Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Izvorni znanstveni članak:

Ayşe Binnur Erbağcı1*, Rukiye Deveci1, Ersin Akarsu2, Özlem Tiryaki2, Ş. Nur Aksoy1. Učinak intenzivne inzulinske terapije na koncentraciju dušikova oksida i aktivnost adenozin-deaminaze kod sekundarnog neuspjeha liječenja sulfonilurejom. Biochemia Medica 2009;19(2):166-76.
 
1Odjel za biokemiju i kliničku biokemiju, Medicinski fakultet, Sveučilište u Gaziantepu, Gaziantep, Turska
2Interna medicina, Medicinski fakultet, Sveučilište u Gaziantepu, Gaziantep, Turska
Corresponding author*: aerbagci [at] gantep [dot] edu [dot] tr
 
Sažetak
 
Uvod: Vjerojatno je da upala, oksidativni stres i apoptoza imaju ulogu u sekundarnom neuspjehu liječenja sulfonilurejom, koji se povezuje s propadanjem beta-stanica i njihovom smanjenom funkcijom. Dušikov oksid (NO) stimulira otpuštanje inzulina, ima proupalne, apoptotičke učinke te djeluje kao slobodni radikal. Adenozin-deaminaza (ADA) regulira koncentraciju adenozina, koja utječe na otpuštanje inzulina i glukagona te na periferni metabolizam glukoze. Cilj ovoga istraživanja bio je ispitati aktivnost ADA i koncentraciju NO kao potencijalne posrednike intenzivne inzulinske terapije kod bolesnika sa sekundarnim neuspjehom liječenja sulfonilurejom.
Materijali i metode: U istraživanje su bila uključena 24 bolesnika sa šećernom bolešću tipa 2 i sekundarnim neuspjehom liječenja sulfonilurejom. Koncentracije NO u serumu i aktivnosti ADA određene su u uzorcima krvi uzetim prije liječenja, nakon trodnevne inzulinske infuzije i nakon šestomjesečne višestruke supkutane primjene inzulina. Aktivnost ADA određena je metodom prema Giustiu. Koncentracija NO izmjerena je kolometrijskom metodom prema Griessu.
Rezultati: Kod sekundarnog neuspjeha liječenja sulfonilurejom, bazalna je aktivnost ADA (17,0 [14,6-21,7] U/L) bila statistički značajno niža nego aktivnost ADA izmjerena trećeg dana (20,5 [16,2-23,4] U/L; P = 0,018) i u šestom mjesecu (21,2 [16,6-22,5g U/L; P = 0,010). Između vrijednosti NO određenih na početku (18,8 [11,6-28,4] µmol/L), trećeg dana (17,8 [9,7-33,6] µmol/L; P = 0,966) i u šestom mjesecu (21,7 [16,0-33,9Ć]µmol/L; P = 0,230) nije bilo statistički značajne razlike.
Zaključak: Prema našem je istraživanju aktivnost ADA bila povećana u objema fazama, ranoj i kasnoj fazi intenzivne inzulinske terapije kod sekundarnog neuspjeha liječenja sulfonilurejom. O ulozi NO kod pogoršanja funkcije beta-stanica nismo puno saznali na razini perferne krvi.
Ključne riječi: adenozin-deaminaza; intenzivna inzulinska terapija; dušikov oksid; sekundarni neuspjeh liječenja sulfonilurejom
 
Pristiglo: 5. prosinca 2008.                                                                                                                                              
Prih
vaćeno: 17. ožujka 2009.                                                                                                       
 
Uvod
 
Sulfonilureja stimulira lučenje inzulina u beta-stanicama gušterače te je u pravilu lijek prvog izbora kod šećerne bolesti tipa 2. Međutim, nakon dugotrajnog liječenja sulfonilurejom neki bolesnici ne odgovaraju na liječenje, što je povezano s ponovnim povećanjem glukoze u krvi, tj. sekundarnim neuspjehom liječenja sulfonilurejom (1). Progresivno smanjenje količine beta-stanica, smanjenje sekretornih rezerva beta-stanica, inzulinska rezistencija i disfunkcija pretvorbe proinzulina su stanja povezana sa patogenezom sekundarnog neuspjeha liječenja sulfonilureje (1,2). Glavni čimbenici progresivnog gubitka funkcije i količine beta-stanica su glukotoksičnost, lipotoksičnost, proupalni citokini, reaktivni kisikovi spojevi i ubrzana apoptoza (3,4). Čini se da su poremećena funkcija beta-stanica i količina beta-stanica reverzibilni, naročito u ranijim fazama bolesti. Kratkotrajna intenzivna inzulinska terapija ubraja se među intervencije za očuvanje ili „pomlađivanje“ beta-stanica i poboljšanje osjetljivosti na inzulin (2).
Dušikov oksid (NO) je glasnik koji slobodno difundira kroz membrane te je uključen u mnoga fiziološka i patološka stanja. Interakcija NO sa superoksidom koja rezultira stvaranjem peroksinitrita (ONOO-) i inhibicija citokrom c oksidaze koja uzrokuje smanjenje potencijala membrane mitohondrija i oslobađanja citokroma c iz mitohondrija, smatraju se mehanizmima kojima NO izaziva apoptozu (5-7). Spominje se i utjecaj NO na lučenje inzulina ili na inzulinsku rezistenciju (8-12).
Adenozin-deaminaza (ADA; EC 3.5.4.4) katalizira nereverzibilnu hidrolitičku deaminaciju adenozina i deoksiadenozina kako bi izlučili inozin, odnosno deoksiinozin, kao dio puta recikliranja purinskih baza. Doprinosi regulaciji unutarstaničnih i izvanstaničnih koncentracija adenozina i deoksiadenozina zajedno s 5’ nukleotidazom i adenozin-kinazom (13). Iako je glavna funkcija ADA razvoj imunog sustava kod ljudi, čini se da je također povezana s diferencijacijom epitelnih stanica i monocita te s upalom (14). Sve je očitije da je adenozin pleotropna molekula uključena u upalni sustav, apoptozu, rast stanica i lučenje inzulina (14-16).
Cilj ovoga istraživanja bio je ispitati aktivnost ADA i koncentraciju NO kao potencijalnih posrednika intenzivnog inzulinskog liječenja kod bolesnika sa sekundarnim neuspjehom liječenja sulfonilurejom.
 
Materijali i metode
Ispitanici
Istraživanje je provedeno 2004. godine na Medicinskom fakultetu Sveučilišta Gaziantep, na Zavodu za biokemiju i kliničku biokemiju te na Klinici za unutarnje bolesti. Svi su ispitanici dali obaviješteni pristanak prema Helsinškoj deklaraciji revidiranoj 1996. U istraživanje je uključeno 48 uzastopnih ambulantnih bolesnika koji su 2004. s uputnicom došli na Kliniku za endokrinologiju i metabolizam s dijagnozom šećerne bolesti tipa 2 (prema rezultatima glukoze natašte i oralnog testa opterećenja glukozom koje preporuča Američka udruga za šećernu bolest) te sekundarnim neuspjehom liječenja sulfonilurejom. Sekundarni neuspjeh u liječenju sulfonilurejom definira se kao nedovoljna kontrola glikemije (HbA1c ≥ 7%) unatoč primanju maksimalne doze sulfonilureje (240 mg/dan gliklazida ili 6 mg/dan glimepirida) u trajanju od najmanje 4 tjedna, kod bolesnika koji su prethodno postigli zadovoljavajuću kontrolu glikemije sulfonilurejom u minimalnom trajanju od 6 mjeseci. Kriteriji za isključenje iz istraživanja bili su inzulinska terapija, neredovito uzimanje oralnih antidijabetika, uzimanje dijabetogenih lijekova poput glukokortikoida, diuretika i beta-blokatora, stanja povezana s medicinskim stresom, uzimanjem alkohola, trudnoća ili dojenje, primarni neuspjeh liječenja sulfonilurejom te neka dodatna sistemska bolest, npr. zatajenje bubrega, endokrini poremećaji. Bolesnici su praćeni 24 tjedna i 24 bolesnika su isključena iz istraživanja prema navedenim kriterijima. Istraživanje je tako provedeno na 17 žena i 7 muškaraca sa sekundarnim neuspjehom liječenja sulfonilurejom (min-max: 42-73; medijan: 56; interkvartilni raspon: 53-64 godina). Raspon trajanja šećerne bolesti kod ispitanika bio je 4-32 godine. Početno se koncentracija glukoze u plazmi kontrolirala tri dana inzulinskom infuzijom od 8,88 mmol/L. Nastavilo se višestrukim injekcijama inzulina kroz 6 mjeseci; bolesnici su dobivali redovite supkutane inzulinske injekcije tri puta na dan i jednu supkutanu injekciju NPH (engl. Neutral Protamine Hagedorn) - srednjedugodjelujućeg inzulina prije spavanja. Tijekom istraživanja bolesnici su nastavili sa svojim režimom prehrane i programom vježbanja. Praćenje ispitanika provodilo se ambulantnim kontrolnim pregledima dva puta u prvom mjesecu i jednom u slijedećih pet mjeseci.
Inzulinska rezistencija izračunala se pomoću procjene modela homeostaze (engl. homeostasis model assessment, HOMA-IR), koji su prvotno opisali Mathew i sur. (17). HOMA-IR se izračunala formulom:
HOMA-IR = glukoza natašte (mmol/L) × inzulin natašte (μmol/mL)/22,5.
Proteinurija je definirana kao koncentracija ukupnih proteina ≥ 0,15 g u uzorku 24-satne mokraće.
Metode
Venska krv uzorkovana je standardno u prijepodnevnim satima između 9.30 i 11.00 nakon 12-satnog gladovanja. Uzorci seruma su odmah odvojeni nakon desetominutnog centrifugiranja na 4 °C, 2000 g i pohranjeni na -20 °C do analize, što je načinjeno u jednoj seriji, kako bi se izbjegla analitička varijacija unutar serije.
Ukupna aktivnost ADA u serumu određena je na 37 °C prema metodi koju su opisali Giusti i Galanti, temeljenoj na reakciji po Bertholetu, odnosno nastanku obojenih kompleksa indofenola iz amonijaka oslobođenog iz adenozina, te je kvantificirana spektrofotometrijski (13). Optička je gustoća izmjerena spektrofotometrijski na 625 nm u reakcijskoj smjesi (konačan volumen 1 mL) koja je sadržavala 12 mM adenozin hemisulfata, 50 mM fosfatnog pufera (pH 6,5) i 0,05 mL seruma. Jedna jedinica ADA definirana je kao količina enzima potrebna za otpuštanje 1 µmol/min amonijaka iz adenozina u standardnim uvjetima testa. Preciznost testa za određivanje ADA unutar serije te iz dana u dan određena je iz poola seruma na 20 ponavljanja u jednoj seriji i 10 različitih serija, uz CV za preciznost unutar serije 2,53% i za preciznost iz dana u dan 3,37%.
Koncentracija dušikova oksida izmjerena je kolometrijskom metodom prema Griessu, a koncentracije NO2- i NO3- izmjerene su u serumu prema uputama proizvođača (pribor za kolometrijski test Nitrate/Nitrite, Cayman Chemical Co, Ann Arbor, MI, SAD). Proteini u mokraći su analizirani pomoću turbidimetrijske metode na analizatoru Roche/Hitachi modular P analyzer prema uputama proizvođača (U/CSF protein, Roche Diagnostics, Mannheim, Njemačka).
Statistička analiza
Podaci su izraženi kao medijan; interkvartilni raspon i srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Normalnost raspodjele ispitana je Kolmogorov-Smirnovljevim testom. Usporedbe uzastopnih mjerenja za neparametrijske podatake (NO, ADA, inzulin natašte, HOMA-IR, C-peptid, HbA1c, ukupni kolesterol, LDL kolesterol, trigliceridi) ispitane su Friedmanovim testom, a post hoc testiranje načinjeno je Wilcoxonovim testom sume rangova. Usporedbe uzastopnih mjerenja parametrijskih podataka (glukoza natašte) napravljene su jednosmjernom analizom varijance (engl. one-way ANOVA), a post hoc testiranje je načinjeno Tukeyevim post hoc testom. Dvostrana vrijednost P < 0,05 smatrala se statistički značajnom. Analize i ilustracije napravljene su statističkim programom SPSS 9.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, SAD).
 
Rezultati
 
Osnovne značajke ispitanika, tj. dob, spol, indeks tjelesne mase (engl. body mass index, BMI), srednja vrijednost trajanja šećerne bolesti, krvni tlak, prisutnost mikroproteinurije, sedimentacija eritrocita, ukupan broj leukocita i limfocita prikazane su u tablici 1.
 
Tablica 1. Osnovne značajke ispitanika (medijan; interkvartilni raspon)
 
 
Tablica 2. Metabolički parametri kontrole šećerne bolesti
 
 
Metaboličke promjene povezane s kontrolom šećerne bolesti sažete su u tablici 2. Vrijednosti glukoze natašte su se postupno i statistički značajno snizile tijekom intenzivne inzulinske terapije. Trećeg dana i u šestom mjesecu snizile su se vrijednosti inzulina natašte i HOMA-IR u usporedbi s početnim vrijednostima. Sniženje vrijednosti C-peptida postalo je očito na kontroli u šestom mjesecu. HbA1c i doza egzogeno davanog inzulina potrebnog za postizanje dobre kontrole značajno su se snizili. Nije zabilježena statistički značajna razlika za ukupni kolesterol i LDL kolesterol. Sniženje triglicerida u plazmi nije doseglo statistički značajnu razinu.
Kod sekundarnog neuspjeha liječenja sulfonilurejom bazalna je aktivnost ADA (medijan; interkvartilni raspon, 17,0 [14,6-21,7] U/L) bila statistički značajno niža, nego aktivnosti ADA izmjerene trećega dana (20,5 [16,2-23,4] U/L; P = 0,018) i nakon šest mjeseci (21,2 [16,6-22,5] U/L; P = 0,010) (tablica 3., slike 1. i 2).
Između koncentracija NO određenih na početku istraživanja (medijan; interkvartilni raspon, 18,8 [11,6-28,4] µmol/L), trećega dana (17,8 [9,7-33,6] µmol/L; P = 0,966) i u šestom mjesecu (21,7 [16,0-33,9] µmol/L; P = 0,230) intenzivne inzulinske terapije nije zabilježena statistički značajna razlika (tablica 3., slike 3. i 4.).
 
Tablica 3. Aktivnost adenozin deaminaze (ADA) i koncentracija dušikova oksida
 
 
 
Slika 1. Aktivnost adenozin deaminaze (ADA) u tri različita vremenska razdoblja.
 
 
Slika 2. Aktivnost adenozin deaminaze (ADA) u serumu bolesnika u tri različita vremenska razdoblja. Središnji pravokutnik predstavlja vrijednosti od niže do više kvartile (25. i 75. percentila). Središnja linija predstavlja medijan. Linija se širi od najniže do najviše vrijednosti isključujući ekstremne i atipične vrijednosti koje su označene odvojenim točkama. Atipična vrijednost (engl. outlier) definirana je kao vrijednost udaljena između 1,5 i 3 duljine pravokutnika, a ekstremna vrijednost kao vrijednost udaljena više od 3 duljine pravokutnika od gornje ili donje granice pravokutnika. Duljina pravokutnika je interkvartilni raspon.
 
 
Slika 3. Koncentracija dušikova oksida (NO) u pojedinačnih ispitanika u tri različita vremenska razdoblja.
 
 
Slika 4. Koncentracija dušikova oksida (NO) u serumu bolesnika u tri različita vremenska razdoblja. Središnji pravokutnik predstavlja vrijednosti od niže do više kvartile (25. i 75. percentila). Središnja linija predstavlja medijan. Linija se širi od najniže do najviše vrijednosti isključujući ekstremne i atipične vrijednosti koje su označene odvojenim točkama. Atipična vrijednost (engl. outlier) definirana je kao vrijednost udaljena između 1,5 i 3 duljine pravokutnika, a ekstremna vrijednost kao vrijednost udaljena više od 3 duljine pravokutnika od gornje ili donje granice pravokutnika. Duljina pravokutnika je interkvartilni raspon.
 
Rasprava
 
Usprkos velikom napretku u liječenju, kasne komplikacije šećerne bolesti još su uvijek glavni uzroci smrtnosti i pobola kod ovih bolesnika. Istraživanje kontrole i komplikacija šećerne bolesti (engl. The Diabetes Control and Complications Trial, DCCT) dokazalo je da se intenzivnom inzulinskom terapijom može postići stroga kontrola glikemije i rezultirajuće dugotrajne prednosti (18). Ova analiza potvrđuje prethodne podatke o poboljšanju kontrole glikemije intenzivnom inzulinskom terapijom kod sekundarnog neuspjeha liječenja sulfonilurejom, što podupiru i podaci o statistički značajnom sniženju koncentracije glukoze u krvi natašte, HbA1c, HOMA-IR, C-peptida te doze inzulina potrebne za održavanje dobre metaboličke kontrole. Stroga kontrola glukoze u krvi u istraživanju provedenom na kirurškom odjelu smanjila je pobol i smrtnost (19), dok je u drugom istraživanju na odjelu intenzivne njege, došlo do smanjenja pobola (20). Smanjile su se komplikacije kao što su teške upale i zatajenje organa. Nekoliko potencijalnih mehanizama moglo bi objasniti ove pozitivne učinke, kao što su smanjenje sistemske upale, prevencija disfunkcije imunosnog sustava, zaštita endotela i mitohondrijskih ultrastruktura (20-25). Međutim, jedno epidemiološko istraživanje ukazuje na to da je intenzivna terapija u usporedbi sa standardnom terapijom povećala smrtnost i nije značajno smanjila veće kardiovaskularne ispade (26).
ADA doprinosi regulaciji unutarstaničnih i izvanstaničnih koncentracija adenozina i deoksiadenozina zajedno s 5’ nukleotidazom i adenozin-kinazom te se povećana aktivnost ADA smatra znakom snižene koncentracije adenozina (13,27). Koncentracija adenozina je povišena na ozlijeđenim mjestima i mjestima zahvaćenim upalom te ima središnju ulogu u regulaciji upalnih odgovora i u smanjenju oštećenja tkiva zahvaćenog upalom (14). Adenozin modulira proliferaciju, preživljavanje i apoptozu različitih tipova stanica, od epitelnih, endotelnih i glatkomišićnih stanica do stanica imunog i neuralnog podrijetla (15). Naknadno je potvrđeno zaštitno djelovanje izvanstaničnog adenozina u staničnim i organskim sustavima uključujući mozak, bubrege, skeletne mišiće i masno tkivo. Prema našem istraživanju, aktivnost ADA porasla je i u ranoj i u kasnoj fazi intenzivne inzulinske terapije kod sekundarnog neuspjeha liječenja sulfonilurejom. Prema prijašnjim rezultatima pretpostavljamo da se povećana aktivnost ADA u ovom istraživanju može pripisati izostanku inicirajućeg medicinskog stresa, tj. oksidacijskog stresa, lokalne upale ili stanične smrti. Pretpostavljamo da se adenozin otpušta kao odgovor na široku lepezu podražaja koji dovode do ozljeda i posreduje u autoregulatornom mehanizmu uloga kojega je zaštititi organe. Newby i sur. su smislili naziv osvetnički metabolit (engl. retaliatory metabolite) kako bi opisali zaštitnu funkciju adenozina (14,28).
Učinci purinergičnih agonista na lučenje inzulina opisani u literaturi su proturječni. U jednom eksperimentalnom istraživanju u kojem su se rabile stanice INS-1, ali i Langerhansovi otočići gušterače štakora, adenozin je spriječio oslobađanje inzulina ovisno o koncentraciji. Inhibicijski učinak visoke koncentracije ATP pripisuje se njegovim razgradnim proizvodima, odnosno adenozinu, jer je ADA (1 U/mL) prekinula inhibicijski učinak ukazujući pritom na utjecaj adenozina (27). Nadalje, pokazalo se da adenozin može djelovati na površinu alfa-stanica endokrinog dijela gušterače, kako bi se pojačalo lučenje glukagona (16). Pretpostavlja se da adenozin utječe i na metabolizam glukoze. Adenozin pojačava glikogenolizu i otpuštanje glukoze iz jetre (29-31). Stoga pretpostavljamo da bi povećana aktivnost ADA zabilježena u ovoj studiji te popratno sniženje koncentracije adenozina moglo doprinijeti korisnosti intenzivne inzulinske terapije oslobađanjem kapaciteta lučenja inzulina iz beta-stanica, poboljšanjem lučenja glukagona i utjecajem na periferni metabolizam glukoze.
NO utječe na oslobađanje inzulina i inzulinsku rezistenciju, ima proupalno i apoptotičko djelovanje te djeluje kao slobodni radikal. Mehanizam djelovanja uključuje provođenje signala i direktne posttranslacijske modifikacije proteina preko reakcije sa slobodnim kisikovim radikalima i proteinima koji sadrže hem (5,32). Nakada i sur. su opisali dokaz dualnog učinka NO ovisnog o koncentraciji, tj. o stimulacijskom učinku kod niskih koncentracija i o inhibicijskom kod visokih koncentracija na lučenje inzulina (8). Pretpostavlja se da NO posreduje kod transporta glukoze stimuliranog vježbanjem u skeletne mišiće (9,10). Vanjskim unosom dušikovog oksida putem NO donatora (npr. natrijev nitroprusid), NO potiče prijenos glukoze u izoliranim skeletnim mišićima povećavajući koncentraciju GLUT4 na površini stanice (9-11). Dio mehanizma kojim inzulin povećava transport glukoze in vivo uključuje pojačani protok krvi i opskrbu mišića glukozom, proces kojim posreduje otpuštanje NO iz endotela (9,12). U ovom smo ispitivanju istražili sistemske koncentracije NO zbog njegove potencijalne uloge kod sekundarnog neuspjeha liječenja sulfonilurejom. Međutim, naše je istraživanje pokazalo da dobra kontrola glikemije postignuta intenzivnom inzulinskom terapijom kod sekundarnog neuspjeha liječenja sulfonilurejom nije imala utjecaja na sistemske koncentracije NO. Stoga se može zaključiti da podaci dobiveni našim istraživanjem ne podupiru ulogu NO u pogoršanju funkcije beta-stanica na razini sistemskih koncentracija NO.
Ovo je istraživanje imalo metodoloških ograničenja koja su mogla pridonijeti činjenici da nismo utvrdili ima li intenzivna inzulinska terapija utjecaja na koncentraciju NO. Izmjerili smo koncentracije NO u uzorcima plazme; daljnja istraživanja koja će obuhvaćati mehanizme na razini tkiva mogla bi pružiti uvid u točnu ulogu NO kod pojave sekundarnog neuspjeha liječenja sulfonilurejom. Drugo moguće ograničenje bila je mala skupina ispitanika. Potrebna je velika populacija ispitanika i sveobuhvatnija klinička procjena kako bi se razjasnilo jesu li ti rezultati dosljedni i klinički značajni. Mjerenje koncentracije adenozina moglo biti također pružiti vrijedne podatke.
Da zaključimo, ovo istraživanje pokazuje da je aktivnost ADA porasla u objema fazama primanja intenzivne inzulinske terapije kod sekundarnog neuspjeha u liječenju sulfonilurejom, u ranoj i u kasnijoj fazi. Utjecaj NO na intenzivnu inzulinsku terapiju kod sekundarnog neuspjeha u liječenju sulfonilurejom nije potvrđen ovim istraživanjem.
 
Literatura
 
1.     Chen YN, Chen SY, Zeng LJ, Ran JM, Xie B, Wu MY, Wu YZ. Secondary sulphonylurea failure: what pathogenesis is responsible? Br J Biomed Sci 2003;60:9-13.
2.     Rattarasarn C, Thamprasit A, Leelawattana R, Soonthornpun S, Setasuban W. The role of diminished beta cell reserve and insulin resistance in secondary sulfonylurea failure of type 2 diabetes mellitus. J Med Assoc Thai 2001;84:1754-62.
3.     Wajchenberg BL. β-Cell failure in diabetes and preservation by clinical treatment. Endocr Rev 2007;28:187-218.
4.     Fridlyand LE, Philipson LH. Does the glucose-dependent insulin secretion mechanism itself cause oxidative stress in pancreatic beta-cells? Diabetes 2004;53:1942-8.
5.     Lee VY, McClintock DS, Santore MT, Budinger GR, Chandel NS. Hypoxia sensitizes cells to nitric oxide-induced apoptosis. J Biol Chem 2002;277:16067-74.
6.     Borutaite V, Morkuniene R, Brown GC. Nitric oxide donors, nitrosothiols and mitochondrial respiration inhibitors induce caspase activation by different mechanisms. FEBS Lett 2000;467:155-9.
7.     Shen YH, Wang XL, Wilcken DE. Nitric oxide induces and inhibits apoptosis through different pathways. FEBS Lett 1998;433:125-31.
8.     Nakada S, Ishikawa T, Yamamoto Y, Kaneko Y, Nakayama K. Constitutive nitric oxide synthases in rat pancreatic islets: direct imaging of glucose-induced nitric oxide production in beta-cells. Pflugers Arch 2003;447:305-11.
9.     Higaki Y, Hirshman MF, Fujii N, Goodyear LJ. Nitric oxide increases glucose uptake through a mechanism that is distinct from the insulin and contraction pathways in rat skeletal muscle. Diabetes 2001;50:241-7.
10.   Balon TW, Nadler JL. Evidence that nitric oxide increases glucose transport in skeletal muscle. J Appl Physiol 1997;82:359-63.
11.   Etgen GJ Jr, Fryburg DA, Gibbs EM. Nitric oxide stimulates skeletal muscle glucose transport through a calcium/contraction- and phosphatidylinositol-3-kinase-independent pathway. Diabetes 1997;46:1915-9.
12.   Baron AD, Steinberg HO, Chaker H, Leaming R, Johnson A, Brechtel G. Insulin-mediated skeletal muscle vasodilation contributes to both insulin sensitivity and responsiveness in lean humans. J Clin Invest 1995;96:786-92.
13.   Giusti G, Galanti B. Colorimetric method. In: Bergmeyer HU, editor. Methods of enzymatic analysis. Weinheim: Verlag Chemie, 1984. pp. 315-23.
14.   Haskó G, Cronstein BN. Adenosine: an endogenous regulator of innate immunity. Trends Immunol 2004;25:33-9.
15.   Jacobson KA, Hoffmann C, Cattabeni F, Abbracchio MP. Adenosine-induced cell death: evidence for receptor-mediated signalling. Apoptosis 1999;4:197-211.
16.   Loubatieres-Mariani MM, Chapal J. Purinergic receptors involved in the stimulation of insulin and glucagon secretion. Diabet Metab 1988;14:119-26.
17.   Matthews DR, Hosker JP, Rudenski AS, Naylor BA, Treacher DF, Turner RC. Homeostasis model assessment: insulin resistance and beta-cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man. Diabetologia 1985;28:412-9.
18.   DCCT Trial Research Group. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med 1993;329:977-86.
19.   Van den Berghe G, Wouters PJ, Bouillon R, Weekers F, Verwaest C, Schetz M, et al. Outcome benefit of intensive insulin therapy in the critically ill: insulin dose versus glycemic control. Crit Care Med 2003;31:359-66.
20.   Van den Berghe G, Wilmer A, Hermans G, Meersseman W, Wouters PJ, Milants I, et al. Intensive insulin therapy in the medical ICU. N Engl J Med 2006;354:449-61.
21.   Weekers F, Giulietti AP, Michalaki M, Coopmans W, Van Herck E, Mathieu C, Van den Berghe G. Metabolic, endocrine, and immune effects of stress hyperglycemia in a rabbit model of prolonged critical illness. Endocrinology 2003;144:5329-38.
22.   Hansen TK, Thiel S, Wouters PJ, Christiansen JS, Van den Berghe G. Intensive insulin therapy exerts anti-inflammatory effects in critically ill patients and counteracts the adverse effect of low mannose-binding lectin levels. J Clin Endocrinol Metab 2003;88:1082-8.
23.   Van den Berghe G. How does blood glucose control with insulin save lives in intensive care? J Clin Invest 2004;114:1187-95.
24.   Langouche L, Vanhorebeek I, Vlasselaers D, Vander Perre S, Wouters PJ, Skogstrand K, et al. Intensive insulin therapy protects the endothelium of critically ill patients. J Clin Invest 2005;115:2277-86.
25.   Vanhorebeek I, De Vos R, Mesotten M, Wouters PJ, De Wolf-Peeters C, Van den Berghe G. Protection of hepatocyte mitochondrial ultrastructure and function by strict blood glucose control with insulin in critically ill patients. Lancet 2005;365:53-9.
26.   Gerstein HC, Miller ME, Byington RP, Goff DC Jr, Bigger JT, Buse JB, et al. Effects of intensive glucose lowering in type 2 diabetes. Action to Control Cardiovascular Risk in Diabetes Study Group. N Engl J Med 2008;358:2545-59.
27.   Verspohl EJ, Johannwille B, Waheed A, Neye H. Effect of purinergic agonists and antagonists on insulin secretion from INS-1 cells (insulinoma cell line) and rat pancreatic islets. Can J Physiol Pharmacol 2002;80:562-8.
28.   Newby AC. Adenosine and the concept of retaliatory metabolites. Trends Biochem Sci 1984;9:42-4.
29.   Töpfer M, Burbiel CE, Müller CE, Knittel J, Verspohl EJ. Modulation of insulin release by adenosine A(1) receptor agonists and antagonists in INS-1 cells: the possible contribution of (86)Rb(+) efflux and (45)Ca(2+) uptake. Cell Biochem Funct 2008;26:833-43.
30.   Buxton DB, Fisher RA, Robertson SM, Olson M. Stimulation of glycogenolysis and vasoconstriction by adenosine analogues in the perfused rat liver. Biochem J 1987;248:35-41.
31.   Mc Lane M, Black PR, Law WR, Raymond RM. Adenosine reversal of in vivo hepatic responsiveness to insulin. Diabetes 1990;39:62-9.
32.   Stamler JS. Redox signaling: nitrosylation and related target interactions of nitric oxide. Cell 1994;l 78:931-6.