Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Original scientific article:

Kristina Šitum, Ana Bokulić, Vanesa Ivetić-Tkalčević, Michael J. Parnham, Snježana Čužić, Koraljka Đurić, Ines Glojnarić, Daša Ševeljević-Jaran, Karmen Brajša. Usporedba sustavnih upalnih i hematoloških parametara kod zdravih C57B1/6 i genetski dijabetičnih db/db miševa tijekom cijeljenja lokalne rane. Biochemia Medica 2007;17(1):85-93.

 

GlaxoSmithKline Research Centre Zagreb Limited, Zagreb

 
Corresponding author: kristina [dot] z [dot] situm [at] gsk [dot] com
 
Sažetak
 
Uvod: Upala je početni odgovor domaćina na ozljedu. Ona nije ograničena samo na mjesto rane, nego izaziva sustavne promjene uključujući raznovrsne fiziološke i biokemijske promjene koje se skupno nazivaju odgovorom akutne faze. Ove se promjene nastavljaju tijekom rješavanja upale i procesa cijeljenja rane. U ovom ispitivanju smo usporedili serumski amiloid A protein (SAA), hematološke parametre (ukupna bijela krvna slika, postotak neutrofila i limfocita) te koncentracije interferona-gama (IFN-γ) u serumu tijekom cijeljenja neokludirane, ekscizijske kožne rane u punoj debljini kod genetski dijabetičnih db/db miševa i nedijabetičnih C57Bl/6 miševa iz istoga legla.
Materijal i metode: Područje rane izazvane „punch“ biopsijom (promjera 8 mm) kod svakog je miša analizirano planimetrijski uz računalnu potporu. Trećeg, 6., 9. i 13. dana od ranjavanja SAA i IFN-g mjereni su u plazmi testovima ELISA, a hematološki parametri u punoj krvi na automatskom hematološkom analizatoru Sysmex SF 3000.
Rezultati: Šestog i devetog dana jasno je zabilježeno kašnjenje u zatvaranju rane kod db/db miševa u usporedbi sa zdravim miševima. Ukupna bijela krvna slika bila je značajno viša u db/db miševa 9. i 13. dana. Kroz čitavo razdoblje obnove rane, diferencijalni broj neutrofila bio je viši, a broj limfocita niži kod db/db miševa u usporedbi s C57Bl/6 miševima. Vršne koncentracije SAA zabilježene su 3. dana kod C57Bl/6 miševa i db/db miševa (368,7 mg/L odnosno 173,5 mg/L), s težnjom prema nižim vrijednostima kod db/db miševa. Razine IFN-γ bile su značajno više (P < 0,05) 9. i 13. dana kod db/db miševa (75,3 pg/mL odnosno 89,9 pg/mL) u usporedbi s razinama kod C57Bl/6 miševa (66,6 pg/mL odnosno 57,2 pg/mL).
Zaljučak: Lokalni proces tkivne regeneracije kod miševa nakon lokalne kožne ozljede uzrokuje sustavne promjene u perifernoj krvi. Niti određivanje koncentracije SAA niti IFN-γ nije se moglo rabiti za motrenje dinamike cijeljenja rane u ovim vremenskim točkama.
Ključne riječi: db/db miševi, serumski amiloid A protein, interferon-gama, upala
 
Uvod
 
Akutna upala je presudna početna faza u procesu cijeljenja rane, koja dovodi do strukturnog i funkcijskog popravka oštećenog tkiva. Upalna kaskada nastupa smjesta, prvenstveno putem aktiviranih monocita u krvi i tkivnih makrofaga na mjestu ozljede, te oslobođenih upalnih posrednika kao što su IL-1 i IL-6, što također uzrokuje sustavne promjene (1). Brz porast serumskih koncentracija proteina akutne faze (APP) jedan je od najbolje istraženih sustavnih odgovora na akutni upalni poticaj (2,3). Serumski amiloid A protein (SAA) je APP niske molekularne težine koji se prvenstveno proizvodi u jetri u odgovoru na proupalne citokine. Razina SAA u krvi raste najsnažnije i najbrže među svim APP, pa je toga osjetljiv pokazatelj upale i koristan u motrenju učinkovitosti protumikrobne i protuupalne terapije (4-6). Interferoni pripadaju mreži citokina koji su uključeni u kontrolu stanične funkcije i imaju značajnu ulogu u aktiviranju makrofaga, poglavito interferona-gama (IFN-g), važnog aktivatora imunog odgovora i modulatora cijeljenja rane (7,8). IFN-g je uključen u homeostazu proliferacije epidermnih keratinocita (9), pa sustavno davanje IFN-g nakon ozljede smanjuje nakupljanje kolagena rane i očito snižava početni upalni odgovor (10). Poznato je da je šećerna bolest udružena s odgođenim cijeljenjem rana, a genetski dijabetični (db/db) miševi su koristan životinjski model za ovo stanje, jer je u ovih životinja cijeljenje rane znatno odgođeno u usporedbi s nedijabetičnim C57Bl/6 miševina iz istoga legla (11,12). Poremećaj cijeljenja obilježen je kašnjenjem u staničnoj infiltraciji i stvaranju granulacijskog tkiva, smanjenom angiogenezom, sniženim kolagenom i njegovom organizacijom (13,14). Kod db/db miševa je razvoj šećerne bolesti povezan s odsutnošću funkcijske izoforme receptora leptina (15,16). Leptin, proizvod ob gena, sintetizira se u masnom tkivu i njegove koncentracije koreliraju s količinom tjelesne masti (17). Leptin je uključen u regulaciju energetske ravnoteže, ali isto tako i u odgovor akutne faze na tkivnu ozljedu i sustavnu upalu, vjerojatno zato što transmembranski receptor leptina ima strukturnih sličnosti s porodicom citokina sličnih IL-6 (18,19).
U ovoj studiji ispitivali smo promjene u sustavnom upalnom odgovoru, odnosno njihov odraz na SAA, IFN-g te broj neutrofila i diferencijalni broj limfocita u perifernoj krvi tijekom oporavka kožne rane kod db/db miševa i njihovih kontrola iz istoga legla, kako bismo utvrdili je li sustavni upalni odgovor također odgođen u db/db miševa. Nadali smo se kako ćemo na taj način moći utvrditi mogu li se sustavni upalni parametri rabiti kao biološki biljezi za lokalno cijeljenje rane.
 
Materijali i metode
Životinje
Dvadeset genetski dijabetičnih ženka db+/db+ C57BL/KsJ miševa i dvadeset kontrolnih ženka C57Bl/6 miševa, svi stari 6 tjedana, pribavljeni su od Charles River Laboratories, Belgija. Životinje su ostavljene da se prilagode kroz 10 dana, obilježene i pojedinačno smještene za pokuse. Miševi su držani u standardnim laboratorijskim uvjetima, uz hranu i vodu ad libitum.
Svi postupci na životinjama provodili su se u skladu s a) Direktivom Savjeta EEC 86/609 od 24. studenoga 1986. o približavanju zakona, pravila i administrativnih propisa Zemalja članica glede zaštite životinja koje se rabe u eksperimentalne i druge znanstvene svrhe; i b) Ustavom Republike Hrvatske, Zakon o dobrobiti životinja, Narodne novine 081-99-266/1 od 9. veljače 1999.
Eksperimentalni postupak
Dijabetični db/db miševi i nedijabetični C57Bl/6 miševi podijeljeni su u 4 skupine po 5 životinja. Dana -1. miševi su anestetizirani udisanjem izoflurana (Forane, izofluran, inhalacijski anestetik, Abbott Laboratories, Engleska) i 5%-tnog kisika u komori za indukciju anestezije (Stoelting Co., SAD). Upuhivanje plinova izvedeno je pomoću sustava Fluovac 240V (International Market Supply, Engleska). Potom se anestezija održavala pomoću maske (Stoelting Co., SAD) izofluranom i 4%-tnim kisikom, uz povremenu provjeru nožnog refleksa. Kad su životinje bile u potpunoj anesteziji, interskapularno područje se temeljito obrijalo (aparat za šišanje na baterije Contura, International Market Supply, Engleska) i preostala dlaka je uklonjena četkicom. Nakon 24 sata (dan 0.) životinje su anestetizirane kao na dan -1., a obrijano područje je dezinficirano (Pursept-A, Merz Hygiene, Njemačka). Primjenjujući strogo aseptične postupke, načinjena je jedna ekscizijska rana u punoj debljini, promjera 8 mm, po sredini obrijanog područja kod svake životinje (20) sterilnim jednokratnim zaobljenim nožićem za biopsiju (Stiefel Laboratories Ltd., Irska), otkrivajući mišićnu fasciju. Životinje su vraćene u kaveze u koje je dodano ponešto poput komadića hrane da im odvrati pozornost, te ostavljene da se povrate iz anestezije. Trećeg, 6., 9. i 13. dana je pet db/db miševa i pet C57Gl/6 miševa anestetizirano kao što je gore opisano, zatim im je ispuštena krv ubodom u jugularnu venu i zajedničku karotidnu arteriju i prikupljena u mikro-epruvete Becton Dickinson koje su sadržavale EDTA.
Analiza zatvaranja rane
Napravljene su serijske standardne 2D fotografije svake rane digitalnim aparatom Olympus C-2040 Zoom (Olympus Optical Co., Ltd., Japan) odmah nakon ranjavanja (dan 0.) te 1., 3., 6. i 9. dana dok su životinje bile pod anestezijom izofluranom. Digitalne snimke su obrađene uz primjenu sustava Leica QWin Image Processing and Analysis System (Leica Imaging System Ltd., Velika Britanija) s ručnim uređajem koji omogućava ručno praćenje granica rane. Za svaku snimku je izračunato područje rane.
Priprava i analiza uzoraka
Alikvoti krvnih uzoraka prethodno su razrijeđeni otopinom Sysmex Cell-pack u omjeru 1:5 i analizirani na automatskom hematološkom analizatoru Sysmex SF 3000 unutar 4 sata od uzorkovanja. Potom je krv centrifugirana na 3500 okr/min kroz 15 minuta na sobnoj temperaturi. Alikvoti plazme smrznuti su na -20 °C i pohranjeni do analize.
Kako bismo odredili razine SAA, uzorci su prethodno razrijeđeni 1:200. Koncentracije SAA određivale su se istraživačkim testom ELISA dostupnim na tržištu (Phase Serum Amyloid A Assay (Murine), Tridelta, Irska) (CV < 10%, analitička osjetljivost 0,03 mg/mL).
IFN-g se mjerio istraživačkim testom ELISA (Mouse IFNg Biotrak Assay, Amersham Biosciences, Velika Britanija) (CV < 10%, osjetljivost < 10 pg/mL).
Statistička analiza i procjena
Statistički izračuni za sve parametre izvedeni su pomoću programa GrafPad. Kako bismo utvrdili razliku između db/db miševa i zdravih C57Bl/6 miševa, sirovi podaci su analizirani pomoću Mann-Whitneyevog testa. Razlika između vremenskih točaka unutar iste skupine analizirana je neparametrijskom jednosmjernom analizom varijance (ANOVA) uz uporabu Kruskal-Wallisova testa s Dunnovim testom višestruke usporedbe. Razina značajnosti postavljena je na P < 0,05. Svi parametri su prikazani kao medijani s 95%-tnom granicom pouzdanosti, osim za SAA (medijani s 1. i 3. kvartilom).
 
Rezultati
Zatvaranje rane
Izrezivanje kože dovelo je do uvlačenja rane u prvom danu kod svih životinja, ali je bilo značajno izraženije kod C57Bl/6 miševa (tablica 1.). Dana 0. su područja rane bila značajno veća kod db/db miševa negoli kod C57Bl/6 miševa iz istoga legla, ukazujući na smanjenu elastičnost rubova rane kod dijabetičnih pretilih životinja. Kod db/db miševa se uvlačenje rane nastavilo do 6. dana, dok je kod C57Bl/6 miševa u to vrijeme već započelo zatvaranje rane. Trećega dana je relativna veličina rane kod C57Bl/6 miševa bila jednaka kao i kod db/db miševa, dok je 9. dana veličina rane bila značajno manja kod C57Bl/6 miševa u usporedbi s db/db miševima, ukazujući na značajno brže zatvaranje rane kod nedijabetičnih C57Bl/6 miševa. Do 13. dana zacijelile su sve rane kod C57Bl/6 miševa i 70% rana kod db/db miševa (ovi podaci nisu prikazani).
Hematološki parametri
Kod C57Bl/6 miševa se ukupan broj bijelih stanica u krvi povećao i postigao vršnu vrijednost 6. dana, nakon čega se snižavao do 13. dana, uza statističku značajnost (P = 0,037 (tablica 1.). Kod db/db miševa je ukupna bijela krvna slika postigla vršnu vrijednost kasnije (9. dana) nego kod nedijabetičnih miševa iz istoga legla, dostižući statističku značajnost prema 3. danu (P = 0,048) i ostala je relativno visoka sve do kraja ispitivanja (13. dan). Devetog i 13. dana je ukupna bijela krvna slika bila značajno viša kod db/db miševa negoli kod C57Bl/6 miševa (P = 0,032 odnosno P = 0,016) (tablica 1.). Prema Charles River Laboratories, referentni raspon za bijelu krvnu sliku za ženske C57Bl/6 miševe je 8,09 ± 2,29 x 109/L.
Diferencijalni broj neutrofila u krvi C57Bl/6 miševa postupno je opadao kroz čitavo vrijeme promatranja. Diferencijalni broj neutrofila u krvi db/db miševa bio je 3. dana gotovo trostruko viši od onoga kod zdravih miševa i taj se porast održavao tijekom čitavog razdoblja promatranja (tablica 1.). Šestoga dana se postotak neutrofila kod db/db miševa snizio, ali bez statističke značajnosti. Diferencijalni broj limfocita u krvi zdravih miševa pokazao je blagi porast prema kraju studije. Suprotno tome, broj limfocita u krvi db/db miševa povećavao se do 6. dana, nakon čega je uslijedio pad sve do kraja studije, ali bez statističke značajnosti (tablica 1.).
SAA i IFN-g
Referentni raspon za SAA kod miševa je 0,2–40 mg/L (21,22). Kod ranjenih C57Bl/6 miševa se koncentracija SAA snižavala od 3. do 6. dana, ali to nije bilo statistički značajno. Devetog i 13. dana od ranjavanja su razine SAA kod svih životinja bile ispod 40 mg/L, unutar normalnog raspona (tablica 1.). Kod ranjenih db/db miševa su 3. dana razine SAA bile više od referentnog raspona kod svih 5 životinja. Medijan vrijednosti (s 1. i 3. kvartilom) bio je niži negoli kod C57Bl/6 miševa u istoj vremenskoj točki, ali razlika nije dostigla statističku značajnost. Kao i kod nedijabetičnih miševa iz istoga legla, kod db/db miševa se koncentracija SAA vratila unutar referentnog raspona za SAA 9. i 13. dana (tablica 1.).
Koncentracije IFN-g bile su više u krvi ranjenih db/db miševa u usporedbi s C57Bl/6 miševima tijekom čitavog razdoblja ispitivanja, no ta je razlika bila statistički značajna samo 9. i 13. dana (tablica 1.).
 
Tablica 1. Parametri mjereni kod C57Bl/6 i db/db miševa tijekom studije. Podaci su prikazani kao medijani uz 95%-tne granice vjerodostojnosti (N = 5)
 
 
Rasprava
 
Primjenom prethodno razvijene, precizne i ponovljive kompjutorizirane metode za motrenje zatvaranja rane na koži (23,24) potvrdili smo kako je cijeljenje rane znatno odgođeno kod dijabetičnih db/db miševa. Naša smo zapažanja, uz to, dalje proširili kako bismo pokazali da je sustavni upalni odgovor i odgovor akutne faze u ovih miševa odgođen i duže traje nego kod nedijabetičnih miševa iz istoga legla.
Poznato je da je cijeljenje rane odgođeno kod ljudi sa šećernom bolešću i kod životinjskih dijabetičkih modela kao što je db/db miš (7,12). U našem ispitivanju bilo je jasno da učinak procesa šećerne bolesti ima najmanje dvije sastavnice. S jedne strane, mehaničko uvlačenje granice rane poremećeno je kod db/db miševa u usporedbi sa zdravim miševima. Koža glodavaca razlikuje se od ljudske kože i mehaničko uvlačenje je važan početni odgovor na tkivnu ozljedu kod glodavaca, ali ne i kod ljudi. Poremećeno uvlačenje rane kod db/db miševa vjerojatno se može pripisati velikoj količini potkožnog masnog tkiva kod ovih pretilih životinja, ali bi isto tako moglo biti povezano s promjenama elastičnosti vezivnog tkiva. S druge strane, ponovna epitelizacija i nakupljanje granulacijskog tkiva također su poremećeni u ranama kod ovih miševa, što dovodi do kašnjenja u zatvaranju rane, a to smo zapazili i u ovoj studiji.
Unatoč mnogim studijama o učincima nedostatka receptora za leptin na lokalne promjene u cijeljenju rane kod db/db miševa, malo se zna o sustavnim upalnim promjenama u ovim uvjetima. Zabilježili smo povećan i ustrajan porast broja bijelih krvnih stanica kroz najmanje 13 dana od ranjavanja kod dijabetičnih db/db miševa u odnosu na zdrave miševe. To je poglavito bilo zbog porasta broja neutrofila u cirkulaciji. Ovi su nalazi sukladni onima iz prijašnje studije Wetzlera i sur. (25) koji su pokazali kako je kod ekscizijskih rana u punoj debljini kod db/db miševa lokalna upala mjerena ekspresijom IL-1b i TNF-a, kao i tkivna infiltracija neutrofilima i makrofazima znatno povećana i produžena u usporedbi sa zdravim C57Bl/KS miševima kroz najmanje 13 dana. Ovaj pojačan lokalni upalni odgovor bio je udružen s povećanom ekspresijom kemokina MIP-2 i MCP-2 u tkivu rane. Stoga se čini da zapažene sustavne hematološke promjene točno odražavaju lokalnu staničnu infiltraciju na mjestu rane kod db/db miševa. Štoviše, poremećen je razvoj limfocita u timusu db/db miševa (26), što je možda doprinijelo sniženju diferencijalnog broja limfocita zabilježenom u našem ispitivanju. Ustrajan upalni odgovor kod db/db miševa možda je pridonio kašnjenju u cijeljenju rane odgađajući promjene od upale do nakupljanja vezivnog tkiva.
Proteini akutne faze često se rabe kao biljezi sustavnog odgovora na akutnu i subakutnu upalu. U našem ispitivanju mjerenje koncentracija SAA (SAA je najvažniji protein akutne faze kod miševa) nije značajno odrazilo promjene koje nastaju na mjestu rane, jer se SAA povisuje rano u odgovoru na ozljedu i ima kratak život u cirkulaciji. To je bilo ograničenje naše studije, jer je prva vremenska točka bila 3. dan. Međutim, iako nije bilo statističke značajnosti, 3. dana su razine SAA bile niže kod db/db miševa nego kod zdravih miševa. Ovi nalazi koreliraju s onima drugih autora koji su pokazali kako su nakon intraartikularne injekcije zimosana A u zglobove ob/ob miševa (s pomanjkanjem leptina, a ne receptora leptina) rane razine SAA (27) u cirkulaciji snižene, što je bilo udruženo s pojačanim artritičnim odgovorom kod ovih dijabetičnih životinja (28).
IFN-g je veoma važan u procesu zatvaranja rane. Jedva ga se može otkriti u ekscizijskim ranama koje su u procesu cijeljenja kod db/db miševa, možda zbog visokih razina citokina TGF-b1 koji ga suzbija (29). To vjerojatno objašnjava izostanak razlike u koncentracijama IFN-g u cirkulaciji između db/db miševa i C57Bl/6 miševa 3. i 6. dana u našem ispitivanju. Međutim, razine ovoga citokina u cirkulaciji značajno su se povisile u db/db miševa tek 9. i 13. dana, odražavajući možda ustrajan upalni odgovor na mjestu rane i/ili sustavno upalno poticanje drugih organa. Doista, opisano je 13 do 30 puta veće stvaranje proupalnih citokina u srcu i aorti db/db miševa u odgovoru na lipopolisaharid u usporedbi sa zdravim miševima (29). Kasni porast IFN-g mogao bi pomoći u izazivanju promjena na mjestu rane od upale do popravka tkiva, s obzirom na uzajamno antagonistične učinke IFN-g (30) i TGF-b (10,31,32).
Dok je korelacija koncentracija IFN gama u lokalnim tkivima i njegovim sistemskim koncentracijama u ranjenih životinja ograničena kao pokazatelj lokalnog cijeljenja rane, određivanje SAA treba dalje istražiti kako bi se utvrdilo može li ga se rabiti kao primjereniji biljeg lokalne upale tijekom procesa cijeljenja rane. Također naglašavamo primjenu ranijih vremenskih točaka kako bi se utvrdilo može li se na taj način predvidjeti dinamika lokalnog cijeljenja rane.
U zaključku, proces lokalne tkivne regeneracije kod miševa nakon lokalne kožne ozljede uzrokuje sustavne promjene u perifernoj krvi. Niti određivanje koncentracije SAA niti IFN-g ne može se rabiti za motrenje dinamike cijeljenja rane u navedenim vremenskim točkama.
 
Zahvale
Zahvaljujemo Slavici Skender i Vedranu Vrbanu na izvrsnoj tehničkoj pomoći u provedbi ove studije.
 
Literatura
 
1.     Holzheimer RG, Steinmetz WG. Local and systemic concentration of pro- and anti-inflammatory cytokines in human wounds. Eur J Med Res 2000;5:347-55.
2.     Uhlar CM, Whitehead AS. Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant. Eur J Biochem 1999;265:501-23.
3.     Mambule C, Ando Y, Anan I, Holmgren G, Sandgren O, Stigbrandt T et al. Enhancement of AA-amyloid formation in mice by transthyretin amyloid fragments and polyethylene glycol. Biochim Biophys Acta 2000;1474:331-6.
4.     Grehan S, Herbert J, Whitehead AS. Down-regulation of the major circulating precursors of proteins deposited in secondary amyloidosis by a recombinant mouse interleukin-1 receptor antagonist. Eur J Immunol 1997;27:2593-9.
5.     Lindhorst E, Young D, Bagshaw W, Hyland M, Kisilevsky R. Acute inflammation, acute phase serum amyloid A and cholesterol metabolism in the mouse. Biochim Biophys Acta 1997;1339:143-54.
6.     Yamada T. Serum amyloid A (SAA): a concise review of biology, assay methods and clinical usefulness. Clin Chem Lab Med 1999;37:381-8.
7.     De Maeyer E, De Maeyer-Guignard J. Interferons. In: Thomson A, ed. The Cytokine Handbook. San Diego: Academic Press; 1998. p. 491-516.
8.     Miles RH, Paxton TP, Zacheis D, Dries DJ, Gamelli RL. Systemic administration of interferon-gamma impairs wound healing. J Surg Res 1994;56:288-94.
9.     Fransson J, Shen Q, Scheynius A, Hammar H. The effect of IFN-gamma on healthy and psoriatic keratinocytes in a skin equivalent model is influenced by source of the keratinocytes and by their interaction with fibroblasts. Arch Dermatol Res 1996;289:14-20.
10.   Laato M, Heino J, Gerdin B, Kahari VM, Niinikoski J. Interferon-gamma-induced inhibition of wound healing in vivo and in vitro. Ann Chir Gynaecol 2001;90 (Suppl 215):19-23.
11.   Senter LH, Legrand EK, Laemmerhirt KE, Kiorpes T. Assessment of full-thickness wounds in the genetically diabetic mouse for suitability as a wound healing model. Wound Repair Regen 1995;3:351-8.
12.   Davidson JM. Animal models for wound healing repair. Arch Dermatol Res 1998;290 (Suppl):1-11.
13.   Goodson VH, Hung TK. Studies of wound healing in experimental diabetes mellitus. J Surg Res 1977;22:221-7.
14.   Greenhalgh DG, Sprugel KH, Murray MJ, Ross R. PDGF and FGF stimulate wound healing in the genetically diabetic mouse. Am J Pathol 1990;136:1235-46.
15.   Chen H, Charlat O, Tartaglia LA, Woolf EA, Weng X, Ellis SJ et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell 1996; 84:491-5.
16.   Lee GH, Proenca R, Montez JM, Carroll KM, Darvishzadeh JG, le JI et al. Abnormal splicing of the leptin receptor in diabetic mice. Nature 1996;379:632-5.
17.   Ghilardi N, Ziegler S, Wiestner A, Stoffel R, Heini MH, Skoda RC. Defective STAT signaling by the leptin receptor in diabetic mice. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:6231-5.
18.   Lofreda S, Yang SQ, Lin HZ, Karp CL, Brengman ML, Wang DJ et al. Leptin regulates proinflammatory immune responses. FASEB J 1998; 12:57-65.
19.   Fruhbeck G. Intracellular signalling pathways activated by leptin. Biochem J 2006;393:7-20.