Contact

Ana-Maria Šimundić
Editor-in-Chief
Clinical Institute of Chemistry
Sestre milosrdnice University hospital
Vinogradska 29
10 000 Zagreb, Croatia

Phone: +385 1 3787 184
Fax: +385 1 3768 280

e-mail address: editorial_office [at] biochemia-medica [dot] com
 

Useful links

Events

Porto 2015

8th CSMBLM Congress Rijeka, Croatia 22-26 September 2015

Lokus - Mali Lošinj

Izvorni stručn članak

 

Ilza Salamunić1, Branka Pauković Sekulić1, Adela Galetović1, Leida Tandara1, Dušanka Martinović Kaliterna2. Usporedba testa AtheNA Multi-Lyte ANA za određivanje autoantitijela s indirektnom imunofluorescencijom i testom ELISA. Biochemia Medica 2008;18(2):88-98.

1 Odjel za medicinsku laboratorijsku dijagnostiku, Klinički bolnički centar Split, Split

2 Klinika za internu medicinu, Odjel za reumatologiju, Klinički bolnički centar Split, Split

  
*Adresa za dopisivanje: s_ilza [at] yahoo [dot] com
 
Sažetak
Uvod: Nove tehnologije temeljene na istovremenoj višestrukoj detekciji specifičnih antinuklearnih antitijela (engl. multiplexedbeadbaseimmunoassay) poboljšavaju dijagnosticiranje i praćenje autoimunih bolesti.
Cilj našeg ispitivanja bio je utvrditi karakteristike nove metode mnogostrukog određivanja autoantitijela (engl. AtheNA Multi-Lyte ANA test system) u odnosu na dosad korištene metode indirektne imunofluorescencije (IIF ANA) i enzimimunološke metode (ELISA).
Materijali i metode: Obradili smo 897 uzoraka seruma. Svi uzorci ispitani su testom AtheNA Multi-Lyte ANA na 9 specifičnih Ag:SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, ds DNA, centromere B i histone; i imunofluorescencijom. Pozitivni su uzorci analizirani metodom ELISA na specifična autoantitijela protiv SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, ds DNA, centromera B, histona i rezultati uspoređeni testom AtheNA Multi-Lyte ANA.
Rezultati: Podudarnost kvalitativno izraženih rezultata testa AtheNA Multi-Lyte ANA i indirektne imunofluorescencije bila je 92,3% (70% negativnih i 22.3% pozitivnih rezultata). Analitička osjetljivost za specifična autoantitijela kretala se od 80% (Scl-70) do 100% (SSA), a specifičnost od 92,3% (dsDNA) do 98,3% (Sm) između metode AtheNA Multi-Lyte ANA i ELISA. Pozitivni uzorci (200) analizirani su metodom ELISA, a usporedba s testom AtheNA Multi-Lyte ANA za 9 pojedinačnih autoantitijela pokazala je značajnu korelaciju (P < 0,001), kao i procjena slaganja dviju metoda izražena kapa- koeficijentom (P < 0,001).
Zaključak: Naši su rezultati pokazali da za određivanje specifičnih autoantitijela u imunološkom laboratoriju AtheNA Multi-Lyte ANA može zamijeniti metodu ELISA, ali ne u potpunosti metodu IIF ANA.
Ključne riječi: Antinuklearna antitijela, test AtheNA Multi-Lyte ANA, ELISA, autoimune bolesti
Pristiglo: 5. ožujka 2007.                                                                                                  Prihvaćeno: 15. siječnja 2008.
 
 
Uvod
U dijagnostici sistemskih i organospecifičnih bolesti detekcija autoantitijela je jedan od osnovnih imunoloških dijagnostičkih postupaka. Uz kliničke simptome, detekcija specifičnih autoantitijela na jezgrine autoantigene te citoplazmatskih antitijela jest ključna za postavljanje dijagnoze (1). Svaku sistemsku autoimunu bolest, od kojih su najčešće sistemski eritemski lupus (SLE), Sjőgrenov sindrom (SS), polimiozitis (PM), miješana bolest vezivnog tkiva (MCTD), reumatoidni artritis (RA) i jatrogeni lupus, karakterizira određeni profil autoantitijela. U rutinskom radu imunološkog laboratorija koriste se brojne tehnike i metode za dokazivanje ponajprije autoantitijela, a rjeđe antigena (2). U detekciji antinuklearnih autoantitijela (ANA) metoda indirektne imunofluorescencije (IIF) je metoda izbora ako se koristi u pretraživanju seruma (3). Detekcija ANA IIF je mikroskopska tehnika u kojoj iskustvo analitičara ima važnu ulogu, nije standardizirana, omogućava približnu detekciju specifičnog antitijela temeljem specifične fluorescencije, dijagnostički je zahtjevna i vremenski dugo traje. Zbog potreba bržeg dijagnosticiranja bolesti i određivanja specifičnih antitijela razvile su se metode koje je moguće automatizirati i donekle standardizirati (4). Enzimimunokemijska metoda (ELISA) za otkrivanje specifičnog autoantitijela koristi antigene pripremljene iz humanih epiteloidnih stanica (HEp-2) stanica ili rekombinantnim tehnikama. Različiti načini dobivanja antigena često su uzrok različitih rezultata između testova (5). Specifičnost određenog ELISA-testa za određeno autoantitijelo ovisi o antigenu, te je važno da antigeni koji se koriste imaju istu sekvencu, konformaciju i post-translacijsku modifikaciju te da su što sličniji humanom antigenu (6). U novije vrijeme razvoj i primjena tehnika protočne citometrije u kombinaciji s homogenim fluoroimunokemijskim metodama omogućava istovremeno određivanje većeg broja autoantitijela iz jednog uzorka seruma. Polistirenske mikročestice označene su s dva fluorofora. Svaki fluorofor sadrži 10 precizno definiranih različitih koncentracija, odnosno intenziteta fluoroscencije, što omogućava kombinaciju od 100 različito obojenih mikročestica. To bi značilo da se, kada se svaka mikročestica obilježi specifičnim antigenom u homogenoj imunofluorokemijskoj reakciji, može dokazati i do 100 antitijela. Suspenzija čestica prolazi kroz protočnicu, obasjava se s dvije laserske zrake od kojih crvena grupira čestice po boji, tj. specifičnom antitijelu, a zelena ekscitira fluorescenciju specifičnog antitijela te ih kvantificira (7). Jedan od primjera primjene tih tehnika je i test AtheNA Multi-Lyte ANA kojim se kvalitativno određuje nazočnost antinuklearnih antitijela te polukvantitativno istovremeno devet pojedinačnih autoantitijela.
Rezultati se očitavaju na sustavu Luminex 100, protočnom citometru prilagođenom za tehnologiju xMAP.
U detekciji antinuklearnih antitijela važno je znati kada je potrebno zamijeniti IIF ANA s novom tehnologijom mnogostrukog određivanja. Cilj našeg ispitivanja bio je utvrditi karakteristike nove metode mnogostrukog određivanja autoantitijela (engl. AtheNA Multi-Lyte ANA test system) u odnosu na dosad korištene metode indirektne imunofluorescencije (IIF ANA) i enzimimunološke metode (ELISA).
 
Materijali i metode
Ispitanici
Ispitivanje je obuhvatilo 897 ispitanika čije smo uzorke seruma obradili u našem laboratoriju u vremenskom intervalu od 7 mjeseci (od lipnja 2006. do prosinca 2006. godine). Ispitanici su odabrani na temelju dijagnoze ili sumnje na autoimuni poremećaj. Uzorci su podijeljeni u tri skupine:
Prva skupina obuhvaćala je 301 ispitanika s dijagnozama: reumatoidni artritis (N = 122), SLE (N = 101), Sjőgrenov sindrom (N = 9), sistemska skleroza (N = 34) i različiti oblici vaskulitisa (N = 35).
U drugoj je skupini bilo 398 ispitanika s kliničkom sumnjom na određenu autoimunu bolest: reumatoidni artritis (N = 47), SLE (N = 22), Sjőgrenov sindrom (N = 7), sistemska skleroza (N = 23), vaskulitis (N = 29) i sumnju na autoimuni poremećaj (N = 270).
U trećoj je skupini bilo 198 ispitanika bez dijagnoze.
U svim pozitivnim uzorcima određena su specifična autoantitijela protiv antigena SS-A/Ro (SSA), SS-B/La (SSB), Smith (Sm), U1-snRNP (RNP), antitijela protiv topoizomeraze 1 (Scl-70), anti-histidil-tRNA (Jo-1), antitijela protiv dvostruke uzvojnice DNA (dsDNA), antitijela protiv centromerskog proteina B (Centromere B), te antitijela protiv histona.
Nakon centrifugiranja odvojeni serum je pohranjen na temperaturi –20 ºC do provođenja analize.
Ispitivanje je odobrilo Etičko povjerenstvo Kliničke bolnice Split (13).
 
Metode
Test AtheNA Multi-Lyte ANA
897 uzoraka seruma ispitano je metodom mnogostrukog određivanja autoantitijela (AtheNA Multi-Lyte ANA test system, Zeus Scientific, Inc., Raritan, NJ, 08869 USA). Test AtheNA Multi-Lyte ANA se primjenjuje za polukvantitativno određivanje autoantitijela usmjerenih na devet različitih antigena (SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, dsDNA, centromera B i histona te kvalitativno dokazivanje ANA u serumu. Na polistirenskim mikročesticama vezani su pročišćeni antigeni SSA, Sm i histoni, dok su SSB, RNP, Jo-1 i centromera B rekombinantni antigeni. U kvalitativnoj detekciji ANA koriste se ekstrakti stanica HEp-2. Uzorak seruma i kontrole razrijedi se 1:21 s odgovarajućim razrjeđivačem. Suspenzija mikročestica miješa se s razrijeđenim uzorkom i inkubira. Ukoliko su prisutna, autoantitijela iz uzorka vežu se za odgovarajući antigen. Nakon ispiranja nevezanoga materijala doda se konjugat (kozji anti-humani IgG obilježen fluoresceinom). Nakon druge inkubacije pristupa se čitanju rezultata testa AtheNA Multi-Lyte ANA prilagođenom protočnom citometru Luminex 100 (Austin, SAD).
Rezultat je pozitivan ako je interna kontrola (HEp-2) ili bilo koji od devet parametara  120 AU/mL. Za granični rezultat smatra se vrijednost od 100 do 120 AU/mL, dok su negativni svi uzorci čiji intenzitet fluorescencije odgovara vrijednosti < 100 AU/mL.
IIF ANA
Autoantitijela su određena imunofluorescentnom tehnikom u 897 seruma. IIF ANA koristi stanice HEp-2 kao supstrat, a kozji anti-humani IgG obilježen fluorescein-izocijanatom kao konjugat (BioSystem S.A. Costa Brava 30, Barcelona, Španjolska). S uzorkom seruma razrijeđenim fosfatnim puferom u omjeru 1:80 prelije se supstrat te nakon inkubacije od 30 minuta i pažljivog ispiranja nevezanog materijala podloga se prekrije konjugatom. Po završetku inkubacije od 30 minuta i ispiranjem preparata s fosfatnim puferom prisutnost ANA se detektira pod fluorescentnim mikroskopom. Po tipu fluorescencije može se približno odrediti o kojem bi se antitijelu moglo raditi, a primjenom potvrdne metode odredi se točno specifično antitijelo. Uz svaku seriju određivane su pozitivna i negativna kontrola. Pozitivnim rezultatom smatra se razrjeđenje  1:80.
ELISA
Metodom ELISA smo u 200 seruma pozitivnih na antinuklearna antitijela odredili specifična antitijela za SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, dsDNA (Hycor Biomedical Ltd Pentlands Science Park, Bush Loan, Penincula, V. Britanija), centromere B i histone (DiaSorin S.p.A. Via Corescentino 13040 Sallugia, Italija). Jažice mikrotitarskih pločica obilježene su antigenima različitoga podrijetla. SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70 i Jo-1 su goveđeg podrijetla, dsDNA iz telećeg timusa, centromeri B su rekombinantni antigen, a histoni su iz pilećih matičnih stanica. Sve su analize izvedene na automatskom analizatoru (miniBOS, Biomedica Gruppe, GMBH, A-1210, Divischgasse 4, Beč, Austrija).
Nakon automatskog razrjeđenja kontrole i uzorka (1:100) u jažice se pipetira standard, uzorak i kontrola te se za vrijeme inkubacije od 30 minuta specifično vežu autoantitijela za odgovarajući antigen. Po završetku inkubacije suvišak se ispere i dodaje konjugat (anti-humani IgG obilježen peroksidazom) te inkubira. Po završetku inkubacije, reakcija peroksidaze na dodani supstrat (tetra-metil benzidin) se prekida nakon 15 minuta s 0,25 M H2SO4. Apsorbancija se očita na 450 nm, a jačina obojenja propocionalna je količini antitijela u serumu. Prema navodu proizvođača za nepreciznost unutar serije koeficijent varijacije (CV%) kreće se u rasponu za: SSA od 2,8% do 3,1%, SSB od 5,5% do 9,1%, Sm od 5,4% do 8,6%, RNP od 2,9% do 11,2%, Scl-70 od 3,0% do 5,1%, Jo-1 od 3,6% do 6,1%, dsDNA od 3,9% do 6,9%, centromere B od 4,8% do 8,6%, te za histone od 6,6% do 10,6%. CV% za nepreciznost između serija kreće se u rasponu za: SSA od 3,5% do 7,9%, SSB od 3,4% do 6,0%, Sm od 3,2% do 5,1%, RNP od 4,9% do 7,4%, Scl-70 od 6,7% do 9,4%, Jo-1 od 2,7% do 8,3%, dsDNA od 8,4% do 9,8%, centromere B od 6,2% do 11,0%, te histone od 8,3% do 12,9%.
Nalaz je pozitivan ako su rezultati za autoantitijelo na SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70 i Jo-1 > 15 U/mL, graničan ako je između 10 i 15 U/mL, a negativan ako je < 10 U/mL. Za dsDNA vrijednosti > 60 U/mL su pozitivne, od 40 do 60 U/mL granične, a < 40 U/mL su negativne, za centromere B vrijednosti > 11 U/mL su pozitivne, od 8 do 11 U/mL granične, a < 8 U/mL negativne i vrijednosti za histone > 21 U/mL pozitivne, od 15 do 21 U/mL granične, a < 15 U/mL negativne.
U ovom smo radu primijenili navedene referentne vrijednosti proizvođača testova.
 
Statistička analiza
Rezultati su obrađeni pomoću statističkog programa SPSS V 8.0 (SPSS Inc, Chicago, IL). Izračunani su koeficijenti korelacije (Spearman rho), uz prihvaćenu razinu značajnosti za P < 0,001, te Cohenov kapa-koeficijent kojim je izražena podudarnost između dvije različite metode za svako antitijelo pojedinačno uz razinu značajnosti P < 0,001.
Osjetljivost i specifičnost testa računane su u odnosu na metodu ELISA koju smo prihvatili kao referentnu metodu i gdje smo definirali: stvarno pozitivne rezultate testa (TP), stvarno negativne rezultate testa (TN), lažno negativne rezultate testa (FN), te lažno pozitivne rezultate testa (FP). Osjetljivost (TP/TP+FN x 100) je izražena kao postotak pozitivnih rezultata u odnosu na pozitivne rezultate testa ELISA, a specifičnost (TN/FP+TNĆ x 100) kao postotak negativnih rezultata u odnosu na negativne rezultate testa ELISA.
 
Rezultati
Antinuklearna antitijela određivali smo kod 897 bolesnika sa sumnjom na autoimune bolesti. Rezultati dobiveni testom AtheNA Multi-Lyte ANA i testom indirektne imunofluorescencije prikazani su u Tablici 1. Kvalitativnom analizom uzoraka s ova dva testa podudarnost rezultata je nađena kod 92,3% uzoraka (70% negativnih i 22,3% pozitivnih). Neslaganje rezultata nađeno je kod 59 (6,6%) uzoraka od kojih je 6 (0,7%) uzoraka bilo lažno pozitivno, 35 (3,9%) lažno negativno, a 18 (2%) je dalo granične rezultate testa AtheNA Multi-Lyte ANA. Svih 35 negativnih uzoraka testa AtheNA Multi-Lyte ANA dalo je negativne rezultate kod testa ELISA, dok su kod testa IIF svi bili pozitivni i to 7 uzoraka je imalo točkastu, a 28 uzoraka homogenu imunofluorescenciju. Svih 6 uzoraka koji su nakon testa AtheNA Multi-Lyte ANA bili pozitivni, a imunofluorescencijom negativni, s ELISA testom su bili pozitivni kao SSA.
 
Tablica 1. Prikaz rezultata dobivenih metodom imunofluorescencije i testom AtheNA Multi-Lyte ANA
 
 
Između 18 graničnih uzoraka nakon testa AtheNA Multi-Lyte, 3 su uzorka bila negativna s IIF ANA, s ELISA-testom SSA pozitivna, a 15 uzoraka je bilo nakon IIF ANA pozitivno. Među 15 uzoraka koji su nakon IIF ANA bili pozitivni, nakon testa ELISA 6 je uzoraka bilo dsDNA pozitivno, 4 Scl-70 pozitivna, dok je 5 uzoraka bilo nakon testa ELISA negativno. Osjetljivost između testa AtheNA Multi-Lyte ANA i testa ELISA je bila od 80% za Scl-70 do 100% za SSA, specifičnost od 92,3% za dsDNA do 98,3% za Sm (Tablica 2).
 
Tablica 2. Osjetljivost i specifičnost metoda AtheNA Multi-Lyte ANA i ELISA
 
Antinuklearna antitijela kod 200 pozitivnih uzoraka koji su usporedno ispitani testovima AtheNA Multi-Lyte ANA i IIF izražena su kao kvalitativni rezultati. Svi pozitivni serumi su ispitani s ELISA-pojedinačnim antigenom i testom AtheNA Multi-Lyte ANA na pojedinačne antigene: SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, dsDNA, centromere B i histone i izraženi su kao polukvantitativni rezultati. Kada su uspoređeni rezultati za pojedinačna autoantitijela testova AtheNA Multi-Lyte ANA i ELISA, za svako autoantitijelo dobivena je značajna korelacija (P < 0,001) (Tablica 3). Za procjenu slaganja dviju metoda pomoću Cohenovog kapa-koeficijenta za svako je pojedinačno antitijelo dobivena također značajna korelacija (P < 0,001) (Tablica 3).
 
Tablica 3. Korelacija specifičnih autoantitijela između AtheNA Multi-Lyte ANA i ELISA i procjena slaganja dviju metoda
 
Kada su uspoređeni rezultati svih 200 uzoraka pozitivnih prema metodama AtheNA Multi-Lyte ANA i ELISA, bez obzira na različitost u metodologiji dobivena je podudarnost rezultata od 90,5% do 100% (Tablica 4).
 
Tablica 4. Podudarnost rezultata među pozitivnim uzorcima seruma za AtheNA Multi-Lyte ANA i metodu ELISA
 
 
Rasprava
Detekcija antinuklearnih antitijela provodi se kod različitih autoimunih sistemskih i organospecifičnih bolesti, uz primjenu brojnih tehnika i metoda kao što su imunofluorescencija, imunodifuzija, enzimska imunometoda, imunoblot i u zadnje vrijeme analiza mnogostrukog određivanja utemeljena na načelu protočne citometrije. Na laboratoriju je zadatak da zajedno s kliničarima odredi metodu koju će primijeniti u detekciji brojnih autoantitijela kako bi se ustanovila ona najznačajnija. Istovremeno primijenjena metoda mora biti brza, učinkovita, jednostavne izvedbe i isplativa. U našem smo radu ispitivali kombinaciju testova kako bismo utvrdili koja od metoda je najučinkovitija za pretraživanje, a potom i utvrđivanje specifičnih autoantitijela. Ipak, potrebno je napomenuti da je jedino zajedno s kliničkom validacijom dobivenih rezultata moguće zaključiti o kliničkoj specifičnosti i osjetljivosti testa.
Indirektna imunofluoroscencija (IIF) je osjetljiva metoda s poznatim ograničenjima kao što su vrsta supstrata, način izvođenja testa, subjektivna interpretacija, niska reproducibilnost i nedostatak standardizacije.
Metoda mnogostrukog određivanja autoantitijela kao test AtheNA Multi-Lyte ANA priređena je za kvalitativnu detekciju ANA i istovremeno za polukvantitativno određivanje IgG-razreda specifičnih antitijela na SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, dsDNS, centromere B i histone antigene u serumu. Sistemske autoimune bolesti karakterizira odnos pojedinih autoantitijela te je nakon pretraživanja uzorka bitno odrediti koja su specifična autoantitijela i u kojoj količini zastupljena.
Usporedbom kvalitativnih rezultata IIF ANA i AtheNA Multi-Lyte ANA podudarnost je iznosila 92,3%. Od 897 testiranih seruma 35 (3,9%) je bilo pozitivno s IIF ANA, a negativno s AtheNA Multi-Lyte ANA (Tablica 1). Oblik fluorescencije ovih uzoraka bio je nespecifičan i izražen kao točkasta i homogena fluorescencija. Pozitivni uzorci s IIF ANA nađeni su u skupini bolesnika sa sumnjom na autoimuni poremećaj i među uzorcima bolesnika bez dijagnoze, što je moguće s obzirom na nespecifičnost i kliničku nedefiniranost ovih uzoraka. IIF ANA detektira brojna autoantitijela na jezgrine centriole, signalne molekule te stanične sastojke koji također mogu biti od koristi u kliničkoj dijagnostici (8,9). Imajući u vidu da veliki broj uzoraka nema utvrđenu dijagnozu te da se među njima nalaze i bolesnici kod kojih postoji sumnja na organospecifičnu bolest, koristili smo razrjeđenja uzorka 1:80, iako je preporuka da se za detekciju kod sistemskih bolesti koristi razrjeđenje 1:160 (10,11).
Nalaz 6 (SSA) pozitivnih i 3 (SSA) granična rezultata primjenom AtheNA Multi-Lyte ANA, a negativnih s IIF ANA potvrđuje da je ANA HEp-2 supstrat nedovoljno osjetljiv za SSA (12). Razlika u negativnim rezultatima ostavlja mogućnost pogrešnog tumačenja rezultata (14-16). Usprkos nedovoljnoj osjetljivosti za SSA i Jo-1 antigen, IIF ANA rijetko daje lažno negativne rezultate. Martins i sur. uspoređivali su metodu ELISA za SSA, SSB, Sm, RNP i Scl-70 s metodom mnogostrukog određivanja testa ENA 5 Luminex. Podudarnost rezultata bila je od 93,6% ili naviše, osjetljivost 50% za Scl-70 do 100% za SSA i specifičnost od 97,9% za Sm do 99,5% za SSB (17). Naši su rezultati pokazali podudarnost od 90,5% za RNP do 100% za SSB, osjetljivost od 80,0% za Scl-70 do 100,0% za SSA i specifičnost 92,3% za dsDNA do 98,3% za Sm između testova AtheNA Multi-Lyte ANA i ELISA (Tablica 2, Tablica 4). Usporedbom testa AtheNA Multi-Lyte ANA i pojedinačnih testova ELISA dobili smo značajnu korelaciju (Spearman R od 0,612 do 0,924, P < 0,001), što je u suglasnosti i s brojnim studijama koje su usporedbom istih metoda pokazale dobru podudarnost (17-21). Nifli i sur. uspoređivali su testove ELISA i AtheNA Multi-Lyte ANA za SSA, SSB, Sm, RNP i dobili značajnu korelaciju (kapa od 0,347 do 0,764, P < 0,001) izuzev za citoplazmatski antigen Jo-1. Zaključili su da test AtheNA Multi-Lyte ANA može zamijeniti pojedinačni test ELISA u mjerenju specifičnih autoantitijela izuzev za antigen Jo-1 kod kojega se vjerojatno koriste različiti epitopi na molekuli antigena u navedenim metodama (20). Usporedba dviju metoda u našem određivanju za sva autoantitijela daje značajnu korelaciju (kapa-koeficijent od 0,834 za SSA do 0,507 za centromere B). Shovman i suradnici uspoređivali su rezultate dobivene metodom ELISA za pretraživanje ANA i test AtheNA Multi-Lyte ANA kod zdravih osoba i dobili su podudarnost u 99% slučajeva, dok je podudarnost iz uzoraka dobivenih iz drugih laboratorija bila 97,7%. Zaključili su da je test AtheNA Multi-Lyte ANA osjetljiv za detekciju ANA (18). Međutim, metoda ELISA za pretraživanje ANA može propustiti neke antigene jer je test pripremljen iz ekstrakta stanica HEp-2 s ograničenim brojem antigena. Usporedbom pojedinačnih rezultata za specifična autoantitijela dobili smo neke razlike (Tablica 4). Svi rezultati koji se nisu podudarali bili su oko graničnih vrijednosti pojedinačnih testova deklariranih prema proizvođačima, izuzev 3 uzorka za Scl-70 i 4 za dsDNA. Razlika u rezultatima za 3 Scl-70 i 4 dsDNA dobivenih kao pozitivni testom ELISA i negativni testom AtheNA Multi-Lyte ANA može biti zbog različite pripreme antigena, prezentacije antigena autoantitijelu, različitih uvjeta u odvijanju reakcije među metodama, razlici u metodologiji, razlici u pripremi antigena (pročišćeni ili rekombinantni), kapacitetu vezanja i koncentraciji drugog antitijela te konjugatu (20,22). Uvjeti testa kao ionska jakost i granična vrijednost (engl. cut off) također utječu na razlike među testovima. Antigeni Scl-70 i dsDNA vezani su kovalentnom vezom za karboksilnu skupinu istaknutu na površini mikročestice te, ukoliko nisu uravnoteženi postupak vezanja, aktivacije, koncentracije mikročestica, kvaliteta vezanja antigena u stabilizirajućoj otopini i postupak ispiranja filtracijom, može doći do lažno negativnog rezultata za specifično antitijelo. Lažno negativni rezultat može prouzročiti pogreške u postavljanju kliničke dijagnoze ili, ukoliko se radi o terapiji, dovesti do pogrešnoga liječenja. Granični se rezultati moraju ili potvrditi kao pozitivni ili odbaciti kao negativni. Važno je znati da se testom AtheNA Multi-Lyte ANA može odrediti 9 specifičnih autoantitijela, dok IIF ANA na stanicama HEp-2 ima veću mogućnost detektiranja brojnih antigena. Razumijevanje razlika u metodama važno je za tumačenje rezultata u kliničkom kontekstu.
 
Zaključak
Testovi AtheNA Multi-Lyte ANA i IIF ANA pokazuju dobru podudarnost kao i usporedba rezultata s pojedinačnim ELISA u sistemskim autoimunim bolestima. Test AtheNA Multi-Lyte ANA omogućava brzu identifikaciju klinički relevantnih autoantitijela u sistemskim autoimunim bolestima bez potrebe daljnjeg testiranja. Za laboratorij je učinkovita, jednostavna za rad i omogućava izradu velikoga broja autoantitijela istovremeno iz jednog uzorka. Važno je znati može li se reći za testove da se dobro podudaraju ili ne, ali bez kliničke evaluacije koja uključuje bolesnike s potvrđenom dijagnozom za autoimunu bolest i one iz zdrave populacije, vrijednosti testa su nepotpune.
 
Literatura
1.    Damoiseaux JGMC, Cohen Tervaert JW. From ANA to ENA: How to proceed? Autoimmunity Reviews 2006;5:10-7.
2.    Gonzáles-Buitrago JM, Gonzáles C. Present and future of the autoimmunity laboratory. Clinica Chimica Acta 2006;365:50-7.
3.    Hayashi N, Kawamoto T, Mukai M, Morinobu A, Koshiba M, Kondo S, et al. Detection of antinuclear antibodies by use of an enzyme immunoassay with nuclear Hep-2 cell extract and recombinant antigens: comparison with iImmunofluorescence assay in 307 patients. Clin Chem 2001;47:1649-59.
4.    Fenger M, Wiik A, Høter-Madsen M, Lykkegaard JJ, Rozenfeld T, Hansen MS, et al. Detection of antinuclear antibodies by solid-phase immunoassays and immunofluorescence analysis. Clin Chem 2004;50:2141-7.
5.    Tan EM, Smolen JS, McDougalJS, Butcher BT, Conn D, Dawkins R, et al. A critical evaluation of enzyme immunoassays for detection of antinuclear autoantibodies of defined specificities. Precision, sensitivity, and specificity. Arthritis Rheum 1999;42:455-64.
6.    Gonzáles-Buitrago JM. Multiplexed testing in the autoimmunity laboratory. Clin Chem Lab Med 2006;44(10):1169-74.
7.    Fritzler MJ. Advances and applications of multiplexed diagnostic technologies in autoimmune diseases. Lupus 2006;15:422-7.
8.    Wiik A, Cervera R, Haass M, Kallenberg C, Khamashata M, Meroni PL, et al. European attempts to set guidelines for improving diagnostics of autoimmune rheumatic disorders. Lupus 2006;15:391-6.
9.    Wiik AS. Anti-nuclear autoantibodies. Clinical utility for diagnosis, prognosis, monitoring, and planning strategy in systemic immunoinflammatory diseases. Scand J Rheumatol 2005;34:260-8.
10. Kavanaugh A, Tomar R, Reveille J, Solomon D, Homburger HA. Guidelines for clinical use of the nuclear antibody test and tests for specific autoantibodies to nuclear antigens. Arch Pathol Lab Med 2000;124:71-81.
11. Wiik AS, Gordon TP, Kavanaugh AF, Lahita RG, Reeves W, Van Venrooij WJ, et al. Cutting edge diagnostics in rheumatology: the role of patients, clinicians, and laboratory scientists in optimizing the use of autoimmune serology. Arthritis Rheum 2004;51:291-8.
12. Itoh Y, Rader MB, Reichlin M. Heterogenity of the Ro/SS-A antigen and autoanti-Ro/SS-A response: evidence of the four antigenetically distinct forms. Clin Exp Immuno 1990;81:45-51.
13. Bossuyt PM, Reitsma JB, Bruns DE, Gatsonis CA, Glasziou PP, Irwing LM, et al. The STARD statement for reporting studies of diagnostics accuracy: explanation and elaboration. Clin Chem 2003;49:7-18.
14. Bayer PM, Fabian B, Hubl W. Immunofluorescence assays (IFA) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) in autoimmune disease diagnostics -technique, benefits, limitations and applications. Scand J Clin Lab Invest Suppl 2001;235:(Suppl)68-76.
15. Dahle C, Skogh T, Aberg AK, Jalal A, Olcen P. Methods of choice for diagnostics antinuclear antibody (ANA) screening. Benefit of adding antigen-specific assays to immunofluorescence microscopy. J Autoimmun 2004;22:241-8.
16. Hoffman IEA, Peene I, Veys EM, De Keyser F. Detection of specific antinuclear reactivities in patients with negative anti-nuclear antibody immunofluorescence screening tests. Clin Chem 2002;48:2171-6.
17. Martins TB, Burlingame R, Von Mühlen CA, Jaskowski TD, Litwin CM, Hill HR. Evaluation of multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for detection of autoantibodies to nuclear antigens. Clin and Dia Lab Immunology 2004;11:1054-9.
18. Shovman O, Gilburd B, Zandman-Goddard G, Yehiley A, Langevitz P, Shoenfeld Y. Multiplexed AtheNA multi-lyte immunoassay for ANA screening in autoimmune diseases. Autoimmunity 2005;38(1):105-9.
19. Rouquette AM, Desqruelles C, Larosche P. Evaluation of the new multiplexed immunoassays, FIDIS, for simultaneous quantitative determination of antinuclear antibodies and comparison with conventional methods. Am J Clin Pathol 2003;120:676-81.
20. Nifli AP, Notas G, Mamoulaki M, Niniraki M, Ampartzaki V, Theodoropoulos PA, et al. Comparison of a multiplex, bead-based fluorescent assay and immunofluorescence methods for the detection of ANA and ANCA autoantibodies in human serum. J Immunol Methods 2006;311:189-97.
21. Biagini RE, Parks CG, Smith JP, Sammons DL, Robertson SA. Analytical performance of the AtheNA MultiLyte ANA II assay in sera from lupus patients with multiple positive ANAs. Anal Bioanal Chem 2007;388;613-8.
22. Binder SR. Autoantibody detection using multiplex technologies. Lupus 2006;15:412-21.
23. Seideman J, Perrit D. A novel monoclonal antibody screening method using the Luminex-100 microsphere system. J Immunol Methods 2002;267:265-71.