Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Pregledni članak:

Christoph Seger, Andrea Griesmacher. Važni aspekti uspostave dvojne spektrometrije masa u uvjetima rutinskoga kliničkog laboratorija. Biochemia Medica 2007;17(1):29-51.
Institut za medicinsku i kemijsku laboratorijsku dijagnostiku, Sveučilišna bolnica u Insbrucku, Innsbruck, Austria
Corresponding author: christoph [dot] seger [at] uki [dot] at
 
Sažetak
 
Tijekom posljednjih godina kombinacija tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti (engl. high performance liquid chromatography, HPLC) i dvojne spektrometrije masa (engl. tandem mass spectrometry, MS/MS) (kombinacija koja je također poznata kao HPLC-MS/MS), postala je pouzdani analitički postupak. Njena primjena u terapijskom praćenju koncentracije lijeka (engl. therapeutic drug monitoring, TDM) pokazala se boljom od uobičajeno primjenjivanih imunokemijskih analiza. Ta je tehnika postala obveznim pomagalom u mnogim kliničkim laboratorijima, posebice u kontekstu praćenja koncentracije imunosupresijskih lijekova gdje se smatra “zlatnim” standardom. Međutim, postavljanje uređaja za HPLC-MS/MS je zahtjevno u smislu validacije analiza te robusnosti mjerenja. U ovom se pregledu daje gruba smjernica kao pomoć u procesu uspostave takvih uređaja u rutinskim kliničkim uvjetima.
Ključne riječi: dvojna spektrometrija masa, ciljana analiza, terapijsko praćenje koncentracije lijeka, rutinska analiza, tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti, HPLC-MS/MS
 
Uvod
 
Tijekom posljednjih nekoliko godina dvojni maseni spektrometri (engl. tandem mass spectrometers, MS/MS, također poznati kao “trostruki kvadropolni” maseni spektrometri, postali su značajni i pouzdani rutinski analitički uređaji. Ti su analizatori, osobito ako su povezani tehnikama pripreme uzorka temeljene na tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti (HPLC), omogućili provedbu kvantitativne i kvalitativne analize malih organskih molekula u femtomolskom rasponu, - i to kako ksenobiotika, tako i endogenih metabolita. Zbog toga se njihova uporaba proširila u farmaceutskoj industriji, istraživačkim ustanovama, a tijekom posljednjeg desetljeća i u kliničkim laboratorijima. Terapijsko praćenje koncentracije lijeka (TDM) zasnovano na HPLC-MS/MS pojavilo se prije manje od dva desetljeća i trenutno je uglavnom usredotočeno na kontrolu koncentracija imunosupresijskih i antiretrovirusnih lijekova te psihofarmaka. Općenito, točno mjerenje analita koji se prate u TDM nužan je preduvjet za uspješno liječenje bolesnika. Većina analiza zasnovanih na reakciji antitijelo-antigen (imunokemijske analize) koje su danas u širokoj uporabi uspješno ne udovoljavaju tom mjerilu zbog nekoliko razloga. Križna reaktivnost komercijaliziranih antitijela s molekulama koje su strukturno slične endogenim metabolitima lijeka ili lijekovima iz iste skupine analita često dovodi do viših vrijednosti ciljanog lijeka. U slučaju praćenja koncentracije imunosupresiva takav nedostatak specifičnosti analize rezultira odstupanjem (razlikom, engl. bias) koje u prosjeku dostiže 20-40% (1-3). Nadalje, nepreciznost analize i osjetljivost često jedva da ispunjavaju kliničke potrebe, posebice ako su terapijski rasponi sniženi kod kombiniranih pristupa terapiji. Izvanredan primjer u tom kontekstu su komercijalno dostupni testovi za određivanje koncentracije takrolimusa koji su u međuvremenu postali dobro poznati po slaboj učinkovitosti u bolesnika s 35% nižom koncentracijom hematokrita zbog grubog precjenjivanja niskih koncentracija takrolimusa. Takve previsoke vrijednosti mogu dovesti i do lažno pozitivnih rezultata koji mogu doseći koncentracije unutar terapijskog raspona (4-9). Stoga je vrlo iznenađujuće da se taj test još uvijek uvelike koristi u rutinskim kliničkim laboratorijima, što je vidljivo iz najnovije statistike programa kontrole dijagnostičke učinkovitosti (10). Lani je prosječno 54% svih laboratorija (N = 353) koji su sudjelovali u spomenutom britanskom programu kontrole kvalitete provodilo tu analizu. U usporedbi s time, samo 16% laboratorija je sudjelovalo u skupini mjerenja metodom HPLC koja je uključivala tehnike HPLC-UV, HPLC-MS i HPLC-MS/MS.
Sve to jasno odražava trenutačan položaj HPLC-MS/MS u rutinskom kliničkom TDM. Iako je bolja učinkovitost analiza HPLC-MS/MS (poboljšana preciznost i točnost, bolja specifičnost i povećana osjetljivost koje rezultiraju manjim potrebnim količinama uzorka te nižim granicama kvantifikacije) jasno dokazana tijekom proteklih godina (ta se tehnika smatra zlatnim standardom za TDM imunosupresiva), još uvijek je primjena te tehnologije prisutna u relativno malo laboratorija. Razlozi su sasvim jasni: za spektrometriju masa je poznato da je zahtjevna u smislu potrebnih vještina operatera, a tu je i financijsko opterećenje zbog kupnje samog uređaja. Osim toga, ako se takva tehnika uvodi od početka, istraživača očekuje prilično duga eksperimentalna faza prije moguće provedbe temeljite konačne validacije pretrage. Konačno, za visokoautomatizirane imunokemijske pretrage govori se da imaju kraća vremena obrade uzorka od pretraga HPLC-MS/MS, što zapravo nije točno za posljednju generaciju s visokim protokom.
Autori u sljedećim poglavljima raspravljaju o načinu kako uspješno provesti prijenos takvih analitičkih platformi u uvjete rutinskoga kliničkog laboratorija koje karakteriziraju visokoautomatizirani analizatori. Pregled se usredotočuje na postavljanje ciljane analize kakva se ostvaruje u TDM. Posebna se pozornost posvećuje TDM imunosupresiva (11-14) jer je to nova temeljna stručna vještina u laboratoriju autora. Glede pristupa probiranju koje se provodi u neonatalnoj dijagnostici, toksikologiji, sudskoj medicini, proteomici i metabolomici, čitatelji se upućuju na odgovarajuću literaturu (15-25).
Potrebe u kliničkim uvjetima
Uvjeti u rutinskome kliničkom laboratoriju razlikuju se od većine industrijskih ili istraživačkih struktura po: (i) mogućim visokim rizicima za bolesnike povezanima s bilo kakvom vrstom pogrešne kvalitativne ili kvantitativne analize; (ii) susretu s visoko složenim i nestandardiziranim matriksima uzoraka kao što su puna krv, plazma i mokraća od oboljelih osoba; (iii) visokim zahtjevima za robusnošću i postojanošću analiza; (iv) provedbi analiza od strane tehničkog osoblja; (v) zahtjevu za kratkim vremenom obrade (unutar pola dana u slučaju TDM). Tijekom posljednjeg desetljeća zakonodavstvo Europske zajednice je pokušalo riješiti tu izazovnu situaciju provedbom In vitro dijagnostičke direktive (IVDD) 98/79/EG (26,27) koja je posljednjih godina prenesena i u nacionalne zakone. Posljedica te direktive je da medicinski uređaj koji se koristi za dijagnostiku in vitro, uključujući bilo kakvu aparaturu, analizu ili sastavnicu analize (npr. kalibrator), mora biti podvrgnut studiji procjene učinkovitosti kako bi se dokazala prikladnost za navedenu svrhu uređaja ili analize. Cilj te validacije je deklaracija o usklađenosti (Dodatak 3 Direktive) od proizvođača u kojem je nedvosmisleno naznačeno da “uređaji moraju ispunjavati osnovne zahtjeve postavljene u Dodatku I koji se na njih odnosi, uzimajući u obzir planiranu svrhu uređaja koji su u pitanju” (članak 3 Direktive). Ako to vrijedi kao točno, svi “uređaji, osim uređaja za procjenu učinkovitosti, za koje se smatra da ispunjavaju osnovne zahtjeve naznačene u članku 3, moraju imati oznaku CE o usklađenosti kada se stavljaju na tržište” (članak 16 Direktive). Oznaka CE je obvezatan znak koji se koristi u Europskoj zajednici radi označavanja da je određeni proizvod ili skupina proizvoda usklađena sa zdravstvenim i sigurnosnim zahtjevima definiranima srodnim europskim direktivama. Tu oznaku ne treba zamijeniti za znanstvenu skraćenicu koja se koristi za kapilarnu elektroforezu, tj. također CE. U slučaju analitičkog ispitivanja, tj. analize, procjena učinkovitosti treba uključiti najmanje temeljitu validaciju analitičke platforme (npr. prema “Uputama za industriju; validacija bioanalitičke metode” (28) Američke uprave za hranu i lijekove (engl. Food and Drug Administration, FDA) te smjernicama GHTF (29) “Upravljanje sustavima kvalitete - validacija procesa”) te analizu rizika (npr. načini rada kod zatajenja te analiza učinaka, kao što je objavila GHTF u smjernici (30) “Provedba načela upravljanja rizikom i aktivnosti unutar sustava upravljanja kvalitetom”). Ukratko, cilj procjene učinkovitosti je dokazati da uređaj osmišljen za IVD (npr. analitička platforma HPLC-MS/MS) ispunjava zahtjeve Dodatka I Direktive koji je osnova za deklaraciju o usklađenosti. U članku 1.5 Direktive spominje se “povlastica unutar ustanove”: “ova se Direktiva ne primjenjuje na uređaje koji su izrađeni i koriste se isključivo unutar iste zdravstvene ustanove te u prostorijama gdje su izrađene ili u neposrednoj blizini i ne prenose se na drugu pravnu osobu. To ne utječe na pravo zemlje članice EZ da aktivnosti podvrgne zahtjevu za odgovorajućom zaštitom”, i ona može vrijediti za analitičke platforme sa samo jednom jedinicom (npr. HPLC-MS/MS, analize PCR...) na kojima se analiziraju isključivo lokalni uzorci (npr. unutar jednog medicinskog centra). Međutim, tumačenje izraza “unutar ustanove” razlikuje se unutar EZ zbog nacionalnih zakonskih odredbi. Trenutačno se cijelo to pitanje čini neriješeno tako da se možemo nadati da će buduće rasprave dovesti do razjašnjenih odredbi u vezi s novim primjenama.
Uvod u uređaje za spektrometriju masa
Ionizacija analita
Spektrometrija masa se temelji na stvaranju, odabiru i prijenosu iona u vakuum uređaja za MS. Sljedeći odlomci služe kao kratak pregled kojime se daje uvid u postojeća tehnička rješenja za ionizaciju i odabir analita, kao i za povezivanje MS na kromatografske uređaje.
Tijekom posljednjih desetljeća razvijene su različite metodologije za stvaranje iona te ionski odabir analita, kao i raznolike strategije za kombiniranje tehnika razdvajanja analita sa spektrometrijom masa (Slika 1.).
 
Slika 1. Shematski prikaz ionizacijskih tehnika i uređaja za odabir iona koji se koriste u bioanalitičkoj spektrometriji masa. Prikazane su različite konfiguracije instrumenata (a-f) s tipičnim ionizacijskim izvorima  (lijeva kolona ESI, desna kolona MALDI). a, Uređaj-reflektor vremena proleta (engl. timeofflight, TOF) koji se koristi kad se traže visoke točnosti mase. b, Instrument TOF-TOF koji omogućuje fragmentaciju analita između dvaju procesa odabira iona. c, Glede trostrukog kvadropola TOF-TOFMS (QqQ), taj uređaj kombinira dva procesa odabira iona i omogućuje, između ostalog, pokuse praćenja odabranih reakcija. Linearna ionska stupica  (točka u Q3) može se koristiti za prikupljanje i očitanje iona nastalih u sudarnoj stanici. d. U kvadropolnom uređaju TOF (Q-TOF) (križani maseni spektrometar), prednji dio trostrukog kvadropolnog uređaja je kombiniran s TOF kao ionski selektor za očitavanje. e, U (trodimenzijskim) uređajima s ionskom stupicom, hvatanje iona, fragmentacija te očitavanje (obično pregledom) omogućava nastanak spektara MS/MS. f. Uređaj FT-ICR-MS hvata ione pomoću jakoga magnetskog polja. Može se kombinirati s linearnom ionskom stupicom (kvadropolstočkom) radi djelotvornog izdvajanja, fragmentacije i odabira fragmenta prije odjeljka FT-MS. Pretiskano uz dozvolu Macmillan Publishers Ltd: Nature (24), autorska prava 2003.
 
Kako su ionizirani samo ioni, najvažnija reakcija u MS mogla bi biti ona kojom se analiti od interesa, a bez naboja, pretvaraju u ione plinske faze. Najstarija, najčešće korištena i vjerojatno najrazumljivija ionizacijska tehnika je elektronska ionizacija (EI) u kojoj je ispareni analit podvrgnut udaru, tj. “bombardiranju” energijskim elektronima (tipično 70 eV). Kako se analiti u EI trebaju pojaviti kao ispareni, to je svakako ionizacija izbora za analizu GC-MS. Tijekom posljednjih desetljeća razvijeno je nekoliko ionizacijskih tehnika za analize nehlapljivih i termički nepostojanih spojeva, uz ionizaciju elektroraspršenjem (engl. electrospray ionization, ESI) i ionizaciju potpomognutu matriksom uz desorpciju laserskim zračenjem (engl. matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI) kao primarnim metodama izbora. Kod ESI, ioni se stvaraju iz tekućine pri atmosferskom tlaku. Postava ionizacije elektroraspršenjem je tehnički jednostavna: šuplja igla kroz koju protječe izlazna tekućina (obično 1-1000 µL/min) je nabijena električnim potencijalom. Visoko polje na vrhu igle stvara stožasti tekući “polumjesec” iz kojega nastaju raspršene, visoko nabijene kapljice. Daljnje isparavanje kapljica rezultira stvaranjem iona. ESI ima neke vrlo dojmljive prednosti koje joj omogućuju primjenu kod vrlo različitih bioloških problema. Stvaranje višestruko nabijenih čestica proširuje dinamički raspon masenog spektrometra do 106 u i omogućuje analizu makromolekula. Nadalje, ESI se može smatrati vrlo “blagom” ionizacijskom tehnikom koja ne razara čak ni nekovalentno vezane biomolekularne komplekse kao što su proteini (31) i čak čitavi virusi (32). To je najvjerojatnije najkorišteniji ionizacijski izvor koji se kombinira s različitim sustavima analizatora HPLC-MS i CE-MS (33,34). Priličan nedostatak ESI, osobito kod pokusa s izravnom infuzijom (engl. direct infusion experiments, DIESI) je njena osjetljivost na supresijske učinke matriksa i iona, npr. kod koncentracija s mnogo soli u biološkim uzorcima ili visokokoncentriranim analitima koji mogu spriječiti ili ukloniti ionizaciju analita (35-37). Alternativa ESI, koja se često kombinira unutar istog izvora, je kemijska ionizacija uz atmosferski tlak (engl. atmospheric pressure chemical ionization, APCI).
Ionizacija započinje kružnim pražnjenjem iz igle koje stvara finu plazmu reagencijskih iona koje potječu iz hlapljivih tvari u izvoru (pomoćni plinovi i isparena otapala). Složeni uzastopni niz reakcija dovodi do najdjelotvornije ionizacije analita. APCI je poznat po osjetljivosti, robusnosti i pouzdanosti, te mnogo nižoj sklonosti za kemijske interferencije nego ESI (33).
Daljnja nova alternativa ESI je fotoionizacija uz atmosferski tlak (engl. atmospheric pressure photo ionization, APPI) koja se temelji na apsorpciji visokoenergijskog fotona proizvedenog u svijetlećem tijelu koje koristi električni luk (engl. discharge lamp) (38, 39). Premda sve ionizacijske tehnike s atmosferskim tlakom, tj. ESI, APCI i APPI, imaju značajne prednosti, treba uvijek imati na umu da sve tri pokazuju osjetljivosti koje su specifične za određene vrste spojeva: vrlo nizak broj dobivenih iona ne može se isključiti u pojedinim slučajevima.
Vidljivo različit način uvođenja analita u analizator masa čini osnovu ionizacije MALDI (40). Analit se istodobno kristalizira s matriksom, a ioni se stvaraju laserskim zračenjima. Izuzetna osobina MALDI je pulsna priroda lasera čije stvaranje “paketa” iona predstavlja odvojene događaje visoke osjetljivosti. Zbog kratkog trajanja tih pulseva broj iskoristivih masenih analizatora je ograničen jer su potrebne visoke brzine pregleda. MALDI je metoda izbora za analizu visokog protoka jer se mogu koristiti ciljane ploče sa stotinama uzoraka. Njena relativno visoka podnošljivost soli i pufera čini je metodom izbora za analizu složenih biogenih matriksa. Glavni nedostatak MALDI nalazi se u prirodi korištenih matriksa, osobito ako se moraju analizirati spojevi niske molekularne težine. Općenito, dok ionizacijske tehnike s atmosferskim tlakom (API) kao što su ESI, APCI i APPI pripadaju u “blage” ionizacijske tehnike koje uglavnom stvaraju spektre sa slabom fragmentacijom, višefazni ionski analizatori kao što su QqQ, Qq-TOF ili ionske stupice (vidjeti nastavak teksta) moraju se koristiti da bi se dobili fragmentirani ioni koji omogućuju identifikaciju analita usporedbom s referentnim materijalom.
Odabir iona
Prijenosni kvadropolovi koriste se kao maseni filtri primjenom precizno kontroliranih napona na suprotnim serijama polova. Promjenama napona na krajevima polova omogućuje propuštanje čitavog raspona masa na detektor u zadanom vremenu. Analizatori s kvadropolom su u prošlosti bili najčešće korišteni, osobito u kombinaciji s ionskim izvorom koji stvara strukturno značajne fragmente, kao npr. EI u platformama GC-MS. Iako kvadropolovi mogu mjeriti mase > 4000 u, zapravo su najprikladniji za primjenu masa < 1000 u. Značajan nedostatak kvadropolnih masenih analizatora je relativno mala brzina pregleda (< 4000 u/s). Zbog toga se u načinu rada koji uključuje potpuni pregled koristi samo mali udio raspoloživih iona, što takve analizatore čini nepogodnima za suvremena visokobrzinska izdvajanja s osjetno nižim širinama vršnih vrijednosti (engl. peak widths). Oni se također ne mogu koristiti kao selektori jako velikih masa u kombinaciji s MALDI. Spomenuta se situacija, međutim, doima potpuno drugačijom kad se tri kvadropola poredaju tako da je središnji nerazdvojivi kvadropol omeđen dvama prijenosnim kvadropolovima koji čine dvojni spektrometar masa - također poznat kao trostruki kvadropolni (QqQ) maseni spektrometar. Takav razmještaj omogućuje kontroliranu fragmentaciju iona u drugom kvadropolu koji se koristi kao sudarna stanica. Dobivena sekundarna raspodjela iona može poslužiti kao skup strukturnih parametara u identifikaciji analita. Nadalje, struktura QqQ omogućuje kombiniranje odabira iona, ionsku reakciju, te procese pregleda iona u novim pokusima, npr. visokospecifični ionski produkt, prethodnički ion, ili način potpunog snimanja bez gubitaka (engl. neutral loss scan mode). Praćenje odabrane reakcije (engl. selected reaction monitoring, SRM) kao ciljanog analitičkog pokusa najviše osjetljivosti i točnosti je metodološka osnova primjene spektrometrije masa u sudskoj medicini, farmaceutskoj industriji i kliničkoj kemiji, o čemu će se raspravljati u ovom pregledu (33,34,41).
Alternative prijenosnim kvadropolovima su Paulove ionske stupice koje se tehnički mogu smatrati varijacijama općeg dizajna kvadropolnoga masenog filtra. Ioni se zatvaraju (“hvataju u stupicu”) u tim uređajima elektrodinamičnim fokusiranjem. Za razliku od kvadropola gdje ioni imaju postojanu putanju do detektora, uhvaćeni ioni su prisiljeni napustiti stupicu prijelazom u nepostojane orbite povećanjem rf-napona. Sposobnost ionskih stupica za provedbu ponovljenih spektrometrijskih pregleda (MSn s N teorijski do 10) zasnovanih na sudaru analita unutar stanice, njihova lagana uporaba te relativno niska cijena učinila ih je čvrstim radnim pomagalom u mnogim laboratorijima. Iznimno povećana kvantitativna učinkovitost i dinamični raspon postignuti su razvojem linearnim ionskih stupica - dvodimenzionalnih Paulovih ionskih stupica koje zatvaraju ione u osnu dimenziju pomoću električnog polja na krajevima stupice. Kod takvih su stupica prednosti uglavnom povezane s optimiranjem sadržine u masenom analizatoru (42). TOF-maseni analizatori, koji su u načelu jedan od najjednostavnijih uređaja u spektrometriji masa, odvajaju ione na temelju njihove brzine koja je ovisna o masi. Svi se ioni odjednom stvaraju u ionskom izvoru i zatim se ubrzavaju kroz fiksni potencijal. Zbog toga ioni male mase pristižu u detektor prije od iona velike mase. Uobičajena varijacija TOF uključuje elektrostatično ogledalo, tj. reflektron, u području bez polja kako bi se nadoknadili učinci raspodjele kinetičke energije početnih iona. Analizator TOF je postao vrlo popularan u ranim danima MS no zbog toga što zahtijeva puls iona nije bio spojiv s ionizacijskim metodama dostupnima u to doba. Razvoj novih tehnika pulsne ionizacije kao što je MALDI doveo je do renesanse TOF-detektora tijekom 1990-ih. Danas se uglavnom koristi kao maseni analizator za “očitavanje” te je kombiniran s drugim TOF, ionskom stupicom, ili pak - najčešće, - s jednim ili dva kvadropola (Q-TOF ili Qq-TOF) ispred njega. Takvi se križani maseni spektrometri ističu neograničenim rasponom masa, izuzetno visokim brzinama pregleda (do 106 u/s), te visokom snagom razlučivosti koja rezultira točnošću mase u rasponu ppm. Stoga ti spektrometri predstavljaju tehniku izbora kod primjena koje zahtijevaju visok protok uz najvišu djelotvornost, kao što je slučaj u proteomici i metabolomici (24,25,34,43-45).
Spajanje na sustave kromatografskog razdvajanja
Spajanje HPLC i MS omogućuje analizu najrazličitijih spojeva, uključujući termički nepostojane analite i analite s visokom molekularnom težinom gdje je analiza pomoću GC-MS nemoguća. Komercijalno je dostupan široki raspon stacionarnih faza HPLC-a kako u smislu dimenzija kolone, tako i modifikacija površine, a to omogućuje optimiranje kromatografskog razdvajanja na medij koji se ispituje. Najnoviji razvoj ovog područja uključuje također nedavno uvođenje strojne podrške “ultra”-učinkovitosti koje bi moglo dovesti do značajnog smanjenja vremena analize. Spajanje tekućinske kromatografije i spektrometrije masa ograničava otapala u HPLC-u na hlapljive pufere i organske aditive radi izbjegavanja taloženja soli u masenom spektrometru. Zbog toga su natrijevi/kalijevi fosfatni puferi, koji su bili često korišteni kao otapala u HPLC-UV, morali biti zamijenjeni amonijevim formijatom ili acetatima.
Postavljanje uređaja HPLC-MS/MS
Maseni spektrometri su izuzetno složeni i skupi analitički uređaji. Unatoč tome, osiguranje uvjeta za analitički specifičnu spektrometriju masa predstavlja samo manji dio uspješne uspostave kvantitativnog rutinske analitičke primjene HPLC-MS/MS, s time da MS služi isključivo kao detektor. Zbog svojstava te aparature, osobito osjetljivosti na kontaminacije i bilo kakve nestalnosti okoline, uspješna primjena uvelike ovisi o prethodnoj obradi uzorka i kontroliranim uvjetima u okolini. Klimatizacija je kod spektrometrije masa obvezatna, posebice ako je izabrana mala prostorija. Dovodi plina i zraka pod pritiskom moraju udovoljiti zahtjevima proizvođača koji mogu premašivati kvalitete uobičajene u rutinskoj laboratorijskoj okolini. Komplikacije u analizi složenih uzoraka “iz stvarnog svijeta” mogu nastati zbog kromatografskih interferencija, učinaka medija, tvorbi adukata i nakupina, te potiskivanja iona zbog konkurentnih metabolita ili drugih sastojaka matriksa. Zbog toga je temeljito validiran protokol za pripremu uzorka, zasnovan na uzorku bolesnika, od izuzetne važnosti za održanje željene dugotrajne učinkovitosti mjerenja.
Dosta je često moguće optimirati eksperimentalne parametre na temelju prihvatljivih polaznih uvjeta koji se nalaze u stručnoj literaturi. Tu su uključeni parametri HPLC kao što su svojstva mobilne (otapala, aditivi za otapala, koncentracije pufera, pH...) te stacionarne faze, postavke za ionski izvor kojima se određuje koji ion izabrati kao matični ion, te koju ionsku reakciju pratiti (SRM). Nužni pokusi ručnim prilagođavanjem danas su obično podržani i vođeni programskom podrškom masenog spektrometra. Usto, svaki će od većih dobavljača masenih spektrometara vrlo rado pomoći stručnim znanjem svojih specijalista za primjenu ukoliko je potrebno razviti nove pretrage.
Osmišljenje analitičke platforme, osobito odabir sastavnica strojne podrške, ima snažan utjecaj na ukupan uspjeh uvođenja analize. Radni tok od primarnog neobrađenog uzorka do konačne otopine uzorka u bočici za HPLC mora se planirati isto toliko pažljivo kao i postavljanje kromatografskih uređaja koje predstavlja konačne korake pročišćivanja uzorka. Na temelju osjetljivosti dostupnoga masenog spektrometra, zatim odabranog pokusa (npr. SRM), te poznavanja ciljne koncentracije analita koja se prati u uzorku potrebno je provesti ili predkoncentraciju uzorka ili razrjeđenje uzorka kao primarni korak u pripremi uzorka. Stupanj automatizacije te veličina serije koju treba obraditi ovisiti će o potrebama laboratorija kao i raspoloživoj aparaturi. Visoki povrat analita iz matriksa mora se postići kako bi se osigurala robusnost i preciznost analiza. Uporaba internih standarda s najvećom mogućom fizikalno-kemijskom sličnošću ciljanim metabolitima je daljnja obveza u razvoju analiza HPLC-MS/MS. Konačno, nužno je uspostaviti komunikaciju između programske podrške uređaja i laboratorijskog informacijskog sustava, ako je to moguće. Dijagram toka u kojem je sažet čitav analitički proces od uzorka bolesnika do kvantitativnog rezultata LC-MS/MS prikazan je na slici 2.
 
Slika 2. Sažetak procesa analitičke platforme LC-MS/MS kojom se dobivaju rezultati kvantitativne analize.
 
Priprema uzorka
Endogeni metaboliti, kao i ksenobiotici, često se ili vežu na proteine u plazmi ili se integriraju u stanične membrane (npr. eritrocit) . Stoga je kvantitativno otpuštanje analita iz tih sastojaka matriksa preduvjet za uspješnu analizu. Kidanje staničnih membrana može biti prouzročeno bilo osmotskim šokom (dodatak destilirane vode) ili dodatkom divalentnih kationa teških metala kao što su cink ili bakar. Denaturacija proteina i daljnje taloženje obično se provodi dodatkom organskih otapala i potpomognuto je navedenim kationima (46). U većini slučajeva koristi se acetonitril ili metanol u konačnim koncentracijama > 50% (v/v). Za uzorke pune krvi, koji se susreću u slučaju TDM imunosupresiva (osim za mikofenolnu kiselinu) kombiniraju se oba pristupa. Najčešće se koristi umjereno (obično 1 + 2) razrjeđenje uzorka (tj. kalibrator, kontrola te alikvoti uzorka bolesnika) sa smjesom cinkovog sulfata/metanola (47-50). Alternativni protokol u dvije faze u kojem se koristi acetonitril u drugoj fazi razrjeđenja (konačno razrjeđenje 1 + 14) uspješno su proveli Keevil i suradnici (51,52) primjenjujući 10 μL alikvota uzorka i koristeći mikrotitarsku ploču. U međuvremenu se ta metoda proširila u struci te je uspješno primijenjena uz različite modifikacije (53,54). Drugi značajan protokol su predstavili Annesley i Clayton koji su dodali alikvot vode uzorku prije taloženja proteina radi sprječavanja sljepljivanja uzorka (55). Tijekom rada s uzorcima plazme/seruma i uzorcima s organskim otapalom, utvrđeno je da su protokoli za taloženje proteina dovoljni u većini slučajeva. Općenito, potrebno je postići da uzorak postane potpuno homogeniziran tijekom faze taloženja snažnim protresanjem; bilo kakvo stvaranje grudica značajno šteti kvaliteti analiza i treba ga izbjeći. Uklanjanje ostataka stanica i denaturiranih makromolekula provodi se centrifugiranjem, a postojan i čvrst talog je poželjniji radi omogućavanja jednostavnog odlijevanja supernatanta u bočicu za HPLC koja služi kao krajnji spremnik za uzorak. Otopina uzorka mora biti jasna i bez vidljivih kontaminacija. Kako je proteinski talog obrnuto povezan s temperaturama, uporaba centrifuga s hlađenjem (tj. 4 oC) rezultira poboljšanom kvalitetom uzorka.
Jedna od najizrazitijih razlika između analiza zasnovanih na kromatografiji i imunokemijskih analiza je uporaba internih standarda koji se moraju dodati u fazi pripreme uzorka. Ako se ispravno dodaju precipitacijskom otapalu, ti standardi nadoknađuju gubitke koji su tijekom postupka pripreme uzorka prouzročeni isparavanjem organskog otapala, pogreškama u rukovanju, ili opadajućom kromatografskom učinkovitošću ako su obuhvaćene i faze ekstrakcije. Usto, oni nadoknađuju nepreciznost svojstvenu sustavu uvođenja uzorka, prolazne nestalnosti procesa nastanka iona i - što je najvažnije, - drugih učinaka matriksa kao što je potiskivanje iona ako se istodobno ispiru s analitima. Vršni omjeri analita/internog standarda moraju se dobro uravnotežiti kako bi se izbjegle bilo kakve razlike u analizama zbog učinaka potiskivanja iona uzrokovanih internim standardom. Kako bi se ispunili kriteriji što veće kemijske sličnosti analitima, ti su spojevi ili postojani izotopno označeni derivati ili strukturni homolozi analita. Označavanje postojanih izotopa provodi se namjernim umetanjem izotopa 2H ili 13C u molekularnu strukturu kvantitativnom zamjenom određenih atoma 1H ili 12C (56). Na taj se način uvodi pomak molekularne mase i razlučuje interni standard od analita u masenom spektrometru. Ako označavanje postojanih izotopa nije odabrani postupak zbog prirode analita (tj. fungalni metabolit nastao fermentacijom u slučaju većine imunosupresiva i antibiotika), može se koristiti strukturni homolog. U slučaju TDM imunosupresiva, askomicin najčešće služi kao interni standard za takrolimus, a ciklosporin D za ciklosporin A. U oba slučaja interni standardi imaju istu veličinu i geometriju prstenastog sustava. Oni pokazuju samo fine razlike u jednom postranom lancu: metilnoj skupini u ciklosporinu A/D i metilenskoj skupini u slučaju takrolimusa/askomicina.
Priprema uzorka provodi se u serijama, s uzorcima za kontrolu kvalitete u svakoj seriji. Veličina serije ovisi o dostupnim uređajima; ograničenje može, primjerice, predstavljati broj mjesta za bočice u rotoru centrifuge. Radi omogućavanja nedvosmislene identifikacije uzorka kroz čitavu prijeanalitičku fazu, uporaba pojedinačnih reakcijskih posudica i bočica za HPLC može biti vrlo korisna. Ako se zamjena uzorka može isključiti drugim mjerama opreza (tj. dvodimenzijskim crtičnim kodovima), postupci obrade mogu se značajno pojednostaviti uporabom mikrotitarskih pločica s 96 jažica (51,52,57,58). Alikvoti uzorka mogu se staviti ili u jažice ručno ili pomoću robota za uzorke (59-61). Temeljem njihove široke uporabe u farmaceutskoj industriji, na raspolaganju su različite vrste pločica s jažicama i odgovarajućih tresilica, naprava za zatvaranje, te centrifugalnih rotora za pločice s jažicama. Suvremeni automatski uređaji za uzorkovanje omogućuju uzimanje alikvota izravno s mikrotitarskih ploča, čak i uz prisutnost taloga. Zbog toga je moguće izbjeći vremenski zahtjevan ručni prijenos uzoraka iz precipitacijske epruvete u bočicu u HPLC.
Pročćavanje uzorka
Nakon taloženja proteina i lize stanica matriks za uzorke ostaje toliko nečist da ga je nemoguće izravno umetnuti u vakuum masenog spektrometra. Ona se sastoji od sastojaka kako male, tako i velike molekularne težine koji obuhvaćaju široki raspon polariteta: hidrofilni (tj. aminokiseline, organske kiseline, peptidi, derivati šećera...), amfolitički (tj. fosfolipidi...) i hidrofobni (kolesterol, trigliceridi, lipidi...) metaboliti su prisutni bilo u otopini, bilo kao vezikule. Stoga se i za lipofilne (npr. lijekovi, endogeni steroidni hormoni) i hidrofilnije analite (npr. organske kiseline, kateholamini) najčešće primjenjuje dvodijelni protokol pročišćavanja uzorka u kojem se kombinira ekstrakcija na krutoj fazi (SPE) i analitički RP-HPLC kako bi se osigurali ponovljivi odgovori detektora.
Primjena neintegrirane SPE za pročišćavanje uzorka ili ugušćivanje analita je dobro uhodana tehnika koja se razvijala tijekom prošlih desetljeća kao alternativa protokolima ekstrakcije tekućina-tekućina. Danas je dostupno mnogo različitih materijala za kolone, od klasičnih materijala reverzne faze (RP-18) i lipofilnih polimera do faza izmjene aniona (SAX) i kationa (SCX). Ta se tehnika primjenjuje u većini analitičkih laboratorija i korištena je za gotovo bilo koji matriks (62,63). U kliničkom se laboratoriju često koristi kao tehnika ugušćivanja uzorka u kontekstu HPLC-analiza s UV ili fluorescentnom detekcijom. Može se koristiti u različitim formatima, od jednostrukih kolona SPE do ploča s 96 jažica (64). Nakon prethodnog kondicioniranja materijala za SPE dodaje se alikvot uzorka. Daljnjim se fazama ispiranja uklanjaju neželjeni sastojci matriksa. Na kraju se analit od interesa ispire iz kolone koja se obično odbacuje nakon jednokratne uporabe. Protok otapala kroz stacionarnu fazu SPE obično je potpomognut primjenom blagog vakuuma ili centrifugalnim silama. Radi se, međutim, o ručnoj metodi sa svim svojim nedostatcima: troši puno vremena i zahtjevna je s obzirom na uključenost osoblja. Ukoliko se traži veći protok uzoraka neintegrirani SPE treba zamijeniti integriranim metodama. To znači da metoda treba biti integrirana u postavu HPLC prije analitičke kolone korištenjem osmišljene izmjene kolona. Zbog toga je, pak, obvezno koristiti kolone SPE veće trajnosti i tlačne postojanosti, a potrebna je i uspostava protoka otapala koja omogućuje kontrolirani prijenos svih analita od prvoga do drugog elementa kolone. Najznačajnija kromatografska razlika prema neintegriranom SPE jest da se, kod rada na visokim brzinama protoka (< 4 mL/min), kod nekih od komercijalno dostupnih integriranih kolona za SPE (npr. proizvodi zasnovani na materijalu s ograničenim pristupom, engl. restricted access material, RAM) mogu pojaviti adsorpcijski učinci te učinci isključenja prema veličini (65,66). Stoga se sastojci makromolekularnog matriksa lagano uklanjaju, čak i kad pokazuju afinitet prema površini materijala za SPE u konvencionalnoj postavi SPE, kao što to čine denaturirani proteini.
Primjena integriranih kolona za pripremu u tekućinsku kromatografiju uvedena je prije više od 40 godina (67). Tijekom dva desetljeća takva je kolona našla primjenu od industrije do kliničke analize, i to počevši od TDM imunosupresiva (68,69), osim ostalih primjena (70,71). Njena široka uporaba u TDM imunosupresiva koje se temelji na spektrometriji masa započela je prije manje od 10 godina kada je nekoliko skupina istraživača skoro istodobno predstavilo svoje prve integrirane analize SPE-HPLC-MS i SPE-HPLC-MS/MS (48,50,72-74). Mogući plan postave integrirane SPE-HPLC-MS/MS, kao što je realiziran u našem laboratoriju, prikazan je na slici 3.
 
Slika 3. Shematski prikaz tehnike zamjene uzorka koja se često primjenjuje kod postava HPLC-MS/MS. Najprije se injicirani alikvot uzorka dovodi do koloneza SPE pomoću mobilne faze SPE-sisaljke. Analiti su zadržani na koloni za SPE dok se sastojci matriksa ispiru kao otpad. Ventil sa 6 ulaza kao prekidač dovodi do povratnog ispiranja analita iz kolone za SPE na analitičku kolonu za HPLC pomoću smjese mobilne faze HPLC-sisaljke. Tu su analiti odvojeni od glavnih izvora potiskivanja iona; prednji dio otapala i sastojci lipofilnog matriksa istodobno se ispiru iz kolone za SPE.
 
Obje stacionarne faze, i integrirana SPE-kolona i analitička HPLC-kolona, pune se odvojenom HPLC-sisaljkom i time se omogućava izmjena među mobilnim fazama ili stvaranje gradijenta mobilne faze u obje kromatografske dimenzije. Prijenos s jedne na drugu kolonu omogućen je uključenjem šestosmjernog ventila. Kako se dovođenje i pročišćavanje uzorka na SPE obično obavlja s istom mobilnom fazom, drugi kanal za otapalo (ako se koristi dvojna sisaljka) HPLC-sisaljke koja opslužuje kolonu za SPE može se koristiti za čišćenje/obnovu stacionarne faze SPE nakon svake analize (tj. ispiranjem s metanolom). Analiti zadržani na SPE prenose se u drugu kromatografsku fazu pomoću otapala kojega prosljeđuje HPLC-sisaljka; obrnuti protok (reverzno ispiranje, engl. back flush mode) dovodi do izoštrenog profila ispiranja sa SPE. Zbog dostupnosti dvaju (dvojna sisaljka) ili više kanala za otapala na HPLC-sisaljci moguće je proizvesti bilo koji željeni gradijent mobilne faze. To je od izuzetnog značaja ako je potrebno odvojiti analite pod istim tlakom ili ako treba odvojiti metabolite lijeka podložnog fragmentaciji ionskog izvora od matičnog lijeka koji se ispituje (48,75-77). Vrijeme ciklusa takve postave ovisi o fazi SPE (oko 1 minute), vremenu potrebnome za temeljito odvajanje analita u drugoj kromatografskoj dimenziji ako je ono potrebno (tj. ako treba odvajati analite pod istim tlakom), te vremenu za obnovu stacionarnih faza. U postavi našeg laboratorija koja se koristi za TDM imunosupresiva postignuto je ukupno vrijeme kromatografije od 2,6 minuta, uz vršno ispiranje analita između 1,2 i 1,5 minuta (Slika 4.).
 
 
Slika 4. Kromatogram dobiven pomoću HPLC-MS/MS niskostupanjskog, višekomponentnog kalibratora TDM imunosupresiva. I CV ponovljenih mjerenja (N = 6) i brojevi S/N pokazuju da je ova razina analita prilično iznad granice kvantifikacije pojedinačne analize koja je ustanovljena u našem laboratoriju.
 
Alternativno takvoj dvodimenzijskoj postavi HPLC, koja osigurava maksimalno pročišćavanje uzorka prije ulaza u maseni spektrometar, često se realizira i jednodimenzijski HPLC. Takva, pak, postava omogućava kraća vremena ciklusa, uz česta izvješća o vremenima zadržavanja ispod jedne minute za TDM imunosupresiva (51,52,54,60,61,78). Takva vrsta postave HPLC je znatno jeftinija i njome se rukuje lakše nego analizom koja uključuje tehnologije za izmjenu kolona. Stoga i nije iznenađujuće da ona predstavlja tehnološku osnovu trenutno na tržištu jedine analize za TDM koja se zasniva na HPLC-MS/MS i ima ovjeru CE te funkcionira bez prethodnog pročišćavanja uzorka na neintegriranoj SPE. Nedostatci takve postave mogu se vidjeti u nepotpunom pročišćavanju uzorka koje dovodi do neželjenih učinaka potiskivanja iona i povećanog zagađenja masenog spektrometra. Za izbjegavanje takvih problema korisno je primijeniti protokole za pročišćavanje uzorka utemeljene na neintegriranom SPE ili visoke omjere razrjeđenja uzorka u fazi taloženja proteina. Nadalje, zbog povećane kontaminacije kolone za HPLC preostalim sastojcima matriksa postiže se isključivo kratak vijek trajanja kolona - obično ispod 1000 injiciranja. Uz gore opisanu postavu integrirane SPE-HPLC-MS/MS ostvarenu u našem laboratoriju, kolone za SPE izdrže 2000 injiciranja matriksa, a kolone za HPLC se mogu koristiti za više od 6000 uzoraka. Time su troškovi za potrošni HPLC materijal (uključujući i bočice za HPLC) blizu 0,5 EUR po uzorku. To ujedno čini spektrometriju masa, unatoč visokim troškovima analitičke strojne podrške i laboratorijskih prilagodbi, čak i u financijskom smislu jakim konkurentom rutinskoj analitici zasnovanoj na imunokemijskim analizama, uz već dobro poznate kvalitativne prednosti kao što su poboljšana točnost, smanjena nepreciznost, te smanjeni učinci matriksa.
Danas predvidljivo kretanje u optimiranju analitičkih platformi za HPLC-MS/MS prema sve većem protoku uzoraka uključuje uporabu kolona s manjim unutarnjim promjerima napunjenu materijalima sa smanjenom veličinom čestica (1,8 μm) na koje se djeluje većim brzinama protoka i višim temperaturama. Međutim, zbog očekivanih viših povratnih tlakova, nužno je poboljšati i stupanj strojne opreme kako bi ispunila te povećane zahtjeve. Drugi trend uključuje spajanje dviju (ili više ako je to primjenljivo) neovisnih HPLC-jedinica u jedan maseni spektrometar, što se uobičajeno naziva “umnogostručenje”. Pri tome se HPLC-jedinica spaja na MS kroz ventil kao prekidač isključivo tijekom vremena ispiranja analita iz analitičke kolone. Tijekom uvođenja uzorka kao faze integrirane SPE te ponovljenog uravnoteženja SPE, takva se jedinica odvaja od MS omogućujući pripajanje drugog HPLC na MS. Radi toga radna programska podrška treba biti u stanju potpuno kontrolirati istodobno dva ili više sustava za HPLC (istovjetne preklapajuće metode; sisaljke moraju biti pod punim nadzorom čak i ako nisu integrirane u maseni spektrometar). Kontrolna programska podrška masenog spektrometra obično ne ispunjava te zahtjeve. Trenutačno je takvu postavu ostvario barem jedan neovisan prodavač opreme za HPLC.
Detekcija analita
U rutinskoj dvojnoj spektrometriji masa, primjena praćenja odabrane reakcije (SRM), koje je također poznato kao praćenje višestrukih reakcija (MRM), jest najčešće mjerenje kod MS/MS. Izlazna tekućina iz HPLC koji se sastoji od analita, sastojaka matriksa i mobilne faze dovodi se do izvora iona kroz čeličnu kapilaru koja služi kao elektroda. Tu svi sastojci matriksa koje je moguće ionizirati dobivaju naboj, dok veći dio otapala ostaje bez naboja i treba se ukloniti. Dodatci mobilnoj fazi, kao što su hlapljive organske kiseline i soli (npr. trikloroctena kiselina, mravlja kiselina, octena kiselina i njihove amonijeve soli) olakšavaju proces ionizacije prinosom iona. Odabir analita započinje već u ionskom izvoru jer su parametri strojne podrške (tj. temperatura izvora, potencijal za razdvajanje) usklađeni tako da je maksimalno povećana relativna količina iona željenog analita (tj. ion amonijeve skupine u slučaju imunosupresivnih lijekova). Nadalje se taj primarni ion odabire unutar prvog kvadropola. Zbog prirode tog procesa svi ionizirani sastojci medija pod istim tlakom s omjerom mase i naboja (m/z) koji je istovjetan analitu također se odabiru, dok su ioni s različitim vrijednostima m/z izbačeni iz ionske putanje. Reakcijom plinske faze u sudarnoj stanici primarni ion analita se razgrađuje u postupni niz produkata reakcije. Taj se proces može optimirati kako bi se povećao prinos odabranog ionskog fragmenta analita te se strogo kontrolira postavkama MS. Nadalje, očitava se omjer m/z samo sekundarnog iona u trećem kvadropolu te se prenosi na ploču detektora. Takva kombinacija tvorbe primarnog iona (izvora), odabira iona (kvadropol 1), tvorbe ionskog fragmenta (sudarna stanica) i odabira ionskog fragmenta (kvadropol 2) čini osnovu visoke selektivnosti dvojne spektrometrije masa. Tradicionalno se za analit bilježe dva SRM; jedan služi kao kvantifikator, a drugi (obično onaj manje osjetljivosti) kao dodatna kontrola kvalitete kojom se dokazuje identitet analita, pa se stoga naziva kvalifikator.
S obzirom da se u određenoj vremenskoj točci može zabilježiti samo jedan SRM (ne postoji istodobno mjerenje!), programska podrška masenog spektrometra mora kružiti kroz sve željene reakcije MS/MS u vremenskom okviru jedne milisekunde. Trajanje prikupljanja podataka za svaku odabranu ionsku reakciju, tj. period prekida, jest važan parametar za optimiranje analize koja mora pratiti niz analita. S jedne strane, osjetljivost masenog spektrometra opada s kraćim periodima prekida zbog relativnog porasta buke. Periodi prekida ispod 50 ms često se ne mogu primijeniti, premda ih je moguće lako ostvariti pomoću suvremenih uređaja. S druge strane, kromatografske vršne vrijednosti se ispiru tijekom sekundi u brzim analizama i širine tih vrijednosti < 10 s su većinom normalne. Kako je u kromatografiji dobro poznato da se vršna vrijednost analita treba karakterizirati s barem 10-15 točaka da bi se omogućila precizna integracija, povezana vremena ciklusa SRM trebala bi biti prilično ispod 1 s. Stoga - kao primjer izračuna s periodima prekida od 50 ms kod svih prijelaza, - nije moguće pratiti koeluirajuće vršne vrijednosti kod više od desetak SRM. To pak iznosi pet analita i jedan interni standard, ako se prate kvantifikatori i kvalifikatori.
Kako je pristup sa SRM usredotočen na pojedinačne analite, nije moguće promatrati istodobno isprane sastojke matriksa kao što su endogene komponente (tj. fosfolipid, kolesterol itd.) ili ksenobiotici (tj. lijekovi bilo koje vrste) koji mogu kvalitativno i kvantitativno varirati od bolesnika do bolesnika. Kako bilo koji element matriksa može uzrokovati neželjene gubitke signala zbog potiskivanja iona (35-37), takva pitanja moraju podrobno obraditi protokoli za validaciju metode HPLC-MS/MS. Kod uzoraka bolesnika sa svojstvima za koje je poznato da pokazuju analitičke interferencije u drugim rutinskim analizama (povišene koncentracije hemoglobina, bilirubina, triglicerida, kolesterola itd.) obvezatno treba provjeriti učinke potiskivanja iona, kao i kod lijekova koji se često koriste u bolesničkoj skrbi (tj. antivirusni ili antifungalni lijekovi u slučaju transplantiranih bolesnika). Pokusi s dodavanjima u kojima se koriste problematični uzorci bolesnika (tj. visoko ikterični ili lipemični uzorci) pojačani s poznatim koncentracijama ispitivanih analita omogućuju mjerenje razlika u ponovnom dobivanju signala analita u usporedbi s uzorcima zdravih ispitanika pod istovjetnim tretmanom, u što su uključeni i učinci potiskivanja iona te interferencije matriksa u fazi ekstrakcije. Pokusi koji se temelje na uštrcnoj crpki, a u kojima se uvodi postojani protok ispitivanih analita u izlaznu tekućinu u HPLC između kolone za HPLC i masenog spektrometra korištenjem t-komadnog priključka, predstavljaju drugu dobro procijenjenu mogućnost za ispitivanje učinaka potiskivanja iona (37). Uzorcima zdravih ispitanika, koji su bez analita koji se ispituju, dodaju se ksenobiotici u klinički relevantnoj koncentraciji. Primjenjuje se uobičajena priprema uzorka koja se koristi za rutinske analitičke uzorke te se otopine uzorka uvode u sustav HPLC-MS/MS. Kako bi se nastali kromatogrami trebali pojaviti kao ravne crte zbog stalnog protoka analita iz uštrcne crpke, bilo kakvo odstupanje od te idealne situacije (koja se može oponašati ispitivanjem injiciranja uzorka otapala) istovjetno je poremećaju signala zasnovanog na matriksu. Dodatne vršne vrijednosti, koje je moguće prosuditi kao križne reakcije, jedva da se zapažaju. Češće se zapaža iznenadan gubitak signala analita - potiskivanje iona. Ako se to događa sustavno, tj. u bilo kojem uzorku čak i bez dodatka ksenobiotika, potrebno je istražiti alternativne strategije pripreme uzorka. Učinci potiskivanja iona u prisutnosti lijeka koji se često daje zajedno s ispitivanim analitom su pogibeljniji. Ako se kromatografsko ispiranje odvija zajedno s analitom, ne mogu se isključiti neponovljivi kvantitativni rezultati analize TDM. U takvom slučaju treba provesti dodatna mjerenja kao provjeru bilo primjenom promijenjenih uvjeta kromatografije ili dodatnom provedbom SRM moguće interferirajuće tvari u pokusu.
Analiza podataka
Analiza baznih podataka kromatograma utemeljenih na HPLC-MS/MS obično uključuje fazu “poravnanja” podataka prije potpuno automatizirane identifikacije vršnih vrijednosti. Integracijski algoritmi se dostavljaju uz svaki maseni spektrometar i obično se cijele serije (npr. sve serije u istom danu) mogu obraditi unutar nekoliko minuta. Ipak, provjera cjelovitosti vršnih vrijednosti je nužna kao dio procesa tehničke validacije jer se pogoršanje procesa stvaranja iona, koje je obično rezultat kontaminacije ionskog izvora ili istrošenih prijenosnih kapilara, brzo ogleda u gubitku uzorka vršnih vrijednosti. Sve se vršne vrijednosti analita uspoređuju s odgovarajućim internim standardom, a omjeri područja vršnih vrijednosti čine osnovu za kvantifikaciju analita. Kadgod je to moguće, treba koristiti komercijalno dostupne kalibracijske i kontrolne materijale s ovjerom CE; kalibratori s više razina su obvezatni kod validacije analiza (barem ako se primjenjuje smjernica FDA (28) o validaciji bioanalitičkih metoda).
Kontrola kvalitete i održavanje
Osim provjera preciznosti i točnosti analize praćenjem kontrole kvalitete i podataka kalibratora kroz određeni period (Slika 5.), potrebno je provoditi i niz provjera strojne podrške kako bi se osigurala dugotrajna postojanost postave uređaja.
 
Slika 5. Dugotrajna postojanost analize HPLC-MS/MS za TDM imunosupresiva u Innsbrucku. Standardizirani grafovi odstupanja komercijalnog, s CE ovjerenog višeanalitnog kalibratora i materijala za kontrolu kvalitete koji sadrži ciklosporin A, takrolimus, sirolimus i everolimus, u kojima je sažet tromjesečni period mjerenja. Podatci (64 vremenskih točaka s 24 podatkovnih točaka za svaku) o višestupanjskom (N = 6) kalibratoru predstavljeni su kao postotno odstupanje od dodijeljene ciljane vrijednosti. Za uspješnu kalibraciju, 4 od 6 podatkovnih točaka moraju biti unutar granice od 15%. Višestupanjski (N = 4) podatci o kontroli kvalitete (181 vremenska točka unutar 24 podatkovne točke za svaku) prikazani su kao odstupanje vrijednosti z (korišteni su rasponi 2S određeni od proizvođača) od dodijeljene ciljane vrijednosti.
 
Obvezatan je i nadzor tlaka u kromatografskom sustavu jer je porast povratnog tlaka obično rani znak začepljenja kolona za HPLC zbog taloženja medija. Kolone za HPLC mogu se blokirati nakon dulje uporabe tako da preventivna zamjena može smanjiti isključenost uređaja iz rada. Kućište ionskog izvora treba često provjeravati radi vidljivih kontaminacija, te redovito čistiti pokretne dijelove strojne podrške koji štite MS radi izbjegavanja kontaminacija kvadropolova. Kvaliteta vakuuma ovisi o sustavu isisavanja; stoga se savjetuje česta provjera kvalitete ulja u prvom stupnju sisaljke. Glede postojanosti masenog spektrometra, djelotvornost prijenosa iona i razlučivosti mase trebali bi biti stalni kroz duga razdoblja u rutinskim analitičkim uvjetima. Preporučljivo je, ipak, provjeriti učinkovitost MS/MS provedbom pokusa usklađivanja prema uputama prodavača. Zadnje, ali ne i najmanje važno jest da se obvezatno treba procijeniti postojanost svake mobilne faze i materijala za pripremu uzoraka, uključujući i matičneotopine internog standarda, a pravila za pohranu uzoraka treba razviti ili primijeniti iz literaturnih podataka. Stalna izobrazba osoblja te dobro napisani protokoli za rad upotpunjuju skup mjera za kontrolu kvalitete kojima je cilj postojanost i dobro funkcioniranje uređaja za HPLC-MS/MS.
Usporedivost s imunokemijskim analizama
Posebne razlike zbog metode zapažene su između metoda HPLC-MS/MS i imunokemijskih analiza između različitih proizvođača za svaki praćeni imunosupresijski lijek. Čak i različite provedbe imunokemijskih analiza od strane iste tvrtke mogu pokazati značajne razlike u kvantitativnim rezultatima ako se međusobno usporede (najvjerojatnije zbog različitih korištenih antitijela i razlika u metodama detekcije), te prema HPLC-MS/MS. Te razlike ne samo da su bile opisane u literaturi (47,48,49,52) nego se ogledaju i u rezultatima programa testiranja dijagnostičke učinkovitosti u Europi i Sjevernoj Americi.
Kako se odstupanja prema HPLC-MS/MS uglavnom temelje na križnoj reaktivnosti antitijela u imunokemijskoj analizi s metabolitima lijeka (11,12,13,79,80), zapažena razlika predstavlja individualan parametar koji snažno ovisi o brzini metaboliziranja osnovnog lijeka. Odstupanja od bolesnika do bolesnika moraju se očekivati, kao i nestalnost razlika kod pojedinačnih bolesnika ako se prate kroz vrijeme zbog, primjerice, promjenljivosti općega zdravstvenog stanja ili promjena u koktelu istodobno uzetih lijekova. Kao posljedica toga srednje vrijednosti razlike pokazuju visoki koeficijent varijacije, tipično u rasponu od 20 do 30%. To čini “razliku zbog metode”, o kojoj je izvještavano u literaturi, nedjelotvornom u vođenju kliničara kroz promjenu metode kad su u pitanju imunokemijske analize. Stoga jedva da je korisno procijeniti utjecaj promjene analitičke platforme na korištene terapijske raspone. Prema našem osobnom uvjerenju i temeljem naših vlastitih zapažanja u laboratoriju, samo dulje usporedno mjerenje podataka iz TDM (potrebno je nekoliko tisuća podatkovnih točaka) na obje analitičke platforme, tj. “nove” i one koja se zamjenjuje - uključujući i stvaranje longitudinalnih profila bolesnika, - može uključenim kliničarima pružiti pouzdanje koje je potrebno za uspješno uvođenje nove analitičke metode kao što je HPLC-MS/MS za TDM imunosupresiva.
 
Zaključak
 
Maseni spektrometri su među najskupljim analitičkim uređajima primjenjivima za rutinsku analizu u kliničkim laboratorijima. Ipak, oni su konkurencija imunokemijskim analizama kako s obzirom na kvalitetu analize, tako i po troškovima po analizi. Analize koje se zasnivaju na dvojnoj spektrometriji masa visoko su selektivne i osjetljive; precizno mjerenje ciljanog analita bez križnih reakcija s bilo kojim drugim strukturno srodnim ili nesrodnim analitima je standardno. Rutinska analiza metodom HPLC-MS/MS u femtomolskom rasponu je provediva i time čini analize zasnovane na spektrometriji masa čak i osjetljivijima od mnogih danas dostupnih imunokemijskih analiza. U slučaju TDM imunosupresiva granica kvantifikacije može se lako sniziti za čimbenik 5-10 u usporedbi s bilo kojim dostupnim imunokemijskim analizama. Uporabom strategije obrade uzorka zasnovane na integriranim SPE-HPLC, troškovi po analizi mogu se smanjiti do ispod 1 EUR, a uz kraći vijek kolone, kao što je to slučaj u jednodimenzijskim postavama HPLC, moguće je dostići prag od 2 EUR po uzorku. To nas ostavlja s razlikovnim čimbenikom 5-10 u odnosu na komercijalne imunokemijske analize čime je, ako je protok uzoraka dovoljno velik, omogućena brza amortizacija početnih troškova za strojnu podršku od 250.000 - 300.000 EUR. Uzevši sve to u obzir, ciljana analiza zasnovana na HPLC-MS/MS zasigurno predstavlja nadu u budućnost rutinskih kliničkih analiza koja se već danas počinje ostvarivati. Može se očekivati da će svi glavni prodavači tijekom nadolazećih godina postajati sve svjesniji tog tržišta. Stoga će osnovna poboljšanja u strojnom rukovanju i programskoj podršci postati stvarna i paketi spektrometrije masa razviti će se iz instrumenata usmjerenih na istraživanja u rutinsku opremu. Prije ili kasnije može se očekivati da će biti dostupno nekoliko analiza s ovjerom CE, kao što je danas slučaj za analize zasnovane na HPLC-UV i HPLC-FLD, a možda ih čak i zamijeniti.
 
Literatura
 
 1.   Morris RG, Holt DW, Armstrong VW, Griesmacher A, Napoli KL, Shaw LM. Analytic aspects of cyclosporine monitoring, on behalf of the IFCC/IATDMCT Joint Working Group. Ther Drug Monit 2004;26:227-30.
 2.   Holt DW, Armstrong VW, Griesmacher A, Morris RG, Napoli KL, Shaw LM. International Federation of Clinical Chemistry/International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology Working Group on Immunosuppressive Drug Monitoring. Ther Drug Monit 2002;24:57-67.
 3.   Oellerich M, Armstrong VW, Schutz E, Shaw LM. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Clin Biochem 1998;31:309-16.
 4.   Tomita T, Homma M, Yuzawa K, Ohkohchi N, Hori T, Kaneko M, et al. Effects of hematocrit value on microparticle enzyme immunoassay of tacrolimus concentration in therapeutic drug monitoring. Ther Drug Monit 2005;27:94-7.
 5.   Homma M, Tomita T, Yuzawa K, Takada Y, Kohda Y. False positive blood tacrolimus concentration in microparticle enzyme immunoassay. Biol Pharm Bull 2002;25:1119-20.
 6.   Kuzuya T, Ogura Y, Motegi Y, Moriyama N, Nabeshima T. Interference of hematocrit in the tacrolimus II microparticle enzyme immunoassay. Ther Drug Monit 2002;24:507-11.
 7.   Armendariz Y, Garcia S, Lopez RM, Pou L. Hematocrit influences immunoassay performance for the measurement of tacrolimus in whole blood. Ther Drug Monit 2005;27:766-9.
 8.   Napoli KL. Is microparticle enzyme-linked immunoassay (MEIA) reliable for use in tacrolimus TDM? Comparison of MEIA to liquid chromatography with mass spectrometric detection using longitudinal trough samples from transplant recipients. Ther Drug Monit 2006;28:491-504.
 9.   Brown NW, Gonde CE, Adams JE, Tredger JM. Low hematocrit and serum albumin concentrations underlie the overestimation of tacrolimus concentrations by microparticle enzyme immunoassay versus liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Clin Chem 2005;51:586-92.
10.   Anonymous. Available at: http://www.bioanalytics.co.uk/html/latest_results.html. Accessed February 25th 2007.
11.   Armstrong VW. Principles and practice of monitoring immunosuppressive drugs. J Lab Med 2002;26:27-36.
12.   Yang Z, Peng Y, Wang S. Immunosuppressants: Pharmacokinetics, methods of monitoring and role of high performance liquid chromatography/mass spectrometry. Clin Appl Immun Rev 2005;5:405-30.
13.   Taylor P. Therapeutic drug monitoring of immunosuppressant drugs by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry. Ther Drug Monit 2004;26:215-9.
14.   Oellerich M, Armstrong V. The role of therapeutic drug monitoring in individualizing immunosuppressive drug therapy: recent developments. Ther Drug Monit 2006;28:720-5.
15.   Mueller CA, Weinmann W, Dresen S, Schreiber A, Gergov M. Development of a multi-target screening analysis for 301 drugs using a QTrap liquid chromatography/tandem mass spectrometry system and automated library searching. Rapid Commun Mass Spectrom 2005;19:1332-38.
16.   Kuhara T. Diagnosis and monitoring of inborn errors of metabolism using urease-pretreatment of urine, isotope dilution, and gas chromatography- mass spectrometry. J Chromatogr B 2002;781:497-517.
17.   Chace DH, Kalas TA. A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing. Clin Biochem 2005;38:296-309.
18.   Maurer HH. Multi-analyte procedures for screening for and quantification of drugs in blood, plasma, or serum by liquid chromatography-single stage or tandem mass spectrometry (LC-MS or LC-MS/MS) relevant to clinical and forensic toxicology. Clin Biochem 2005;38:310-8.
19.   Maurer HH, Peters FT. Toward high-throughput drug screening using mass spectrometry. Ther Drug Monit 2005;27:686-8.
20.   Smyth WF, Brooks P. A critical evaluation of high performance liquid chromatography-electrospray ionisation-mass spectrometry and capillary electrophoresis-electrospray-mass spectrometry for the detection and determination of small molecules of significance in clinical and forensic science. Electrophoresis 2004;25:1413-46.
21.   Hopfgartner G, Bourgogne E. Quantitative high-throughput analysis of drugs in biological matrices by mass spectrometry. Mass Spectrom Rev 2003;22:195-214.
22.   Hopfgartner G, Varesio E. New approaches for quantitative analysis in biological fluids using mass spectrometric detection. Trends Anal Chem 2005; 24: 583-9.
23.   Lenz EM, Wilson ID. Analytical strategies in metabolomics. J Proteome Res 2007;6:443-58.
24.   Aebershold R, Mann M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature 2003;422:198-207.
25.   Want EJ, Nordstroem A, Morita H, Siuzdak G. From exogenous to endogenous: the inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics. J Proteome Res 2007;6:459-68.
26.   Anonymous. Available at: http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/site/en/oj/1998/l_331/l_33119981207e.... Accessed February 15th 2007.
27.   Anonymous. Available at: http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/site/sl/dd/13/21/31998L0079SL.pdf. Accessed February 15th 2007.
28.   Anonymous. Available at: http://www.fda.gov/cder/guidance/4252fnl.pdf. Accessed February 15th 2007.
29.   Anonymous. Available at: http://www.ghtf.org/sg3/inventorysg3/sg3_fd_n99-10_edition2.pdf. Accessed February 15th 2007.
30.   Anonymous. Available at: http://www.ghtf.org/sg3/inventorysg3/sg3n15r82005.pdf, Accessed February 15th 2007.
31.   Talkington MT, Siuzdak G, Williamson JR. An assembly landscape for the 30S ribosomal subunit. Nature 2005;438:628-32.
32.   Bothner B, Siuzdak G. Electrospray ionization of a whole virus: analyzing mass, structure and viability. ChemBioChem 2004;5:258-60.
33.   Niessen WMA. Liquid Chromatography – Mass Spectrometry. In: Chromatographic Science Series. New York: Marcel Dekker; 1999;. p.31-70.
34.   Glish GL, Vachet RW. The basics of mass spectrometry in the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov 2003;2:140-50.
35.   Taylor PJ. Matrix effects: the Achilles heel of quantitative high-performance liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry. Clin Biochem 2005;38:328-34.
36.   Annesley TM. Ion suppression in mass spectrometry. Clin Chem 2003;49:1041-4.
37.   Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS. Anal Chem 2003;75:3019-30.
38.   Raffaelli A, Saba A. Atmospheric pressure photoionization mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 2003;22:318-31.
39.   Hanold KA, Fischer SM, Cormia PH, Miller CE, Syage JA. Atmospheric pressure photoionization. 1. General properties for LC/MS. Anal Chem 2004;76:2842-51.
40.   Hortin GL. The MALDI -TOF mass spectrometric view of the plasma proteome and peptidome. Clin Chem 2006;52:1223-37.
41.   Chace DH. Mass spectrometry in the clinical laboratory. Chem Rev 2001;101:445-77.
42.   Hopfgartner G, Varesio E, Tschaeppaet V, Grivet C, Bourgogne E, Leuthold LA. Triple quadrupole linear ion trap mass spectrometer for the analysis of small molecules and macromolecules. J Mass Spectrom 2004;39:845-55.
43.   Balogh MP. Debating resolution and mass accuracy. LC-GC North America 2004;22:118-28.
44.   Seger C, Sturm S. Analytical aspects of plant metabolite profiling platforms: current standings and future aims. J Proteome Res 2007;6:480-97.
45.   Hortin GL, Jortani SA, Ritchie JC, Valdes R, Chan DW. Proteomics: a new diagnostic frontier. Clin Chem 52;2006:1218-22.
46.   Polson C, Sarkar P, Incledon B, Raguvaran V, Grant R. Optimization of protein precipitation based upon effectiveness of protein removal and ionization effect in liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatgr B 2003;785:263-75.
47.   Koal T, Deters M, Casetta B, Kaever V. Simultaneous determination of four immunosuppressants by means of high speed and robust on-line solid phase extraction-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatgr B 2004;805:215-22.
48.   Streit F, Armstrong VW, Oellerich M. Rapid liquid chromatography-tandem mass spectrometry routine method for simultaneous determination of sirolimus, everolimus, tacrolimus, and cyclosporin A in whole blood. Clin Chem 2002;48:955-8.
49.   Ceglarek U, Lembcke J, Fiedler GM, Werner M, Witzigmann H, Hauss JP, et al. Rapid simultaneous quantification of immunosuppressants in transplant patients by turbulent flow chromatography combined with tandem mass spectrometry. Clin Chim Acta 2004;46:181-90.
50.   Vogeser M, Fleischer C, Meiser B, Groetzner J, Spohrer U, Seidel D. Quantification of sirolimus by liquid chromatography-tandem mass spectrometry using on-line solid-phase extraction. Clin Chem Lab Med 2002;40:40-5.
51.   Keevil BG, McCann SJ, Cooper DP, Morris MR. Evaluation of a rapid micro-scale assay for tacrolimus by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Ann Clin Biochem 2002;39:487-92.
52.   Keevil BG, Tierney DP, Cooper DP, Morris MR, Machaal A, Yonan N. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit 2002;25:757-67.
53.   Taylor PJ, Brown SR, Cooper DP, Salm P, Morris MR, Pillans PI, et al. Evaluation of 3 internal standards for the measurement of cyclosporin by HPLC-mass spectrometry. Clin Chem 2005;51:1890-3.
54.   Wallemacq PE, Vanbinst R, Asta S, Cooper DP. High-throughput liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of sirolimus in whole blood. Clin Chem Lab Med 2003;41:921-5.
55.   Annesley TM, Clayton L. Simple extraction protocol for analysis of immunosuppressant drugs in whole blood. Clin Chem 2004;50:1845-8.
56.   Leis HJ, Fauler G, Windischhofer W. Stable isotope labeled target compounds: preparation and use as internal standards in quantitative mass spectrometry. Curr Org Chem 1998;2:131-44.
57.   Arndt T, Guessregen B, Hohl A, Heicke B. Total plasma homocysteine measured by liquid chromatography-tandem mass spectrometry with use of 96-well plates. Clin Chem 2004;50:755-7.
58.   Ji Qin C, Todd Reimer M, El-Shourbagy Tawakol A. 96-Well liquid-liquid extraction liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the quantitative determination of ABT-578 in human blood samples. J Chromatogr B 2004;805:67-75.
59.   Vogeser M, Spoehrer, U. Automated processing of whole blood samples for the determination of immunosuppressants by liquid chromatography tandem-mass spectrometry. Clin Chem Lab Med 2006;44:1126-30.
60.   Poquette MA, Lensmeyer GL, Doran TC. Effective use of liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS) in the routine clinical laboratory for monitoring sirolimus, tacrolimus, and cyclosporine. Ther Drug Monit 2005;27:144-50.
61.   Lensmeyer GL, Poquette MA. Therapeutic monitoring of tacrolimus concentrations in blood: Semi-automated extraction and liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Ther Drug Monit 2001;23:239-49.
62.   Thurman EM, Mills MS. Solid-Phase Extraction: Principles and Practice. New York (NY): Wiley; 1998.
63.   Telepchak MJ, Chaney R, August TF. Forensic and Clinical Applications of Solid Phase Extraction. Totowa (NJ): Humana Press; 2004.
64.   McMahon LM, Luo S, Hayes M, Tse FLS. High-throughput analysis of everolimus (RAD001) and cyclosporin A (CsA) in whole blood by liquid chromatography/mass spectrometry using a semi-automated 96-well solid-phase extraction system. Rapid Commun Mass Spectrom 2000;14:1965-71.
65.   Georgi K, Boos K-S. Multidimensional on-line SPE for undisturbed LC-MS-MS analysis of basic drugs in biofluids. Chromatographia 2006;63:523-31.
66.   Ayrton J, Dear GJ, Leavens WJ, Mallett DN, Plumb RS. The use of turbulent flow chromatography/mass spectrometry for the rapid, direct analysis of a novel compound in plasma. Rapid Commun Mass Spectrom 1997;11:1953-58.
67.   Huber JFK, Van der Linden R, Ecker E, Oreans M. Column switching in high - pressure liquid chromatography. J Chromatogr 1973;83:267-77.
68.   Smith HT, Robinson WT. Semi-automated high-performance liquid chromatographic method for the determination of cyclosporine in plasma and blood using column switching. J Chromatogr 1984;305: 353-62.
69.   Nussbaumer K, Niederberger W, Keller HP. Determination of cyclosporin A in blood and plasma by column switching high-performance liquid chromatography after rapid sample preparation. J High Res Chromatogr 1982;5:424-7.
70.   Fitzgerald RL, Rivera JD, Herold DA. Broad spectrum drug identification directly from urine, using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Clin Chem 1999;45:1224-34.
71.   Werner G, Schneider V, Emmert J. Simultaneous determination of creatine, uric acid and creatinine by high-performance liquid chromatography with direct serum injection and multi-wavelength detection. J Chromatogr 1990;525:265-75.
72.   Vidal C, Kirchner GI, Wunsch G, Sewing K-F. Automated simultaneous quantification of the immunosuppressants 40-O-(2-hydroxyethyl)rapamycin and cyclosporine in blood with electrospray-mass spectrometric detection. Clin Chem 1998;44:1275-82.
73.   Kirchner GI, Vidal C, Winkler M, Mueller L, Jacobsen W, Franzke A, et al. LC/ESI-MS allows simultaneous and specific quantification of SDZ RAD and cyclosporine, including groups of their metabolites in human blood. Ther Drug Monit 1999;21:116-22.
74.   Christians U, Jacobsen W, Serkova N, Benet LZ, Vidal C, Sewing K-F, et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J Chromatogr B 2000;748:41-53.
75.   Streit F, Shipkova M, Armstrong VW, Oellerich M. Validation of a rapid and sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for free and total mycophenolic acid. Clin Chem 2004;50:152-59.
76.   Vogeser M, Spoehrer U. Pitfall in the high-throughput quantification of whole blood cyclosporin A using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Clin Chem Lab Med 2005;43:400-2.
77.   Vogeser M, Zachoval R, Spohrer U, Jacob K. Potential lack of specificity using electrospray tandem-mass spectrometry for the analysis of mycophenolic acid in serum. Ther Drug Monit 2001;23:722-4.
78.   Salm P, Taylor PJ, Lynch SV, Warnholtz CR, Pillans PI. A rapid HPLC-mass spectrometry cyclosporin method suitable for current monitoring practices. Clin Biochem 2005;38:667-73.
79.   Steimer, W. Performance and specificity of monoclonal immunoassays for cyclosporine monitoring: how specific is specific? Clin Chem 1999;45:371-81.
80.   Soldin SJ, Steele BW, Witte DL, Wang E, Elin RJ. Lack of specificity of cyclosporine immunoassays: results of a College of American Pathologists study. Arch Path Lab Med 2003; 127: 19-22.