku koja je strukturalno slična analitu te kompetira za vezno mjesto na antitijelu. Stupanj interferencije ovisi o tri čimbenika: specifičnosti antitijela, obliku testa i pripremi uzorka. Najčešći su primjeri pri određivanju koncentracije hormona, lijekova odnosno alergen-specifičnih IgE.
2. Križna reaktivnost s endogenim i egzogenim substancijama koje imaju strukturu antitijela: Na imunokemijsku reakciju mogu utjecati antitijela prisutna u biološkim uzorcima ili antitijela prisutna u reagensu. Biološki uzorci mogu sadržavati egzogena (primjerice biološki lijekovi) i endogena antitijela (primjerice heterofilna antitijela, tj. prirodna antitijela i autoantitijela te anti-animalnaantitijela-HAAAs). Endogena antitijela prisutna su uoko 40% bolesnika, osobito onih koji su dobivali imunoterapiju s monoklonalnim antitijelima.
3. Prozonski učinak: Prozonski učinak (engl. hookeffect) temelji se na krivulji zasićenjaa ntitijela s antigenom. Primarno prozonski učinak ovisi o koncentraciji analita. Podrazumijeva postojanje njegova izrazitog suviška, koji zasiti sva vezna mjesta na protutijelu, a nastaje uglavnom u metodama kod kojih se sve antigen, antitijelo i biljeg inkubiraju istodobno (engl. singlestepassay). Prozonski učinak ne postoji kod kompetitivnih imunokemijskih analiza.
4. Utjecaj matriksa: Svaka komponenta, kao sastavni dio imunokemijske analize (biološki uzorak, pufer, protutijelo, pomoćne tvari), sadržana u imunokemijskoj analizi ima svoj matriks. Sve te komponente, bilo iz biološkog uzorka (lipidi, proteini, ugljikohidrati, sol, voda) ili egzogenih izvora mogu utjecati na ciljni analit čija se koncentracija određuje. Endogene sastavnice uzrokuju interindividualnu i intraindividualnu varijabilnost rezultata. Komponent ematriksa imaju mali afinitet vezanja za analit ili antitijelo - obično maskiraju analit ili antitijelo, zbog čega izostaje reakcija vezanja analita s antitijelom.
U budućnosti će se interferencije povećavati u nekim područjima (primjerice kod primjene bioloških lijekova), a u nekim će se područjima smanjivati. Ipak, problemi interferencija u imunokemijskim analizama će biti trajan problem. Stoga stručnjaci laboratorijske medicine, liječnici i stručnjaci koji razvijaju imunokemijske postupke moraju biti svjesni tih problema i smanjivati interferencije na najmanju moguću mjeru.