Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Kratki pregledni članak:

Višnja Gašljević. Validacija i mjerna nesigurnost Biochemia Medica 2010;20(1):57-63.
Croatian Metrology Society, Zagreb, Croatia
Corresponding author: visnja [dot] gasljevic [at] hmd [dot] hr
 
Sažetak
 
Uvod: Izvananalitička faza izvor je najvećeg djela pogrješaka u laboratorijskoj praksi. Presječno istraživanje temeljeno na upitniku o učestalosti pojedinih postupaka izvananalitičke faze laboratorijskog rada učinjeno je među članovima Hrvatske komore medicinskih biokemičara (HKMB) u svrhu procjene stanja.
Materijali i metode: Anonimnim upitnikom s 20 pitanja zatvorenog tipa ispitana je učestalost (Likertova ljestvica; nikad = 1, rijetko = 2, često = 3 i uvijek = 4) pojedinih postupaka izvananalitičke faze laboratorijske dijagnostike među članovima HKMB (N = 538). Odgovori na pitanja izraženi su prosječnom ocjenom 1,00-4,00. Pitanja su nadalje podijeljena u tri skupine te je za svaku izračunata prosječna ocjena: kriteriji prihvatljivosti uzorka, postupci vađenja krvi, izvještavanje nalaza te pitanje o bilježenju nesukladnosti u radu.
Rezultati: Udio ispitanika koji su odgovorili na anketu bio je 27%. Od ukupnog broja ispitanika 93% su žene, 58% diplomirani inženjeri medicinske biokemije i 42% specijalisti medicinske biokemije. Prikupljeni su podatci o vrsti ustanove u kojoj djeluje laboratorij te o informatičkoj pismenosti ispitanika.
Prosječna ocjena svih postupaka (aritmetička sredina ± standardna devijacija) iznosila je 3,12 ± 0,38. Nema statistički značajne razlike s obzirom na vrstu ustanove, stupanj usavršavanja i informatičku pismenost niti povezanosti prosječne ocjene i dobi. Ocjena postupaka vađenja krvi (2,83 ± 0,46) najniža je od ocjena triju skupina pitanja (P < 0,001), slijedi ocjena izvještavanja rezultata (3,19 ± 0,48) te ocjena kriterija prihvatljivosti uzoraka (3,33 ± 0,49). Nesukladnosti u radu nikad ili rijetko bilježi 21% ispitanika, a često i uvijek 79%.
Zaključci: Rezultati upućuju na žurnu potrebu za unaprjeđenjem postupaka izvananalitičke faze laboratorijske dijagnostike, napose postupaka u svezi s vađenjem krvi. Za postizanje visokih standarda kvalitete nužna je intenzivna izobrazba sveg osoblja uključenog u sve faze laboratorijske dijagnostike.
 
Ključne riječi: validacija metoda; mjerna nesigurnost
 
Pristiglo: 13. studenog 2009.
Prihvaćeno: 31. prosinca 2009.
 
Uvod
 
Svaki imalo odgovoran analitičar prije uvođenja nove, nepoznate metode u rad, provest će njenu validaciju. Čini to zbog svoje profesionalne savjesti i težnje da daje vjerodostojne mjerne rezultate, tj. rezultate na temelju kojih će mjerodavne osobe moći donositi ispravne odluke. U skladu s definicijom u novome mjeriteljskom rječniku VIM 3 (engl. International Vocabulary of Metrology) (1), validacija nekog elementa (npr. mjernog postupka, metode) je osiguravanje objektivnih dokaza da taj element udovoljava zahtjevima koji su prikladni za neku jasno utvrđenu uporabu. Objektivni dokazi su zapisi o provedbi validacijskih eksperimenata.
Radne značajke metode i kriteriji prihvaćanja
Validacijski eksperimenti troše vrijeme i novac i zato ih je neizmjerno važno dobro isplanirati. U tom planiranju dva su nadasve kritična koraka:
- prepoznavanje bitnih radnih značajki metode za utvrđenu uporabu te metode; i
- postavljanje zahtjeva (kriterija) na te značajke, a opet uvažavajući utvrđenu uporabu te metode.
Radne su značajke metode:
- linearnost (mjerno područje);
- mjerna preciznost (označuje rasipanje rezultata u nekim uvjetima):
- mjerna ponovljivost - preciznost pod uvjetima ponovljivosti – isti analitičar, isti uzorak, isti mjerni sustav, isti radni uvjeti, kratko vremensko razdoblje (uobičajeni naziv koji se rabi u području medicinske biokemije je nepreciznost u seriji);
- međupreciznost (intermedijarna preciznost) – preciznost koja se postiže unutar istog laboratorija u duljem vremenskom razdoblju uz očekivane promjene (ponovljene kalibracije s različitim kalibratorima, razni analitičari, različita oprema) (uobičajeni naziv koji se rabi u području medicinske biokemije je nepreciznost iz dana u dan);
- mjerna obnovljivost - preciznost koja se postiže između laboratorija (uobičajeno se ne kvantificira kod validacije metode unutar laboratorija, ali je to bitan parametar kod normiranja metode);
- mjerna istinitost (kvalitativan pojam koji označava bliskost slaganja rezultata i referentne vrijednosti):
kvantitativni pokazatelji istinitosti mogu biti: procjena sustavne pogreške (b) i/ili iskorištenje;
- selektivnost;
- granica detekcije;
- granica kvantifikacije;
- robustnost metode.
Nije potrebno za svaku uporabu metode ispitati sve radne značajke, već samo one koje su bitne. Na primjer, kod metoda čija je zadaća otkriti ima li nečega u uzorku ili nema, analitičare će najvjerojatnije zanimati granica detekcije i selektivnost. Moraju li odrediti što je to u uzorku (identifikacija), od presudnog će značenja biti selektivnost. No, kada će morati izdati kvantitativan rezultat, zanimljivim postaju sve nabrojene radne značajke metode, osim granice detekcije. Često upotrebljavana krilatica da je opseg validacije kompromis troškova i rizika, ne odnosi se na odabir radnih značajki, već samo na broj i opseg eksperimenata s kojima će biti određene.
Laboratorijima u praksi ipak najviše problema predstavlja postavljanje kriterija prihvaćanja na radne značajke metode, a ne njihov odabir. Kriteriji bi se trebali odrediti prije provedbe validacijskih eksperimenta, uvažavajući sposobnost tumačenja rezultata dobivenih tom metodom, odnosno donošenja ispravnih odluka na temelju tih rezultata. Nažalost, učestala je praksa da se kriteriji postavljaju na temelju dobivenih rezultata iz validacijskih eksperimenata. Izjava koja se piše na kraju validacije da metoda zadovoljava za utvrđenu uporabu tada nema smisla.
Ciljana mjerna nesigurnost i kriteriji radnih značajki metode
Kada je neki rezultat kvantitativan, korisnički zahtjev odnosit će se na njegovu točnost. Kvantitativno taj zahtjev opisujemo ciljanom mjernom nesigurnošću (engl. target measurement uncertainty) koja predstavlja najveću dozvoljenu nesigurnost za neku određenu uporabu tog rezultata. Kako mjerna nesigurnost obuhvaća sve slučajne i nekorigirane sustavne pogreške, razumljivo je da će iznos ciljane mjerne nesigurnosti utjecati na definiranje kriterija na značajke kao što su ponovljivost mjerenja, intermedijarna preciznost (međupreciznost), obnovljivost, sustavna pogreška i/ili iskorištenje.
Mjerna nesigurnost
Mjerna se nesigurnost procjenjuje u skladu s međunarodno i multidisciplinarno harmoniziranim postupkom koji se naziva: Uputa za iskazivanje mjerne nesigurnosti (engl. Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement, GUM) (2), izdanim 1993. godine, ispravak 1995. U njegovu su nastanku surađivale sljedeće međunarodne organizacije: Bureau international des poids et mesures (BIPM), International Electrotechnical Commission (IEC), International Federation of Clinical Chemistry (IFCC), International Organization for Standardization (ISO), International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC), International Union for Pure and Applied Physics (IUPAP) i International Organization of Legal Metrology (OIML).
Prema GUM-u, svaka se sastavnica nesigurnosti kvantificira standardnim odstupanjem koje se, u tu svrhu, naziva standardna nesigurnost. GUM opisuje dva načina njihova procjenjivanja – A i B.
Ukoliko se standardno odstupanje (standardna nesigurnost) dobije primjenom neke statističke metode, govorimo o procjeni vrste A. Standardne nesigurnosti vrste A su standardno odstupanje (od aritmetičke sredine) niza mjerenja, rezidualno standardno odstupanje kalibracijske krivulje, standardno odstupanje određeno provedbom internih mjera kontrole kvalitete rezultata (kontrolne karte) i dr.
Primjeri izvora nesigurnosti koji se procjenjuju procjenom vrste B su kataloški podaci o granicama točnosti nekog instrumenta, raspon vrijednosti nekog kalibratora koje je dao njegov proizvođač, podaci iz umjernica instrumenata i dr. Iako se procjene vrste B temelje na stručnoj prosudbi procjenitelja te su stoga subjektivne, pouzdanost procjena pojedinih sastavnica nesigurnosti ne ovisi o načinu njihove procjene, već isključivo o kvaliteti informacije na temelju koje su procijenjene.
Mjerna nesigurnost rezultata dobiva se iz drugog korijena zbroja kvadrata pojedinačnih sastavnica nesigurnosti, uvažavajući njihove faktore osjetljivosti. Pritom se sve standardne nesigurnosti jednako matematički tretiraju, neovisno jesu li dobivene procjenama vrste A ili B. Rezultat se uobičajeno iskazuje s proširenom nesigurnošću, koja je umnožak sastavljene standardne nesigurnosti rezultata i faktora k koji osigurava dogovorenu obuhvatnu vjerojatnost, uobičajeno P = 95%.
Mjerna nesigurnost još je relativno neshvaćena u mnogim područjima mjerenja pa tako i na području medicinske biokemije. Ipak, kako je procjenjivanje mjerne nesigurnosti jedan od zahtjeva norme ISO 15189, sve se više prihvaća da pored radnih značajki metoda može biti jedan od indikatora kvalitete (3).
Kako uključiti podatke iz validacijskih eksperimenata u procjenu mjerne nesigurnosti?
Mjerna je nesigurnost svojstvo mjernog rezultata, a ne metode, opreme ili laboratorija, te je za očekivati da se procjenjuje tek kada se rezultat dobije. Očekuje li se da će glavni izvori pogrešaka biti unutar samog mjernog/ispitnog procesa, a ne npr. zbog nehomogenosti uzorka koji se ispituje, moguće je napraviti zadovoljavajuću procjenu mjernih nesigurnosti rezultata na temelju radnih značajka metode o preciznosti i istinitosti. Inicijalne informacije o radnim značajkama metode dobivaju se provedbom validacijskih eksperimenata.
Slučajne se pogreške kvantificiraju eksperimentima preciznosti te iskazuju kao standardna odstupanja (s), ili koeficijenti varijacije (KV). Od spomenute tri razine preciznosti (ponovljivost, međupreciznost i obnovljivost) u procjeni mjerne nesigurnosti na temelju validacijskih podataka, najzanimljivija je međupreciznost, jer uključuje puno šire izvore slučajnih pogrešaka nego li ponovljivost. Obnovljivost se ne određuje u validaciji koju provodi sâm laboratorij.
Istinitost metode koja se numerički iskazuje kao procjena sustavne pogreške b (engl. bias) određuje se preko eksperimenata u kojemu se uspoređuje referentna vrijednost (xref) i očekivana vrijednost koja se dobiva metodom (aritmetička sredina, x):
b = x – xref
Referentna je vrijednost najčešće certificirana vrijednost referentnog materijala (engl. Certified Reference Material, CRM) određena prikladno malom mjernom nesigurnošću te dokumentiranom mjeriteljskom sljedivošću. Referentni materijali moraju imati matriks što bliži matriksu originalnog mjernog materijala. Procjena sustavne pogreške može se odrediti i uz pomoć neke druge mjeriteljski bolje metode, ali to je praksi vrlo rijetko moguće.
1. slučaj: iskazivanje nesigurnosti uz korigiran rezultat
Temeljno načelo GUM-a je da se rezultat korigira s iznosom svih prepoznatih i značajnih sustavnih učinaka. Korigirani se rezultat (ykor) tada iskazuje kao:
ykor = y – b.
Korekcija je tehnički moguća i opravdana, ako je procjena sustavne pogreške (b) vrlo dobro određena (s malom mjernom nesigurnosti) te značajna po svom iznosu. Doprinos nesigurnosti zbog sustavne pogreške tada je samo nesigurnost korekcije ub:
 
gdje je s(x) eksperimentalno standardno odstupanje aritmetičke sredine, koje se određuje pomoću formule:
.
s(x) je eksperimentalno standardno odstupanje rezultata (x) koje daje ispitivana metoda kada joj se umjesto uzorka stavi referentni materijal poznate vrijednosti (xref). n je broj mjerenja iz kojeg je određena srednja vrijednost (x).
u(xref) je mjerna nesigurnost vrijednosti pridružene referentnom materijalu. Određuje se iz podataka koje je dao proizvođač referentnog materijala (procjena vrste B, GUM (2)).
Uključe li se i doprinosi slučajnih pogrešaka (preciznost s), mjerna je nesigurnost korigiranog rezultata:
 
gdje je:
s standardno odstupanje dobiveno iz eksperimenata međupreciznosti.
ub je sastavnica nesigurnosti zbog procjene sustavne pogreške.
Ponekad je ovu nesigurnost potrebno proširiti doprinosom izvora nesigurnosti koje nisu uključene u ove dvije sastavnice. Tipični su primjeri takvih izvora nesigurnosti: uzorkovanje, priprema uzorka, nehomogenost uzorka. Rezultat se iskazuje kao:
Y = ykor ± ku(ykor).
Uz pretpostavku Gaussove (normalne) razdiobe faktor k = 2.
2. slučaj: Iskazivanje nesigurnosti uz nekorigiran rezultat
Iako GUM (2) strogo preporučuje korekciju rezultata s prepoznatom sustavnom pogreškom, ponekad to nije niti praktično ni moguće. Korekcija rezultata može zahtijevati modifikacije softvera, a ako bi se provele ručno, postoji bojazan od pogrešaka, i sl. U takvim, više-manje izvanrednim slučajevima, kada nije praktično ili moguće korigirati rezultat, uz nekorigirani rezultat mjerenja iskazuje se nesigurnost uvećana za prepoznatu sustavnu pogrešku (b). Matematički to se može napraviti na više načina. GUM (2) savjetuje da se nesigurnost iz prvog slučaja uveća za prepoznatu sustavnu pogrešku te se rezultat iskazuje kao:
Y = y ± (ku(ykor) + IbI).
Eurolab (4) je skloniji statistički pridružiti procjenu sustavne pogreške preko modela:
 
Rezultat se tada iskazuje kao:
.
Postoje još neke druge metode iskazivanja rezultata. Odabrana metoda morala bi biti praktična za primjenu, razumljiva korisniku rezultata i ne bi smjela davati krivi dojam o veličini nesigurnosti. Npr. Eurolabovo rješenje (4) ne bi se smjelo primjenjivati u situacijama kada je b>>s.
Realnost procjene mjerne nesigurnosti
Opseg validacije temelji se na kompromisu rizika i troškova pa je i opseg eksperimenata rezultat takvog kompromisa. Najizraženije je to kod istraživanja međupreciznosti s. Da bi laboratorij dobio dobru aproksimaciju međupreciznosti, on mora prepoznati koji će čimbenici unijeti pogreške u mjerenje te ih tijekom validacije simulirati. U praksi najčešće se primjenjuje promjena dva faktora: osoblje i vrijeme, odnosno ponavljajuća mjerenja uobičajeno izvodi različito osoblje u nekoliko dana. Nerijetko se kasnije dokaže da je stvarna preciznost znatno lošija od one određene iz validacijskih eksperimenata.
Stoga, kada se mjerna nesigurnost procjenjuje na temelju podataka o radnim značajkama metode (odnosno mjernog/ispitnog procesa), nužno je osigurati njihov trajni (statistički) nadzor. Takvim se nadzorom dokazuje realnost procjena radnih značajki metoda, a time i valjanost procjene nesigurnosti, te uočavaju njihove promjene.
Osim internih mjera kontrole kvalitete bitno je i redovito sudjelovanje na međulaboratorijskim ispitivanjima jer se ponekad, samo na taj način, mogu otkriti u laboratoriju neotkrivene sustavne pogreške.
 
Zaključak
 
Mjerna nesigurnost je svojstvo mjernog rezultata, a ne metode, odnosno ispitnog/mjernog procesa. Pretpostavi li se da je ispitni/mjerni proces glavni izvor nesigurnosti, moguće je napraviti procjenu mjerne nesigurnosti na temelju njegovih radnih značajki. Prvu informaciju o njima dobivamo iz validacijskih eksperimenata. Nakon tog nužno je pratiti te radne značajke, kako bi se dokazala valjanost procjene. Primijeti li se da su se radne značajke promijenile, nužno je ažurirati procjenu novim podacima.
 
Literatura
 
1. International Vocabulary of Metrology – Basic and General Concepts and Associated Terms (VIM 3), JCGM 200:2008.
2. BIPM/IEC/IFCC/ISO/IUPAC/IUPAP/OIML: Guide to the expression of uncertainty in measurement, 1995.
3. Simundic AM, Topic E. Quality indicators. Biochemia Medica 2008; 18:311-9.
4. Measurement Uncertainty revisited: Alternative approaches to uncertainty evaluation, Eurolab, Technical report No.1, March 2007.