Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Izvorni znanstveni članak

Márk Plander1,2, Antal Salamon3, Erzsébet Toldy1,4, Gyula Kiss3, Gábor L. Kovács4,5. Stanično imunosni odgovor u Dupuytrenovoj bolesti. Biochemia Medica 2008;18(2):193-200.

1Središnji laboratorij, Sveučilišna bolnica „Markusovszky”, Szombathely, Mađarska

2Klinika za hematologiju, Sveučilišna bolnica „Markusovszky”, Szombathely, Mađarska

3Klinika za traumatologiju i rekonstruktivnu kirurgiju ruku, Sveučilišna bolnica „Markusovszky”, Szombathely, Mađarska

4Institut za dijagnostiku i management, Sveučilište u Pečuhu, Pečuh, Mađarska

5Institut za laboratorijsku medicinu, Sveučilište u Pečuhu, Pečuh, Mađarska

 

*Adreasa za dopisivanje: gabor [dot] l [dot] kovacs [at] aok [dot] pte [dot] hu

 

Sažetak

Uvod: Patogeneza Dupuytrenove bolesti je nejasna, no mogu se pretpostaviti upalni mehanizmi u njenoj pozadini.

Materijali i metode: Mjerili smo udjele različitih podvrsta monocita i limfocita u perifernoj krvi prema stadiju bolesti kod 39 bolesnika oboljelih od Dupuytrenove bolesti. Rezultate smo usporedili s rezultatima 29 zdravih kontrolnih ispitanika iz iste dobne skupine. Mjerenja su napravljena pomoću protočne citometrije.

Rezultati: U aktivnom su stadiju bolesnici imali bitno povišen udio monocita, NK-stanica sličnih T-limfocitima, dok je udio B-limfocita bio značajno snižen, uključujući CD5+ B-limfocite. Udjeli CD4+, CD8+ T-limfocita i B-limfocita nisu se znatno promijenili. U naprednom su stadiju bolesti udjeli monocita i B-limfocita ostali konstantnima, no značajno su se snizili udjeli T-limfocita. U četiri slučaja među bolesnicima koji boluju od Dupuytrenove bolesti pojavile su se limfoidne neoplazme zrelih B- ili T-limfocita.

Zaključci: Naši rezultati podupiru prijašnja mišljenja da su limfociti povezani s patogenezom Dupuytrenove bolesti te pojačavaju ulogu monocita, NK-stanica sličnih T-limfocitima i promjenu imunosnog odgovora između stadija bolesti.

Ključne riječi: Dupuytrenova bolest, aktivni i uznapredovali stadij, monociti, NK T-limfociti

Pristiglo: 27. prosinca 2007.                                                                                                                                    Prihvaćeno: 18. travnja 2008.

 

 

Uvod

Dupuytrenova bolest (engl. Dupuytren’s disease) kronični je poremećaj, koji karakterizira razvijanje kvržica i čvorića na dlanu šake i/ili tabanu stopala. Te patološke promjene nastaju zbog fibroznih procesa, no točan mehanizam nastanka skvrčenosti još je nejasan. Chiu i McFarlane (1) opisali su klinički i patološki tri stadija bolesti: rani, aktivni i uznapredovali stadij.

Prijašnja su izvješća upućivala da bi upalni mehanizmi mogli biti povezani s patogenezom Dupuytrenove bolesti. Mnogi su autori izvijestili o kvržicama koje su sadržavale upalne stanice; uglavnom limfocite i makrofage (2). Također je biopsijom uočen povećan broj aktiviranih (HLA-DR+) T-limfocita u tkivima (3). Pronađen je i povišen udio aktiviranih T-limfocita u perifernoj krvi bolesnika s Dupuytrenovom bolesti (4). Potvrđena je i uloga citokina koje stvaraju T-limfociti. Transformacijski faktor rasta-β (engl. Transforming Growth Factor-β, TGFβ) izaziva transformaciju fibroblasta u miofibroblaste koji su odgovorni za skvrčavanje aponeuroze (2). Pronađena je bitna veza između Dupuytrenove bolesti, HLA-DR3 te autoantitijela i kolagena tipa I-IV (5).

Naš je cilj bio istražiti ulogu upalnih mehanizama u patogenezi Dupuytrenove bolesti i produbiti saznanja o raspodjeli podvrsta monocita i limfocita sukladno stadiju Dupuytrenove bolesti.

 

Materijali i metode

Bolesnici

U ovo je istraživanje bilo uključeno ukupno 39 odraslih muških bolesnika s Dupuyternovom bolesti raspona godina od 45 do 69 (57 ± 12) i skupina od 29 zdravih muških dobrovoljaca odgovarajuće dobne skupine. Iz istraživanja su isključeni oni bolesnici koji su imali bilo kakvo upalno oboljenje ili neku drugu bolest unutarnjih organa, kao npr. autoimune bolesti, šećernu bolest, cirozu jetre, epilepsiju, poznate zloćudne bolesti. Bolesnici su bili klasificirani prema Chiu i McFarlanovoj kliničkoj i patološkoj podjeli na rani, aktivni i uznapredovali stadiji (1). 23 bolesnika iz skupine s Dupuytrenovom bolesti bili su u aktivnom stadiju (stadij 2) s kvržičastim zadebljanjem na dlanu i zgrčenosti zgloba. Šesnaest je bolesnika bilo u uznapredovalom stadiju (stadij 3) s uznapredovalom zgrčenosti zgloba. Nije primijećeno da je i jedan bolesnik u ranom stadiju imao kvržicu isključivo na dlanu (stadij 1). U 36 slučajeva radilo se samo o jednoj ruci. Kod tri su bolesnika obje ruke bile zahvaćene. Lezije (oštećenja) su se uglavnom nalazile u korijenu četvrtog i petog prsta. Bolesnici su odabrani iz traumatološke ambulante bolnice Markusovszky u Szombathelyu. Uzorkovanje je trajalo 2 godine, do 2007. Istraživanje je provedeno sukladno Helsinškoj deklaraciji, a za protokol istraživanja dobiveno je odobrenje lokalnog etičkog odbora. Svi su bolesnici potpisali informirani pristanak za sudjelovanje u istraživanju.

Imunofenotipizacija

Uzorci periferne krvi stavljeni su u EDTA epruvete i obojeni u roku od 24 sata. Do početka bojenja uzorci su bili čuvani na temperaturi +4 °C. Dnevno je bila napravljena kalibracije fluorescentnih mjerenja pri čemu su se koristile standardizirane površinski fluorescentno označene mikrosfere (FITC/PE). Standardizacija stanične imunofluorescencije zasniva se na kontrolama različitih izotipova. Stanice su prvo prebrojane i nakon toga razrijeđene u PBS puferu na koncentraciju od otprilike 107/mL. Monoklonska antitijela konjugirana s fluorescentnim izotiocijanatom (FITC) ili fikoeritrinom (PE) dodana su u preporučenom volumenu prema uputi proizvođača. Specifičnost i kombinacije primjenjenih monoklonalnih antitijela bile su sljedeće: CD45/CD14, IgG1/IgG2 – kontrole različitih izotipova; CD3/CD19, CD3/CD16+56, CD3/CD4, CD3/CD8, CD5/CD20, CD3/HLA-DR, Kappa LC/CD19, Lambda LC/CD19. Svi su reagensi bili od proizvođača BD Bioscience (San Jose, CA, USA). 100 µL otopine razrijeđenih stanica dodana je prethodno pipetiranim antitijelima i stavljena na 15 minuta u inkubaciju na tamno mjesto na -20 °C. Zatim su eritrociti lizirani na sobnoj temperaturi. Rezultati fluorescencije dobiveni su FACSscan protočnom citometrijom, a analizirani su CellQuestovim programom (BD Bioscience). Od svakog je uzorka prikupljeno 10.000 podataka. Primjeri korištene strategije protočne citometrije prikazani su na Slici 1. Kako bi se analizirale limfocitne subpopulacije, limfociti (prikazani crnom bojom) su razvrstani na osnovi prednjeg (FSC) i bočnog (SSC) raspršenja zrake (Slika 1A). Citotoksični T-limfociti razlikovali su se prema koekspresiji CD3 i CD8 antigena (Slika 1B), dok su se pomoćnički T-limfociti razlikovali prema koekspresiji CD3 i CD4 antigena (slika 1C). NK-stanice (eng. natural killer cells, NK) izražavaju CD16 i CD56 antigene za razliku od CD3, NK T-limfociti CD3 i CD56 dvostruko su pozitivni (slika 1D). B-limfociti nose CD20 antigen i djelomično CD5 antigen (slika 1E).

 

 

Slika 1. Postupak odabira stanica. Limfociti su razvrstani na osnovi prednjeg (FSC) i bočnog (SSC) raspršenja zrake (Slika 1A). Citotoksični T-limfociti CD3 i CD8 dvostruko su pozitivni (gornji desni kvadrant, Slika 1B). Pomoćnički T-limfociti izražavaju zajedno CD3 i CD4 (gornji desni kvadrant, Slika 1C). NK-stanice nose antigene CD56 i CD16 (gornji lijevi kvadrant, Slika 1D), NK T-limfociti su pozitivni na CD3 i CD56 antigene (gornji desni kvadrant, Slika 1D). B-limfociti izražavaju CD20 i B1 populaciju, dakle antigen CD5 (gornji desni kvadrant, Slika 1E).

 

Statistička analiza

Rezultati su izraženi u postotku od ukupnog broja leukocita i u izračunatom apsolutnom broju stanica. Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna pogreška (engl. standard error, SE). Za statističku je analizu korištena jednosmjerna analiza varijance (ANOVA) nakon koje je uslijedio post hoc parni test usporedbe (LSD). Razina vjerojatnosti od < 5 % prihvaćena je kao značajna. Za sve je statističke analize korišten programski paket Statistica za Windows, s intervalom pouzdanosti od 95%.

 

Rezultati

Kod 4 bolesnika iz skupine s Dupuytrenovom bolesti su restrikcijom lakog lanca imunoglobulina i/ili patološkim imunofenotipom dokazane su zrele limfoidne neoplazme u tihom obliku, kao npr. kronična limfocitna leukemija B-stanica (engl. B-cell chronic lymphocytic leukaemia, CLL) i leukemija granuliranih T-limfocita (T-LGL), dok kod ispitanika iz zdrave skupine nije pronađena takva bolest. Limfomi su se nalazili u ranom stadiju bez ikakvih kliničkih znakova.

Ovi su hematološki slučajevi isključeni iz daljnje analize. Statistička razlika među ispitanika kontrolne skupine (N = 29), bolesnika koji boluju od Dupuytrenove bolesti stadija 2 (N = 21) i stadija 3 (N = 14) prikazana je u Tablicama 1 i 2.

 

Tablica 1. Usporedba broja monocita, B-limfocita i NK-stanica između kontrolne skupine i bolesnika s Dupuytrenovom bolesti.

 

Tablica 2. Usporedba broja T-limfocita između kontrolne skupine i bolesnika s Dupuytrenovom bolesti.

 

U oba stadija Dupuytrenove bolesti udio monocita znatno se povisio u usporedbi s kontrolnom skupinom (5,75 ± 0,21 prema 7,49 ± 0,35, P = 0,002 za skupinu s Dupuytrenovom bolesti, i 8,08 ± 0,78, P < 0,001 za kontrolnu skupinu) i ostao gotovo nepromijenjen u naprednom stadiju (Tablica 1). Udio NK T-limfocita također je znatno porasao u stadiju 2 (0,66 ± 0,09 prema 1,07 ± 0,16, P = 0,021), i zatim se snizio u stadiju 3 (0,47 ± 0,1 prema 1,06 ± 0,16, P = 0,012) (Tablica 2.). Tablica 1 prikazuje znatno sniženje udjela B-limfocita (2,88 ± 0,16 prema 2,13 ± 0,21, P = 0,013) uključujući i B1 (koekspresiju CD 20+5+) populaciju (1,44 ± 0,14 prema 0,57 ± 0,09, P = 0,009) kod bolesnika s Dupuytrenovom bolesti u usporedbi sa kontrolnom skupinom. Udio B-limfocita nije se promijenio tijekom bolesti. Nije primijećeno statistički značajno povišenje udjela T-limfocita uključujući populacije pomoćničkih (CD4+) i citotoksičnih (CD8+) između bolesnika s Dupuytrenovom bolesti stadija 2 i zdravih kontrolnih ispitanika (Tablica 2). Udio CD4+/CD8+ T-limfocita snizio se u aktivnom stadiju (Tablica 2). Međutim postotak čitave populacije T-limfocita i populacije pomoćničkih T-limfocita razlikovao se značajno između stadija 2 i 3 kod bolesnika s Dupuytrenovom bolesti (19,02 ± 0,82 prema 15,9 ± 1,38, P = 0,043 za stadij 2 i 13,04 ± 0,85 prema 10,27 ± 1,09, P = 0,023, za stadij 3) (Tablica 2). Udjeli citotoksičnih i aktiviranih (HLA-DR+) T-limfocita i NK-stanica slijedili su promjene u populaciji pomoćničkih T-limfocita, i iako se niti jedan od tih udjela nije znatno promijenio, povećanje HLA-DR+T-limfocita pokazuje jaku tendenciju (P = 0,07) među bolesnicima oba stadija Dupuytrenove bolesti (Tablica 1 i 2).

 

Rasprava

Promatrali smo različite i karakteristične promjene u broju limfocita i monocita u perifernoj krvi sukladno kliničkim stadijima Dupuytrenove bolesti. U aktivnom se stadiju udio monocita i NK T-limfocita značajno povisio. Slično se povisio i udio CD4+, CD8+, aktiviranih T-limfocita i NK-stanica, no te promjene nisu bile značajne. Ovi nalazi potvrđuju prethodna mišljenja da su T-limfociti povezani s patogenezom Dupuytrenove bolesti (3,4). Ovdje nismo istraživali monocite, NK T-limfocite niti stanično imunosni odgovor sukladno stadiju Dupuytrenove bolesti.

Prikazano je i značajno smanjenje udjela B-limfocita, uključujući tzv. B1-stanice (CD5+) što je djelomično povezano s rezultatima Gudmundssona i sur. (4). Oni su izvijestili o snižavanju udjela CD5+ B-limfocita. Naša prethodna zapažanja o prisustvu antinuklearnih antitijela odnose se također na ulogu B-limfocita u Dupuytrenovoj bolesti (6). Fibrozne bolesti, npr. plućna i jetrena fibroza, sistemska skleroza povezane su s protuupalnim T pomoćničkim 2 (TH2) staničnim odgovorom (7-10). TGFβ je jedan od najvažnijih citokina od TH2 posrednim imunosnim odgovorom. Značaj TGFβ u Dupuytrenovoj bolesti dokazali su mnogi autori (10-12). Makrofagi su jedan od glavnih izvora TGFβ i za TGFβ takvog porijekla vjeruje se da je profibrozan (13). Povišen broj monocita u Dupuytrenovoj bolesti može osigurati trajan dotok energije makrofagima u zahvaćenom tkivu.

NK T-limfociti mogu izlučiti tipične TH2 citokine, npr. IL-13 (14). Aktivacija TGFβ1 ovisi o metaloproteinazi matriksa 9 (MMP-9), pospješenoj s IL-13 koji cijepa peptide povezane s latencijom (15). U eksperimentalnim modelima autoimunih bolesti, NK T-limfociti su štitili od šećerne bolesti ili eksperimentalnog autoimunog encefalomijelitisa premještanjem ravnoteže s TH1 prema TH2 imunom odgovoru (16,17). Bolesnici koji boluju od drugih fibroznih bolesti (npr. sistemska skleroza) pokazuju promijenjenu homeostazu B-limfocita sličnu našim rezultatima (18).

U uznapredovalom su se stadiju udjeli CD4+ T-limfocita i NK T-limfocita snizili značajno, dok su se udjeli CD8+ i HLA-DR+ T-limfocita snizili, ali ne značajno. Udjeli monocita i B-limfocita ostali su konstantni u usporedbi s onima u aktivom stadiju. Tendencija snižavanja udjela T-limfocita navodi na razmatranje da je ona dio protuupalne reakcije koja može biti krajnji rezultat TH2 posredovanog imunosnog odgovora. Uzimajući sve u obzir, naši se podaci mogu odnositi na TH2 posredovani imunosni odgovor povezan s masivnom fibrozom u patogenezi Dupuytrenove bolesti. Međutim treba naglasiti da do sada nismo direktno istražili citokinski profil T-limfocita kod Dupuytrenove bolesti. Česta pojava zrelih limfoidnih neoplazmi u tihom obliku među našim bolesnicima s Dupuytrenovom bolesti može podržati hipotezu o autoimunoj pozadini Dupuytrenove bolesti, zato što različite autoimune bolesti, npr. autoimuna hemolitička anemija često kompliciraju CLL. Naravno da je potrebno napraviti velika istraživanja kako bi se opravdala veza između Dupuytrenove bolesti i hematoloških zloćudnih bolesti.

Zaključujemo da su monociti, T-limfociti (a posebno NK T-limfociti) i B-limfociti vjerojatno povezani s patogenezom Dupuytrenove bolesti, te da promijene u njihovom broju mogu ukazivati na upalni mehanizam u tijeku. Međutim, potrebno je dalje istražiti T-limfocite koji prodiru u aponeurozu, raspodijelu i profil citokina u T-limfocitima u perifernoj krvi kod bolesnika s Dupuytrenovom bolesti u ranom stadiju.

 

Zahvale

Uz dužno poštovanje zahvaljujemo Riti Jáger M.D. iz Mađarske banke krvi za kontrolne uzorke krvi i gđi J. Gál te gđi. M. Horváth za tehničku pomoć.

 

Literatura

1.    Chiu HF, McFarlane RM. Pathogenesis of Dupuytren’s contracture: A correlative clinical-pathological study. J Hand Surg 1978;3:1-10.

2.    Thurston AJ. Dupuytren’s disease. J Bone Joint Surg 2003;85:469-77.

3.    Baird KS, Alwan HW, Crossan JF, Wojciak B. T-cell mediated response in Dupuytren’s disease. Lancet 1993;341:1622-3.

4.    Gudmundsson KG, Arngrimsson R, Arinbjarnarson S, Olafsson A, Jonsson T. T- and B-lymphocyte subsets in patients with Dupuytren’s disease. J Hand Surg 1998; 23:724-7.

5.    Neumüller J, Menzel J, Millesi H. Prevalence of HLA-DR3 and autoantibodies to connective tissue components in Dupuytren’s contracture. Clin Immunol Immunpathol 1994;71:142-8.

6.    Salamon A, Józsa L, Toldy E. The role of different factors in the pathogenesis of Dupuytren’s disease. Proceedings of the 8th Congress of the IFSSH. 2001;363-9.

7.    Dlugovitzky D, Bay ML, Rateni L, Urízar L, Rondelli CF, Largacha C, et al. In vitro synthesis of interferon-gamma, interleukin-4, transforming growth factor-beta and interleukin-1 beta by peripheral blood mononuclear cells from tuberculosis patients: relationship with the severity of pulmonary involvement. Scand J Immunol 1999;49:210-7.

8.    Wallace WA, Ramage EA, Lamb D, Howie SE. A type 2 (Th2-like) pattern of immune response predominates in the pulmonary interstitium of patients with cryptogenic fibrosing alveolitis (CFA). Clin Exp Immunol 1995;101:436-41.

9.    Vaillant B, Chiaramonte MG, Cheever AW, Soloway PD, Wynn TA. Regulation of hepatic fibrosis and extracellular matrix genes by the TH response: new insight into the role of tissue inhibitors of matrix metalloproteinases. J Immunol 2001;157:7017-26.

10.  Hasegawa M, Fujimoto M, Kikuchi K, Takehara K. Elevated serum levels of interleukin 4 (IL-4), IL-10 and IL-13 in patients with systemic sclerosis. J Rheumatol 1997;24:328-32.

11.  Bayat A, Stanley JK, Watson JS, Ferguson MW, Ollier WE. Genetic susceptibility to Dupuytren’s disease: transforming growth factor beta receptor (TGFbetaR) gene polymorphisms and Dupuytren’s disease. Br J Plast Surg 2003;56:328-33.

12.  Kloen P, Jennings CL, Gebhardt MC, Springfield DS, Mankin HJ. Transforming growth factor-beta: possible roles in Dupuytren’s contracture. J Hand Surg 1995;20:101-08.

13.  Wynn AT. Fibrotic disease and the TH1/TH2 paradigm. Nat Rev Immunol 2004; 4:583-94.

14.  Godfrey DI, Kronenberg M. Going both ways: immune regulation via CD1d-dependent NKT cells. J Clin Invest 2004;114:1379-88.

15.  Lee CG, Homer RJ, Zhu Z, Lanone S, Wang X, Koteliansky V, et al. Interleukin-13 induces tissue fibrosis by selectively stimulating and activating the transforming growth factor β1. J Exp Med 2001;194:809-21.

16.  Hong S, Wilson MT, Serizawa I, Wu L, Singh N, Naidenko OV, et al. Natural killer T-cell ligand alpha-galactosylceramide prevents autoimmune diabetes in non-obese diabetic mice. Nat Med 2001;7:1052-6.

17.  Jahng AW, Maricic I, Pedersen B, Burdin N, Naidenko O, Kronenberg M, et al. Activation of natural killer T cells potentiates or prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Exp Med 2001;194:1789-99.

18.  Fujimoto M, Sato S. B lymphocytes and systemic sclerosis. Curr Opin Rheumatol 2005;17:746-51.