Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

ZR1-1

 
Samošćanec K. ZR1-1: Validacija kvalitativnih kromatografskih metoda. Biochemia Medica 2009;19(Suppl1):S85-S86.
 
Klinički zavod za kemiju, Klinička bolnica Sestre milosrdnice, Zagreb, Hrvatska
 
Adresa za dopisivanje: ksamosc1 [at] gmail [dot] com
 
Sažetak
Validacija je postupak ispitivanja pouzdanosti, točnosti i preciznosti metode. Ona je važan element svih metoda mjerenja pošto je usko povezana sa kvalitetom dobivenih rezultata. Mjerne metode karakteriziraju parametri kojima se procjenjuje analitička prihvatljivost. Oni moraju biti u skladu s prethodno definiranim zahtjevima. Svi parametri ovise o tipu i karakteristikama same metode. Konvencionalna klasifikacija metode dijeli na kvalitativne i kvantitativne. Prema definiciji kvalitativne metode su analize čiji odgovor je prisutnost ili odsutnost analita koji se mjeri bilo direktno, ili indirektno u točno određenoj količini uzorka. Rezultat se dobiva očitanjem signala mjerenja, uspoređivanjem odgovora na referentnu ili dogovornu vrijednost. Rezultat je binaran (da/ne; prisutan/odsutan). Referentni materijal može biti vanjski ili unutarnji. Vanjski referentni materijal je dobro karakteriziran (certificirani referentni materijal), dok unutarnji referentni materijal može biti ili dobro obrađen uzorak poznatih vrijednosti ili komercijalan uzorak koji se nalazi u komercijalnim pakiranjima testa.
Kvalitativni parametri se moraju pažljivo prepoznati i odabrati prema zahtijevima metode. Oni su uključeni u pojedinosti koje su povezane s informacijama koje želimo dobiti: verifikacija sljedivosti, određivanje netočnosti povezane s rezultatom (lažno pozitivni/lažno negativni), osjetljivost i specifičnost, selektivnost: interferencije, granica detekcije, područje nepouzdanosti i robusnost metode.
Sljedivost prema definiciji Eurachema je svojstvo rezultata mjerenja ili vrijednosti standarda koje su povezane s referentnim materijalom, obično nacionalnih ili internacionalnih standarada, putem neprekidnog niza uspoređivanja. Odnosno, sljedivost možemo procijeniti uspoređivanjem rezultata dobivenih ili refernetnom metodom ili korištenjem referentnog materijala.
U okvirima kvalitativne analize osjetljivost i specifičnost predstavljaju sposobnost testa za razlikovanje stvarno pozitivnih (osjetljivost) od stvarno negativnih (specifičnost) uzoraka. Visoka osjetljivost i specifičnost nekog testa osigurava izbjegavanje lažnog rezultata. Mora se voditi računa o selektivnosti koja je usko povezana sa specifičnošću i lažno pozitivnim rezultatima. U slučaju utjecaja reagensa i matriksa uzorka govorimo o slaboj selektivnosti samog testa: što je viša selektivnost to je veća vjerojatnost identificiranja analita u uzorku. Proizvođač je također obavezan objaviti spisak kemijski sličnih supstancija koje ne izazivaju križne reakcije.
Kako je rezultat kvalitativne metode binaran, parametar mjerne nesigurnosti u kvantitativnim analizama je zamijenjen sa područjem nepouzdanosti u kvalitativnim analizama jer bolje opisuje područje u kojem postoji veća vjerojatnost pogreške. U kvalitativnim testovima s uzorkom poznate koncentracije (kalibrator/kontrola) najbolje se definira područje oko granične vrijednosti (cut-off: COV). Područje nepouzdanosti se definira dobivenim parametrima osjetljivosti i specifičnosti. Broj lažno (+) pozitivnih i lažno (-) negativnih rezultata možemo procijeniti modificiranjem COV, tj. smanjiti broj lažno (-) negativnih rezultata smanjenjem COV, odnosno smanjiti broj lažno (+) pozitivnih povećanjem COV. Robusnost je osnovno analitičko svojstvo kojim je opisana postojanost binarnog rezultata u odnosu na neznatne promjene eksperimentalnih uvijeta (promjena količine uzorka, pH, vremena izvođenja, temperature, postotka otapala i slično).
 
 
ZR1-2
 
Granić P. ZR1-2: Validacija kvantitativnih kromatografskih metoda. Biochemia Medica 2009;19(Suppl1):S86.
 
Zavod za farmakokinetiku i analitičku toksikologiju, Klinički bolnički centar Zagreb, Zagreb, Hrvatska
 
Adresa za dopisivanje: pgranic [at] kbc-zagreb [dot] hr
 
Sažetak
Kromatografske se metode često koriste za kvantitativne i kvalitativne analize lijekova, produkata lijekova i spojeva u biološkim tekućinama.
Validacija metode je proces kojim se metoda provjerava od strane onog tko ju je razvio ili od strane korisnika. Metode su ponovljive kada ih koriste i drugi analitičari na drugoj jednako vrijednoj opremi, u drugo vrijeme ili na drugoj lokaciji. Postupak vakidacije može biti učinjen u početku razvojnog ciklusa, ali može ići i dalje u obliku revalidacije ukoliko dođe do promjena u metodi.
Parametri validacije kvantitativnih kromatografskih metoda su: točnost, granica detekcije, granica kvantifikacije, linearnost, preciznost, obnovljivost, pouzdanost, stabilnost supstance, analitička specifičnost/selektivnost.
 
 
ZR1-3
 
Gašljević V. ZR1-3: Mjerna nesigurnost i validacija metoda. Biochemia Medica 2009;19(Suppl1):S87.
 
Hrvatsko mjeriteljsko društvo, Zagreb, Hrvatska
 
Adresa za dopisivanje: visnja.gasljevic@hmd.t-com.hr
 
Sažetak
U današnjemu globalnome svijetu važnost točnih, pouzdanih i usporedivih mjernih rezultata od vitalnog je značaja. Stoga i norme koje propisuju zahtjeve na rad laboratorija (ISO/IEC 17025, ISO 15189) traže mjeriteljski pristup procesu mjerenja, zahtijevajući validaciju/verifikaciju metoda, osiguranje mjeriteljske sljedivosti, poznavanje mjerne nesigurnosti, praćenje trendova u mjernim procesima i sl.
Donošenje ispravne odluke je li neka metoda prikladna za određenu svrhu (validacija) kao i realno procjenjivanje mjernih nesigurnosti mogući su samo uz dobro poznavanje mjernih procesa. „Dobrotu“ mjernog procesa određuje iznos slučajnih i sustavnih pogrešaka. Eksperimenti koje provodimo u svrhu validacije metode mogu dati dobar uvid u njihovu veličinu, ali i izvore pa stoga mogu poslužiti i pri procjenjivanju mjernih nesigurnosti. U ovome članku opisano je kako ciljana mjerna nesigurnost može utjecati na postavljanje kriterija na parametre pri validaciji metode kao što su: ponovljivost mjerenja, intermedijarna preciznost (međupreciznost), sustavna pogreška (iskorištenje) te na koji način rabiti validacijske eksperimente za procjenjivanje mjernih nesigurnosti rezultata.
 
 
ZR1-4
 
Nikolac N. ZR1-4: Statistička obrada validacija u analitičkoj toksikologiji. Biochemia Medica 2009;19(Suppl1):S87-S88.
 
Klinički zavod za kemiju, Klinička bolnica Sestre milosrdnice, Zagreb, Hrvatska
 
Adresa za dopisivanje: nora [dot] nikolac [at] gmail [dot] com
 
Sažetak
Validacija analitičkog postupka u laboratoriju uključuje potvrđivanje netočnosti, nepreciznosti, linearnosti, utjecaja interferencija, te ukoliko je u laboratoriju prisutan paralelni analitički sustav, njihovu međusobnu usporedbu.
Mjerenje netočnosti uključuje usporedbu rezultata mjerenja sa poznatim ciljnim vrijednostima. Rezultat se izražava kao postotak odstupanja (engl. bias) i ukazuje na postojanje sustavne pogreške. Test iskorištenja (engl. recovery test) kao mjera točnosti ispituje postojanje proporcionalne sustavne pogreške dodavanjem poznate količine mjernog analita u uzorak.
Nepreciznost se ispituje ponovljenim mjerenjima unutar serije i između serija. Kao rezultat se za kvantitativne metode izražava srednja vrijednost, standardna devijacija i koeficijent varijacije, a za kvalitativne postotak rezultata koji odstupaju od najčešće dobivene vrijednosti. Ispitivanje nepreciznosti otkriva postojanje slučajnih pogreški.
Potvrđivanje linearnosti (samo za kvantitativne metode) uključuje mjerenje različitih koncentracija dobivenih razrjeđivanjem uzoraka, kako bi se odredio raspon koncentracija unutar kojih rezultati pokazuju linearnu međuovisnost. Podaci se analiziraju linearnom regresijom i izračunavaju se koeficijent regresije i koeficijent determinacije. Međutim, u nekim slučajevima koeficijent determinacije može biti vrlo visok (0,98), a da ovisnost nije linearna nego zvonolika, što se može uočiti prikazom reziduala.
Rezultate usporedbi dvaju paralelnih analitičkih postupaka za kvantitative metode najčešće prikazujemo Bland-Altmanovim grafikonom i Passing-Bablok regresijom.
Postoji nekoliko načina prikaza Bland-Altmanovog grafikona, a najčešće se na apscisu nanose srednje vrijednosti mjerenja analita u uzorku dvjema metodama, a na ordinatu razlika između dva mjerenja. Ukoliko se sva mjerenja nalaze unutar ± 1,96 SD, metode su podudarne. Ovaj je prikaz pogodan za otkrivanje sistemske pogreške i vrijednosti koje znatno odstupaju (engl. outliera).
Passing-Bablok regresija je statistički postupak usporedbe dviju varijabli, kada nije poznato koja je varijabla zavisna, a koja nezavisna. Kao rezultat izračunava se jednadžba pravca, koja je definirana koeficijentom smjera i odsječkom na osi x uz pripadajuće intervale pouzdanosti. Vrijednosti intervala pouzdanosti izuzetno su važne za interpretaciju rezultata: ako interval pouzdanosti za odsječak na osi x ne obuhvaća nulu, znači da postoji stalna razlika u mjerenjima između dviju metoda; ako interval pouzdanosti koeficijenta smjera pravca ne obuhvaća jedinicu, postoji proporcionalna razlika u mjerenjima. Također je potrebno izračunati i Pearsonov koeficijent korelacije (r). Treba imati na umu da je interpretacija koeficijenta korelacije različita u odnosu na korelacije u biološkim sustavima pa za zadovoljavajuću korelaciju dviju metoda koeficijent korelacije treba biti barem 0,95.
Ukoliko se radi međusobna usporedba dviju kvalitativnih metoda, prikaz i obrada rezultata znatno su jednostavniji. Stupanj slaganja se prikazuje kao postotak mjerenja u kojima je dobiven isti rezultat objema metodama.
Specifičnosti analitičke validacije kromatografskih metoda osim standardnih parametara uključuju određivanje i nekih dodatnih specifičnih parametara: selektivnosti, raspona mjerenja, granice kvantifikacije (engl. limit of quantitation, LOQ), granice detekcije (engl. limit of detection, LOD) i robusnosti metode.