Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Izvorni znanstveni članak

 

Jasminka Matica, Višnja Rački-Čargonja, Štefica Dvornik. Učinak trajanja šećerne bolesti tipa 1 na aktivnost N-acetil-β-D glukozaminidaze u mokraći djece i adolescenata. Biochemia Medica 2006;16(1):50-6.
KBC Rijeka, Zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Rijeka
Corresponding author: jasminka [dot] matica [at] ri [dot] t-com [dot] hr
 
Sažetak
 
Cilj: Cilj je bio ispitati ovisi li izlučivanje NAG u mokraći djece i adolescenata s šećernom bolesti tipa 1 o trajanju bolesti.
Metode: Katalitičke koncentracije N-acetil-b-D-glukozaminadaze određivale su se spektrofotometrijski u slučajnim uzorcima mokraće 66 djece i adolescenata s šećernom bolesti tipa 1 68 ispitanika iz kontrolne skupine. Bolesnici iz skupine dijabetičara bili su podijeljeni s obzirom na trajanje bolesti: skupina I manje od tri godine (N=17); skupina II tri do pet godina (N=19); skupina III pet do deset godina (N=19); skupina IV više od deset godina (N=11). Vrijednosti NAG izražene su u odnosu na koncentraciju kreatinina u mokraći radi isključivanja razlika u koncentraciji mokraće.
Rezultati: Izlučivanje NAG mokraćom kod dijabetičara bilo je statistički značajno povišeno u odnosu na kontrolnu skupinu. (p<0,001). U sve je četiri skupine dijabetičara statistički značajno bilo povećano izlučivanje NAG mokraćom u odnosu na kontrolnu skupinu (skupina I, p=0,001; skupine II i III, p<0,001 i skupina IV, p=0,004) no nije nađena statistički značajna razlika među skupinama dijabetičara (skupina I vs. II, p=0,716; skupina I vs. III, p=0,899; skupina I vs. IV, p>0,10; skupina II vs. III, p=0,549; skupina II vs. IV, p>0,10; skupina III vs. IV, p>0,10). Nije nađena korelacija između vrijednosti NAG u mokraći dijabetičara i trajanja bolesti (r=–0,017, p=0,892)
Zaključak: Izlučivanje NAG mokraćom povećano je kod djece i adolescenata s šećernom bolesti tipa 1, ali ne ovisi o trajanju bolesti.
Ključne riječi: N-acetil-b-D-glukozaminidaza, šećerna bolest tipa 1, dijabetička nefropatija
 
Pristiglo: 3. kolovoza 2005.                                                                                                         Prihvaćeno: 16. ožujka 2006.
 
Uvod
 
Bubrežno oštećenje je ozbiljna komplikacija u šećernoj bolesti. Ako je dijabetička nefropatija dijagnosticirana na temelju mikroalbuminurije, proteinurije ili sniženoga klirensa kreatinina, vrlo je malo moguće postići da bi se spriječilo zatajenje bubrega (1). Stoga postoji potreba za ranijim pokazateljima strukturnih i funkcionalnih promjena u bubregu koje bi bilo moguće spriječiti strogom glikemijskom kontrolom.
U nekoliko je studija ukazano da rana tubularna promjena nastala zbog peritubularne mikroangiopatije može prethoditi glomerularnim promjenama te imati važnu ulogu u pojavi dijabetičke nefropatije (2). Pojačano urinarno izlučivanje enzima koji potječu iz proksimalnih bubrežnih tubula utvrđeno je u bolesnika sa šećernom bolesti tipa 1 kao posljedica tubularne ozljede; ti enzimi su N-acetil-b-D-glukozaminidaza (NAG), alanin-aminopeptidaza, alkalna fosfataza, urinarna dipeptidil-aminopeptidaza IV (3). Aktivnost nekolicine od tih tubularnih biljega povišena je u mokraći i prije pojave mikroalbuminurije.
NAG (EC 3.2.1.30) je lizosomski enzim velike molekulske mase, široko rasprostranjen u mnogim tkivima i tjelesnim tekućinama. Mokraćna NAG je bubrežnoga podrijetla (5) jer ne može proći kroz glomerularnu membranu zbog svoje velike molekularne težine (130 000 do 140 000 D). Otpušta se iz stanica kao posljedica fiziološke egzocitoze (6) ili raspada stanica (7). NAG je raspodijeljen uzduž čitavog nefrona no uglavnom se nalazi u proksimalnim bubrežnim tubulima i možemo ju smatrati ranim neinvazivnim biljegom tubularnog oštećenja bubrega. Aktivnosti NAG u mokraći su povišene u pijelonefritisu (8), refluksnoj nefropatiji (9), hipertenziji (5) i reumatskom artritisu, kod izloženosti nefrotoksičnim lijekovima, zagađivačima okoline poput žive (10), kadmija (11), te kod radnika koji su tijekom rada izloženi trikloroetilenu (12). NAG može biti koristan parametar u bolesnika s tubulointersticijskim nefropatijama za razlikovanje akutnih od kroničnih poremećaja. Aktivnost NAG veća od 20 U/L (15 U/g kreatinina) može se mjeriti kod akutnoga oštećenja tubularnog sustava (13).
NAG u mokraći je rani pretkazatelj razvoja dijabetičke nefropatije; u šećernoj bolesti tipa 1 povišen je prije pojave mikroalbuminurije (14).
Schultz i sur. (15) su dokazali da su povišene aktivnosti NAG u mokraći ispitanika mlađih od 16 godina povezane s trajanjem šećerne bolesti tipa 1 i glikiranoga hemoglobina (HbA1c). Mocan i sur. (16) su ispitali 54 odrasle osobe sa šećernom bolesti tipa 2 i zapazili da aktivnost NAG počinje rasti tijekom treće godine bolesti, dostiže najvišu razinu između 3.–10. godine, te ubrzano raste nakon 10. godine.
Kavukçu (17) je dokazao da je aktivnost NAG u mokraći povezana s koncentracijom glukoze u krvi, a Kordonouri i sur. (18) su ustanovili da su oni ispitanici kod kojih je šećerna bolest nastupila u djetinjstvu imali značajno više aktivnosti NAG u mokraći u usporedbi s bolesnicima kod kojih je bolest nastupila nakon 16. godine života, te su češća oštećenja tubularne funkcije u mlađoj dobi pripisali neodgovarajućoj glikemijskoj kontroli u toj populaciji.
Cilj je ovog istraživanja bio ispitati postoji li razlika u aktivnosti NAG u mokraći između djece i adolescenata sa šećernom bolesti tipa 1 i zdravih ispitanika. Nadalje, željeli smo ispitati mijenja li se aktivnost NAG u mokraći u ovisnosti o trajanja bolesti.
 
Materijali i metode
Ispitanici
Istraživanje je uključivalo 66-ero djece i adolescenata sa šećernom bolesti tipa 10 praćenih tijekom tri godine u Dječjoj bolnici Kantrida, Rijeka. Ukupno je bilo 37 muških i 29 ženskih ispitanika s medijanom dobi 14,5 (3,5–25) godina. Kontrolnu je skupinu činilo 68 ispitanika (29 muških i 39 ženskih) bez bubrežne bolesti i šećerne bolesti, s medijanom dobi 11,0 (0,5–27). Bolesnici sa šećernom bolesti podijeljeni su u četiri skupine ovisno o trajanju bolesti (Tablica 1.).
 
Tablica 1. Značajke skupina bolesnika sa šećernom bolesti
 
Tablica 2. Aktivnosti NAG u mokraći bolesnika i kontrolne skupine
Uzorci
Nasumični uzorci mokraće bez aditiva prikupljeni su od svakog ispitanika i centrifugirani 10 minuta na 800 o/min. Supernatanti su čuvani na –20 oC do određivanja aktivnosti NAG koja se provodila jednom tjedno. Aktivnost NAG je postojana tijekom 7 dana na 4 oC i –20 oC (19).
Svježi uzorci mokraće korišteni su za određivanje koncentracije kreatinina i albumina u mokraći.
Puna krv je prikupljana s EDTA kao antikoagulansom radi određivanja HbA1c.
Metode
Aktivnost NAG u mokraći određena je spektrofotometrijski komercijalnim testom (Boehringer Mannheim, Njemačka) s 3-krezolsulfonftaleinil-N-acetil-b-glukozaminidom kao supstratom (20). Koncentracija kreatinina u mokraći mjerena je izmijenjenom Jaffeovom reakcijom (21). Kako bi se smanjio učinak diureze na izmjerenu aktivnost NAG u mokraći, rezultat smo izrazili kao omjer enzimske aktivnosti i koncentracije kreatinina u mokraći (kU/mol kreatinina).
Koncentracija HbA1c određena je ionskom izmjenjivačkom kromatografijom (Bio Systems, Španjolska).
Koncentracija albumina u mokraći mjerena je radijalnom imunodifuzijom (Behring, Njemačka).
Statistička analiza
Za ispitivanje normalnosti raspodjele rabili smo Kolmogorov-Smirnovljev statistički test. Za ispitivanje razlika u aktivnosti NAG u mokraći između skupine bolesnika i kontrolne skupine rabili smo Mann-Whitney statistički test. Za usporedbu četiri dijabetičke skupine i kontrolne skupine rabljen je Kruskal-Wallisov test (P<0,05) te zatim Mann-Whitneyev test (P<0,005).
Izračunat je Spearmanov koeficijent korelacije aktivnosti NAG u mokraći u bolesnika i trajanja bolesti.
Pomoću Kruskal-Wallisovog testa uspoređene su razlike u koncentraciji albumina u mokraći i koncentracije HbA1c između četiri dijabetičke skupine (P<0,05).
Vrijednosti određivanih parametara prikazani su kao medijan (minimum-maksimum).
 
Rezultati i rasprava
 
Aktivnosti NAG u mokraći u četiri skupine dijabetičkih bolesnika te u kontrolnoj skupini navedene su u tablici 2. Statistički značajno su više vrijednosti utvrđene za sve četiri dijabetičke skupine u odnosu na kontrolnu skupinu (skupina I, P=0,001; skupine II i III, P<0,001; skupina IV, P=0,004 u usporedbi s kontrolnim ispitanicima). Najniži medijan aktivnosti NAG zabilježen je u skupini IV (0,52; 0,18–4,55 kU/mol kreatinina) u kojoj su bili bolesnici s najduljim trajanjem bolesti, a najviši medijan za NAG je utvrđen u skupini II (0,76; 0,38–1,57 kU/mol kreatinina). Međusobne razlike u izlučivanju NAG između pojedine skupine ispitanika nisu bile statistički značajne. Shema Box-Whisker prikazuje medijan, kvartile, minimum, maksimum te vrijednosti koje odskaču u svakoj skupini. Raspodjela aktivnosti NAG u mokraći u četiri podskupine bolesnika i kontrolnoj skupini prikazana je na slici 1.
 
Slika 1. Grafički prikaz aktivnosti NAG u mokraći kontrolnih ispitanika i podskupina bolesnik
 
Aktivnost NAG u mokraći u sve četiri skupine bila je statistički značajno viša u usporedbi s kontrolnim ispitanicima bez obzira na trajanje šećerne bolesti. S druge strane, međutim, nije nađena korelacija između četiri dijabetičke skupine i trajanja bolesti (r=–0,017, P=0,892).
Hsiao i sur. (22) su ispitali 31 dijete sa šećernom bolesti tipa 1 te utvrdili značajno višu aktivnost NAG u mokraći u četiri dijabetičke skupine (skupine su podijeljene na isti način kao i u našem istraživanju, tj. prema trajanju bolesti) u usporedbi s kontrolnom skupinom, no bez statistički značajne razlike između bilo koje od tih četiri skupina. Lorini i sur. (23) i Mungan i sur. (24) također nisu otkrili korelaciju između aktivnosti NAG u mokraći i trajanja šećerne bolesti tipa 1 u mladih dijabetičkih bolesnika.
NAG u mokraći je povezana s koncentracijom glukoze u krvi (17) te može odražavati metaboličku kontrolu bolesnika sa šećernom bolesti, aktivnost bolesti, te težinu bubrežnog oštećenja.
Naši su bolesnici u sve četiri dijabetičke skupine imali slične koncentracije HbA1c, što je upućivalo na slične razine glikemije. Statistički značajne razlike nije bilo između bilo koje dvije od četiri dijabetičkih skupina u glikiranom hemoglobinu (P=0,574), što je prikazano u tablici 3. Statistički značajno više aktivnosti NAG u mokraći u djece i adolescenata sa šećernom bolesti tipa 1 u usporedbi s kontrolnim ispitanicima ukazuju da su ti dijabetički bolesnici imali tubularno oštećenje koje bi moglo biti posljedica slabe kontrole glikemije (medijan koncentracija glikiranog hemoglobina bio je 8,9% ili viši u sve četiri skupine).
 
Tablica 3. Koncentracije albumina u mokraći dijabetičara
 
Nije utvrđena statistički značajna razlika u koncentraciji albumina u mokraći između pojedinih podskupina bolesnika. Tablica 4. sadrži koncentracije albumina u mokraći za četiri podskupine dijabetičkih bolesnika.
 
Tablica 4. Koncentracija glikiranog hemoglobina u podskupinama bolesnika
 
Postoji mogućnost da razlike između skupina u izlučivanju NAG u mokraći nije bilo zbog slične razine glikemije te, posljedično, sličnoga stupnja bubrežnoga oštećenja. NAG u mokraći odražava metaboličku kontrolu bolesnika sa šećernom bolesti, aktivnost bolesti, te težinu tubularnog oštećenja, a ne samo trajanje bolesti.
Kako postoje mnogi drugi čimbenici koji dodatno mogu utjecati na izlučivanje NAG u mokraći, nije moguće donositi konačne zaključke o uzročno-posljedičnoj vezi povećane aktivnosti NAG i tubularnog oštećenja u šećernoj bolesti. Te će odgovore dati neka buduća ispitivanja na većem broju ispitanika.
 
Zahvale
 
Zahvaljujemo dr.sc. Katarini Cvijović za podatke o bolesnicima sa šećernom bolesti te mr.sc. Lidiji Bilić-Zulle za vrlo korisne savjete u vezi sa statističkom obradbom.
 
Literatura
 
1.   Turecky L, Uhlikova E. Diagnostic significance of urinary enzymes in nephrology. Bratisl Lek Listy 2003;104:27-31.
2.   Nuyts GD, Yaquoob M, Nouwen EJ, et al. Human urinary intestinal alkaline phosphatase as an indicator of S3-segment-specific alterations in incipient diabetic nephropathy. Nephrol Dial Transplant 1994;9:377-81.
3.   Ishii N, Ogawa Z, Itoh H, Ikenaga H, Saruta T. Diagnostic significance of urinary enzymes for diabetes mellitus and hypertension. Enzyme Protein 1994-95;48:174-82.
4.   Hong CY, Chia KS. Markers of diabetic nephropathy. J Diabet Compl 1988;12:43-60.
5.   Hashimoto R, Adachi H, Nishida H, Tsuruta M, Nomura G. Serum N-acetyl-b-D-glucosaminidase activity in predicting the development of hypertension. Hypertension 1995;35:1311-4.
6.   Price RG. Measurement of N-acetyl-b-glucosaminidase and its isoenzymes in urine methods and clinical applications. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1992;30:693-705.
7.   Welman E, Selwyn AP, Peters TJ, Colbeck JF, Fox KM. Plasma lysosomal enzyme activity in acute myocardial infarction. Cardiovasc Res 1978;12:99-105.
8.   Belli A, Scalercio F, Martino F, et al. Evaluation of N-acetyl-beta glucosaminidase in upper and lower urinary tract infections in childhood. Clinical study of 168 children. Minerva Pediatr 1996;48:503-7.
9.   Konda R, Sakai K, Ota S, Takeda A, Orikasa S. Followup study of renal function in children with reflux nephropathy after resolution of vesicoureteral reflux. J Urol 1997;157:975-9.
10. Cárdenas A Roels H, Bernard AM, et al. Markers of early renal changes induced by industrial pollutants. I Application to workers exposed to mercury vapour. Br J Ind Med 1993;50:17-27.
11. Roels H, Bernard AM, Cárdenas A, et al. Markers of early renal changes induced by industrial pollutants. III Application to workers exposed to cadmium. Br J Ind Med 1993;50:37-48.
12. Green T, Dow J, Ong CN, et al. Biological monitoring of kidney function among workers occupationally exposed to trichloroethylene. Occup Environ Med 2004;61:312-7.
13. Ivandić M, Hofmann W, Guder WG. Development and evaluation of urine protein expert system. Clin Chem 1996;42:1214-22.
14. Jones AP; Lock S; Griffiths KD. Urinary N-acetyl-beta-glucosaminidase activity in type I diabetes mellitus. Ann Clin Biochem 1995;32:58-62.
15. Schultz CJ, Dalton RN, Neil HAW, Konopelska-Bahu T, Dunger DB. Markers of renal tubular disfuntion measured annually do not predict risk of microalbuminuria in the first few years after diagnosis of Type I diabetes. Diabetologia 2001;44:224-9.
16. Mocan Z; Erem C; Yildirim M; Telatar M; Deger O. Urinary beta 2-microglobulin levels and urinary N-acetyl-beta-D-glucosaminidase enzyme activities in early diagnosis of non-insulin-dependent diabetes mellitus nephropathy. Diabetes Res 1994;26:101-7.
17. Kavukçu S, Soylu A, Türkmen M. The clinical value of urinary N-acetyl-b-D-glucosaminidase levels in childhood age group. Acta Med Okayama 2002;56:7-11.
18. Kordonouri O, Kahl A, Jorres A, et al. The prevalence of incipient tubular dysfunction, but not of glomerular dysfunction, is increased in patients with diabetes onset in childhood. J Diabet Compl 1999;13:320-4.
19. Hofmann W, Guder G. A diagnostic programme for the quantitative analysis of proteinuria. J Clin Chem Clin Biochem 1989;27:589-600.
20. Noto A, Yasunao O, Mori S, et al. Simple, rapid spectrophotometry of urinary N-acetyl-b-D-glucosaminidase, with use of a new chromogenic substrate. Clin Chem 1983;29:1713-6.
21. Cook JGH. Creatinine assay in the presence of protein. Clin Chim Acta 1971;32:485-6.
22. Hsiao PH, Tsai WS, Tsai WY, et al. Urinary N-acetyl-b-D-glucosaminidase activity in children with insulin-dependent diabetes mellitus. Am J Nephrol 1996;16:300-303.
23. Lorini R, Scaramuzza A, Cortona L, et al. Increased urinary N-acetyl-beta-glucosaminidase (NAG) excretion in young insulin-dependent diabetic patients. Diabetes Res Clin Pract 1995;29:99-105.
24. Mungan N, Yuksel B, Bakman M, Topaloglu AK, Ozer G. Urinary N-acetyl-beta-D-glucosaminidase activity in type I diabetes mellitus. Indian Pediatrics 2003;40:410-4.