Contact

Ana-Maria Šimundić
Editor-in-Chief
Clinical Institute of Chemistry
Sestre milosrdnice University hospital
Vinogradska 29
10 000 Zagreb, Croatia

Phone: +385 1 3787 184
Fax: +385 1 3768 280

e-mail address: editorial_office [at] biochemia-medica [dot] com
 

Useful links

Events

molekularna dijagnostika

Pregledni članak

 

Simona Jurkovič1, Joško Osredkar1, Janja Marc2. Molekularni utjecaj glutation-peroksidaza u antioksidacijskim procesima. Biochemia Medica 2008;18(2):162-74.

 

1 Klinički zavod za kemiju i biokemiju, Sveučilišni medicinski centarLjubljana”, Ljubljana, Slovenia

2 Farmaceutski fakultet Sveučilišta u Ljubljani, Ljubljana, Slovenia

 

*Adresa za dopisivanje: janja [dot] marc [at] ffa [dot] uni-lj [dot] si

 

Sažetak

Reaktivni radikali kisika (ROS) stvaraju se tijekom različitih patoloških procesa u povećanim koncentracijama. Oni su uzrok peroksidacije lipida i oksidacije DNA i proteina zbog svoje visoke kemijske reaktivnosti. Međutim, mehanizmi antioksidacijske zaštite, uključujući različite antioksidacijske enzime, sprječavaju oštećenja tkiva i druge komplikacije povezane s ROS. Ovaj je pregled usredotočen na učinke različitih glutation-peroksidaza (GPX) na molekularnu kontrolu toksikološkog djelovanja reaktivnih kisikovih radikala. Nadalje, opisuju se specifična biokemijska svojstva, sinteza i uloga svakog izoenzima glutation-peroksidaze u biološkim procesima. Male molekule koje djeluju kao oponašatelji aktivnog mjesta glutation-peroksidaza mogle bi postati novo sredstvo u liječenju mnogih oboljenja.

Ključne riječi: antioksidacijski proces, glutation-peroksidaza, motiv SECIS, glutation, selen, izoenzimi

Pristiglo: 22. siječnja 2008.                                                                                                                       Prihvaćeno: 18. travnja 2008.

 

 Uvod

Proteklih je 20 godina pridana velika pozornost ulozi oksidacijskog stresa kojeg uzrokuju reaktivni radikali kisika (engl. reactive oxygen species, ROS) te razlikama u antioksidacijskim mehanizmima između pojedinaca, posebice kod bolesti koje ovise o dobi kao što su karcinom, artritis, ateroskleroza, neurodegenerativni poremećaji i dr. (1,2).

Antioksidacijska zaštita je važna u uklanjanju slobodnih radikala jer osigurava maksimalnu zaštitu bioloških mjesta kao što su tiolne skupine koje su dio aktivnih mjesta u nekim metabolizirajućim enzimima (2,3). Dobar antioksidans specifično potiskuje slobodne radikale, kelira redoks-metale, međusobno djeluje s drugim antioksidansima unutar antioksidacijske mreže, ima povoljan učinak na izražaj gena, lako se apsorbira, ima fiziološki relevantnu koncentraciju u tkivima i biološkim tekućinama, te djeluje i u vodenim i/ili membranskim domenama (2). Najdjelotvorniji enzimski antioksidansi obuhvaćaju superoksid-dismutazu, katalazu i glutation-peroksidazu. Neenzimski antioksidansi uključuju tiolne antioksidanse (glutation, tioredoksin i lipoičnu kiselinu), vitamin C, vitamin E, karotenoide, prirodne flavonoide, te druge spojeve (selen) (4).

Ovaj je pregled usredotočen na skupinu enzima, tj. glutation-peroksidaze (GPX), koji predstavljaju glavne enzime u mehanizmu antioksidacijske zaštite ovisnom o glutationu. Specifična biokemijska obilježja, sinteza i uloga svakog izoenzima GPX opisana su u biološkim procesima. Identificirano je barem 7 vrsta GPX (5,6) i njihova su obilježja prikupljena u tablici podijeljenoj na sljedeće vrste: citosolne (cGPX ili GPX1), gastrointestinalne (GI-GPX ili GPX2), plazmatske (pGPX ili GPX3), fosfolipid-hidroperoksidne (PHGPX ili GPX4), te glutation-peroksidaze GPX5 i GPX6. Nadalje, dan je i prikaz neenzimskih antioksidansa uključenih u aktivnost GPX.

 

Biosinteza glutation-peroksidaza

Biosinteza glutation-peroksidaza je slična biosintezi svih selenoproteina koja ovisi o dostupnosti selena (Se). Godine 1973. utvrđeno je da je Se strukturna sastavnica aktivnog središta životinjskog enzima stanične glutation-peroksidaze (GPX1) (6,7). Otada je identificirano 30 novih selenoproteina, od kojih je 15 pročćeno te im je karakterizirana biološka funkcija (7-9).

Selen se kao selenocistein (Sec) ugrađuje u aktivno mjesto rastućeg višepeptidnog lanca kojeg kodira UGA. Kotranslacijska ugradnja Sec u selenoproteine uzrokuje znatne probleme stanici koja mora prepoznati UGA kao Sec-kodon, a ne kao translacijski STOP-signal (10-12).

Kloniranje GPX1 je dovelo do identifikacije specifičnog eukariotskog Sec-insercijskog sekvencijskog (SECIS) elementa kao strukture s ukosnicom smještene na 3’ neprevedenim regijama (UTR) mRNA glutation-peroksidaze. Element SECIS, koji predstavlja aktivnu točku, jest signal koji iznova kodira UGA kao dio okvira od Stop-signala do Sec-kodona (13). Takav složeni slijed selenu očito pruža mnogo mogućnosti za posttranskripcijsku regulaciju biosinteze selenoproteina. Međutim, pomanjkanje selena rezultira preranim dovršetkom lanca na kodonu UGA te povećanom razgradnjom mRNA selenoproteina (14).

Najmanja regija koja je potrebna za funkciju SECIS su očuvani slijedovi 5’ A/GUGA i 3’ GA. Za tu je regiju naknadno dokazano da tvori nestandardne (engl. non-Watson-Crick) parove baza: purinske parove između GA na 5’ bazi peteljke (u očuvanom slijedu A/GUGA) te GA u 3’ bazi, kao i pirimidinske parove koji su granični za ta dva para. Ispostavilo se da slična nestandardna obilježja parova baza služe kao vezna mjesta za nekoliko sekvencijski i strukturno specifičnih RNA-veznih proteina. U SECIS-elementima su očuvani adenozini sadržani u jednostavnoj otvorenoj omči (10,15) (Slika 1).

 

Slika 1. Ova slika prikazuje oblik elementa I SECIS (GPX1). Očuvani slijed i strukturna obilježja uključuju središnje SECIS-nukleotide (A/GUGA i GA), duljinu peteljke, te očuvane adenozine u završnoj omči (označeno kao adenosine loop). Tanke crte naznačuju Watson-Crickove parove baza dok podebljane crte označuju ne-Watson-Crickovo – nestandardno sparivanje. Oblik elementa SECIS II ima dvije peteljke, odvojen je regijom poqlyA i tipičan je za GPX3 i GPX4.

 

Umetak Sec u eukariota iziskuje zasebne čimbenike prevođenja koji uključuju Sec tRNA i čimbenik produljenja uz RNA-element u 3’-neprevedenom odsječku mRNA koji pak usmjerava ugradnju Sec kao odgovor na sve kodone UGA unutar okvira. U stanicama sisavaca taj je proces u velikoj mjeri reguliran te reagira na dostupnost selena na razini postojanosti i prevođenja RNA (11,13,14). Za spajanje Sec od najveće je važnosti SECIS-specifični vezni protein 2 (engl. SECIS binding protein 2, SBP2) koji također veže čimbenik produljenja EFsec sa specifičnošću za selenocisteil-tRNA (tRNA(Ser)Sec). SBP2 se veže za očuvanu regiju s ne-Watson-Crickovim parovima baza u peteljci elementa SECIS i ostaje vezan tijekom višestrukih ciklusa prevođenja selenoproteina. tRNA(Ser)Sec se aminoacilira sa serinom koji se kasnije pretvara u Sec (13,16,17).

Kao što je prikazano na Slici 2., element SECIS privlači SBP2 u jezgri, a kompleks SECIS-SBP2 može privući kompleks EFsec-tRNA i uputiti ga prema ribosomu u kodirajućoj regiji. Činjenica da je element SECIS smješten u 3’ UTR u eukariota, a ne u kodirajućoj regiji kao u prokariota, uklanja potrebu za disocijacijom i ponovnim spajanjem kompleksa SECIS-SBP2 sa svakim ugradbenim ciklusom. Takav sustav može omogućiti ponovno stvaranje kompleksa SECIS-SBP-EFsec-tRNA iz dva pojedinačna kompleksa RNA-protein nakon svakog popunjavanja ciklusa EFsec-tRNA za sljedeći približavajući ribosom. Ujedno je povoljan kod prevođenja proteina koji sadrži višestruke ostatke Sec poput selenoproteina P (5,11,13).

 

Slika 2. Spajanje Sec pomoću GPX vođeno s 3’ UTR. Otvoreni okvir čitanja eukariotske mRNA selenoproteina označen je crnom prugom, s ribosomom (označeno točkicama) koji dekodira kodon UGA Sec. UTR su naznačeni tankom crnom crtom. Kompleks SECIS-SBP2-EFsectRNA prikazan je sastavljen u 3-UTR uz savijanje unazad prema ribosomu.

 

 Tablica 1. Geni koji su potrebni za sintezu selenoproteina u eukariota

 

Specifična t-RNA(ser)sec se najprije opterećuje serinom, zatim pretvara u selenocisteil- tRNA(Ser)Sec sa selenofosfatom kao davateljem selena i vezanim sa svojom antikodonskom regijom na kodon UGA mRNA (14,15).

Zanimljivo je da izgleda da je postojanost mRNA povezana s djelotvornošću relevantnih elemenata SECIS u potiskivanju stop-kodona ili spajanju selenocisteina. To je zapažanje dovelo do fascinantne hipoteze da vezanje SelC za motiv SECIS ima dvojne učinke u eukariota uz posljedično ponovno kodiranje kodona UGA i stabilizaciju mRNA ovisnu o selenu (18).

 

Struktura GPX

Premda su GPX1, GPX3 i GI-GPX2 homotetrameri, GPX4 je monomer s molekularnom veličinom manjom od podjedinica drugih glutation-peroksidaza. Zbog svoje male veličine i vodoodbojne površine GPX4 imaju sposobnost reagiranja sa složenim membranskim lipidima (19).

Struktura GPX u sisavaca također je analizirana računalom uz pomoć molekularnog modeliranja. Dobiveni modeli ukazuju da su osnovne faze katalize tri zasebne redoks-promjene selena na aktivnom mjestu koji se u osnovnom stanju pojavljuje na površini selenoperoksidaza kao središte karakteristične trijade koju izgrađuju selenocistein, glutamin i triptofan. U GPX četiri argininska ostatka i lizinski ostatak osiguravaju elektrostatičan ustroj koji u svakom reduktivnom koraku usmjerava glutation donorskog supstrata (engl. donor substrate glutathione, GSH) prema katalitičkom središtu tako da njegova sulfhidrilna skupina mora reagirati s dijelom molekule selena. Štoviše, mehanizmi vezanja kosupstrata su jedinstveni za klasičnu vrstu GPX1, no ne djeluju kod GPX3 i GPX4 (11) (Slika 3).

 

Slika 3. Strukturni model GPX1 kao homotetramera (kružnice s okomitim linijama označavaju aktivna mjesta - selenocistein na 47-aminokiselini; najsvjetlije sive kružnice: Gln 82; bijele s točkicama: Trp160; kružnice s vodoravnim linijama: Arg 52 i Arg 179).

 

Analizom selenoproteoma karakterizirane su funkcije i slijed šest glutation-peroksidaza (GPX) u sisavaca: citosolne (cGPX, GPX1), prvog identificiranog selenoproteina kod sisavaca (6,15), fosfolipid-hidroperoksidne GPX (PHGPX, GPX4) koja je prvi put opisana 1982. godine i kasnije sekvenciranjem potvrđena kao selenoprotein (21,22), te druge sekvencirane plazmatske GPX (pGPX, GPX3) (23), gastrointestinalne GPX (GI-GPX, GPX2) (24) te kod ljudi GPX6 koja je ograničena na olfaktorni sustav (19).

 

Glutation i selen su značajni u mehanizmima antioksidacijske zaštite povezanima s GPX

Glutation-peroksidaza je uključena u zaštitu od oksidacijskog stresa, pri čemu glutation koristi kao supstrat. Glutation također djeluje kao supstrat u drugim detoksificirajućim enzimima protiv oksidacijskog stresa kao što su glutation-transferaze. On sudjeluje u prijenosu aminokiselina kroz plazmatsku membranu i izravno čisti hidroksilni radikal i singletni kisik te time detoksificira vodikov peroksid i lipidne perokside katalitičkim djelovanjem GPX. Glutation može obnoviti najvažnije vitamine, tj. vitamine C i E, natrag u njihove aktivne oblike (2).

Zahvaljujući cisteinu koji sadrži tiolnu skupinu, glutation je važan unutarstanični neenzimski antioksidans. Glutation je obilato prisutan u citosolu (1-11 mM), jezgrama (3-15 mM) i mitohondrijima (5-11 mM) te je glavni topljivi antioksidans u staničnim odjeljcima (2,25).

Unutarstanični sadržaj glutationa ovisi o čimbenicima okoliša i funkcionira kao ravnoteža između njegova iskorištenja i sinteze. Izlaganje ROS (uključujući H2O2)/RNS, ili spojevima koji mogu stvarati ROS, može povećati sadržaj GSH povećanjem brzine sinteze GSH (2).

Značajno je da se GPX natječu s katalazom za H2O2 kao supstrat. Redoks-ciklus glutationa je glavni izvor zaštite od blagog oksidacijskog stresa, dok katalaza postaje sve važnija u zaštiti od teškog oksidacijskog stresa (26).

Međutim, u stanicama životinja, a posebice u ljudskim eritrocitima, GPX se već dugo smatra vodećim antioksidacijskim enzimom za detoksifikaciju H2O2 jer katalaza ima mnogo manji afinitet za H2O2 nego GPX (2,27).

U velikom je broju studija ustanovljena povezanost između pojavnosti karcinoma i različitih poremećaja funkcija enzima povezanih s GSH, dok se za glutation S-transferaze (GST) čće izvještava s obzirom na promjene glutation-peroksidaza (2,3,25).

Selen, kao dio aktivnog mjesta u GPX, jest osnovni mikronutrijent za kojeg je pokazano da smanjuje pojavnost karcinoma debelog crijeva te žarišta aberantnih kripti u životinjskim modelima (27-29). Ukazano je i na njegovu moguću uključenost u kemoprevenciju nekih karcinoma. U studijama na ljudima podatci pokazuju da su koncentracije selena obrnuto povezane sa smrtnošću i pojavnošću karcinoma (20,30,31).

Stoga se čini da selen funkcionira kao antimutageni agens koji sprječava zloćudnu preinaku normalnih stanica. Čini se da su ti njegovi zaštitni učinci ponajprije povezani s aktivnošću glutation-peroksidaza. Koncentracije GPX1 su osobito odgovorne za kolebanja koncentracija selena u usporedbi s ostalim selenoproteinima (6).

 

Specifična biološka svojstva ljudskih glutation-peroksidaza

A. Funkcije glutation-peroksidaza

Unatoč njihovu posvudašnjem izražaju, koncentracije svake izoforme variraju ovisno o vrsti tkiva. Sve glutation-peroksidaze reduciraju vodikov peroksid i alkilne hidroperokside na račun glutationa. Njihove se specifičnosti za hidroperoksidni supstrat, međutim, izrazito razlikuju. Citosolne i mitohondrijske glutation-peroksidaze (cGPX ili GPX1) reduciraju samo topljive hidroperokside kao što je H2O2 te neke organske hidroperokside kao što su hidroperoksi-masne kiseline, izopropil-benzen-hidroperoksid ili t-butil-hidroperoksid. GPX1 i fosfolipid-hidroperoksidna glutation-peroksidaza GPX4 (ili PHGPX) nalaze se u većini tkiva. GPX4 je smješten i u citosolu i u membranskoj frakciji. Nadalje, GPX4 može izravno reducirati složenije lipide poput fosfatidilkolin-hidroperoksida, hidroperoksida masnih kiselina i hidroperoksida kolesterola koji se stvaraju u peroksidiranim membranama i oksidiranim lipoproteinima (32-35). GPX3 je usmjeren na izvanstanične odjeljke i luče ga različita tkiva u dodiru s tjelesnim tekućinama. On reducira fosfolipidne hidroperokside i doprinosi izvanstaničnom antioksidacijskom stanju kod ljudi. Međutim, važnost njegove funkcije još uvijek je upitna zbog niske koncentracije glutationa u plazmi (33).

GPX1 sprječava citotoksično, peroksidima izazvano oksidacijsko oštećenje, peroksidaciju lipida i razgradnju proteina. GPX4 je potreban za embriogenezu i mušku plodnost. Točna funkcija GPX3 još uvijek je nepoznata, dok bi GPX2 mogao biti protuupalni i antikancerogeni enzim (36).

 

B. Regulacija sinteze

Za egzogenu je opskrbu selenom utvrđeno da kontrolira enzimsku aktivnost ljudskog GPX1. U okolini s pomanjkanjem selena u stanicama postoji oko 5% normalne ljudske aktivnosti GPX1. Međutim, na koncentraciju GPX1 mRNA ne utječe koncentracija selena, što pak ukazuje da je ljudski GPX1 gen posttranskripcijski reguliran selenom (37,38).

Nedavno je utvrđeno da GPX1 inducira etopozid, koji je inhibitor topoizomeraze II, pobuđivač apoptoze i aktivator p53. Analizama vezanja DNA dokazano je da p53 povoljno regulira uzlazni promotorski element gena GPX1. Ta transaktivacija GPX1 pomoću p53 povezuje signalni put p53 s putem antioksidacije (38). Štoviše, analiza apoptoze potaknute s p53 u ljudskom karcinomu debelog crijeva pokazala je da je povišen izražaj p53 povezan s povišenim GPX1 (38,39).

Osim toga, hiperhomocisteinemija je jedan od rizičnih čimbenika ateroskleroznog oboljenja krvnih žila. Za homocistein je navedeno da inhibira izražaj GPX1 i dovodi do povećanja ROS kojima su inaktivirani dušični oksid i pospješena endotelna disfunkcija. Ta se endotelna disfunkcija potaknuta homocisteinom riješila uvećanim izražajem GPX1 (40,41).

 

C. Stanično signaliziranje

GPX1 neutralizira događaje modulirane hidroperoksidom, kao npr. signaliziranje citokina i apoptozu potaknutu s CD95, radi uklanjanja neoplastičnih stanica (42,43). GPX1 ima također važnu ulogu u infekciji virusom ljudske imunodeficijencije (HIV) (44).

Glutation-peroksidaze moduliraju aktivaciju NF-κB, što je potvrđeno sljedećim razmatranjima: inhibitori ciklooksigenaza i lipooksigenaza inhibiraju aktivaciju NF-κB, aktivnost ciklooksigenaza ovisi o tonu hidroperoksida kojeg reguliraju glutation-peroksidaze, aktivacija NF-κB je inhibirana u stanicama s nadopunom selena, a olakšana kod pomanjkanja selena. Štoviše, pokusima je ukazano da pretjerani izražaj GPX1 u ljudskim kancerogenim stanicama T47D inhibira aktivaciju NF-κB potaknutu s TNF i modulira obrazac fosforilacije hsp27 nakon tretmana s TNF. Za GPX4 je, međutim, dokazano da je privlačniji kandidat za suzbijanje lipooksigenaza i utjecaj na signaliziranje citokina (45).

Apoptoza ili programirana smrt stanica ima važnu ulogu tijekom razvoja zametka, u pregradnji tkiva, uravnoteženju karcinogeneze i u sustavu obrane domaćina. Moguće ga je pobuditi u T-stanicama pomoću ROS, antigena Fas ili pomoću TNF. Većina istraživanja uloge GPX1 u apoptozi provedena je na stanicama dobivenima iz limfocita. Pojačana aktivnost GPX1 je inhibirala apoptozu potaknutu hidroperoksidima. Ta je činjenica potvrđena nadopunom goveđih bubrežnih epitelnih stanica sa selenom ili pretjeranim izražajem konstrukta GPX1 u mijeloičnoj staničnoj liniji (33,46,47).

Konačno, uloga GPX u infekciji HIV-om je podrobno istraživana. Umnožavanje HIV-a ovisi o aktivaciji NF-κB. Niske koncentracije GSH i glutation-peroksidaza u stanicama CD4+ povisuju koncentraciju hidroperoksida i time dovode to poticanja apoptoze. Stanice zaražene HIV-om umiru tijekom procesa apoptoze. Apoptozu djelotvorno inhibira antiapoptotički produkt gena Bcl-2 kojemu je dokazana antioksidacijska funkcija. Slični su rezultati dobiveni sa stanicama koje prejako izražavaju GPX1. Stoga GPX1 i Bcl-2 pokazuju slične učinke na antioksidacijski događaj u signalnoj kaskadi i dovode do inhibicije apoptoze, iako različitim mehanizmima. GPX1 izravno reducira hidroperokside, dok Bcl-2 sprječava njihov nastanak. Na temelju tih studija te studija koje uključuju depleciju GSH zaključeno je da bi se smanjenjem koncentracija GSH i aktivnosti GPX prije infekcije moglo smanjiti širenje virusa zahvaljujući apoptozi uzrokovanoj oksidacijskom mikrookolinom (48,49).

 

D. Patofiziološke funkcije enzima

U slučaju karcinoma glave i vrata za gubitak GPX1 alela je dokazano da se događa u histopatološko normalnom tkivu u blizini tumora, što ukazuje da bi gubitak na tom mjestu mogao biti rani događaj u razvoju karcinoma. Genetički modificirani miševi s GPX1 razvijeni su radi istraživanja posljedične fiziološke funkcije tog enzima. Ti su miševi rasli i razvijali se normalno, bez histopatoloških očitovanja sve do dobi od 15 mjeseci, što je ukazalo na ograničenu ulogu GPX1 tijekom normalnog razvoja pod fiziološkim uvjetima (50). Međutim, nakon stresa uzrokovanog parakvatom, GPX1(-,-) miševi su umrli brže nego oni iz kontrolne skupine. Neuroni u genetički manipuliranih GPX1 miševa također su bili osjetljiviji na H2O2. U tih su miševa i očne leće bile manje sposobne za oporavak nego u kontrolnih miševa nakon izlaganja fotokemijskom stresu. GPX1 (-,-) miševi su izražavali nepromijenjene koncentracije GPX4, GPX3 i GPX2, što bi posebice moglo zamijeniti pomankanje GPX1 (50).

Genetičke promjene u ljudi dovode do smanjene aktivnosti GPX, redukcije GSSG ili opskrbe NADPH-om, što ostaje asimptomatično (33).

Chu i suradnici su predložili moguću zaštitnu ulogu GPX2 protiv karcinoma debelog crijeva. Takva je uloga dokazana temeljem kromosomskog mapiranja mišjeg gena GPX2 blizu lokusa Ccs1 na kromosomu 12 koji sadrži gen osjetljiv na karcinom debelog crijeva. Zapaženo je da su koncentracije GPX2 mRNA više nego u miševa osjetljivih na ICR/HA (31).

GPX3 je najprije otkriven u plazmi no njegova mRNA je pretežito nađena u epitelnim stanicama proksimalnih tubula bubrega. Bolesnici s bubrežnim bolestima imali su vrlo malu aktivnost GPX3, uključujući i bolesnike podvrgnute dijalizi. Takvo smanjenje GPX3 u plazmi nije bilo povezano s pomanjkanjem selena kod bolesnika. Ta činjenica predstavlja antioksidacijsku zaštitnu ulogu tog enzima u proksimalnim tubulima bubrega (51,52).

Hibridizacijom in situ otkriveno je da je GPX4 jako izražen u kasnim spermatogenim stanicama. Oksidacijska inaktivacija GPX4 je očevidno ključan korak u dozrijevanju sperme. Za jezgreni se oblik GPX4 vjeruje da doprinosi kondenzaciji kromatina (53). Za GPX4 je također dokazano da funkcionira kao strukturni protein u glavama spermija gdje čini 50% proteina (54).

Neka obilježja različitih GPX zajedno su prikazana u Tablici 2.

 

Tablica 2. Karakteristike različitih GPX

 

Zaključci

Zaključno, identificirano je barem sedam vrsta glutation-peroksidaza. Uz njihove intrinzične funkcije čistača, točan smještaj različitih GPX u tkivima govori u prilog specifičnih uloga tih enzima. Svaki GPX također može funkcionirati kao senzor vodikovog peroksida koji regulira koncentraciju H2O2. Zanimljivo je da specifična kotranslacijska ugradnja Sec u GPX ima dvojni učinak kod eukariota, kao što su ponovno kodiranje kodona UGA i stabilizacija mRNA ovisna o selenu, što bi se u budućnosti moglo istražiti za svaki tip GPX.

Zbog antioksidacijske i antimutagene uloge GPX postoji znatno zanimanje za njihovom terapijskom primjenom kao antioksidansima. Tu je moguća uporaba prirodno dostupnih antioksidansa ili potpuno sintetskih molekula. Nadalje, prevelik izražaj GPX mogao bi zaštititi različite stanice od oksidacijskog stresa. Aktivnost tih enzima mogu pojačati adenovirusi (62), selenidi, diselenidi i ebselen kao oponašatelji GPX s malim molekulama (63-65). Od oblikovanja novih tvari koje oponašaju različite GPX i njihova prijenosa do specifičnih mjesta u antikancerogenoj terapiji ili sprječavanju karcinoma očekuje se da uskoro postanu trend u znanstvenom istraživanju.

 

Literatura

1.    Ratnasinghe D, Tangrea JA, Andersen MR, Barrett MJ, Virtamo J, Taylor PR, et al. Glutathione peroxidase codon 198 polymorphism variant increases lung cancer risk. Cancer Res 2000;60:6381-3.

2.    Valko M., Rhodes CJ, Moncol J. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chem Biol Interact 2006;160(1): 1-40.

3.    Valko M, Morris H, Cronin MT. Metals, toxicity and oxidative stress. Curr Med Chem 2005;12:1161-208.

4.    Mates JM, Perez-Gomez C, Nunez De Castro I. Antioxidant enzymes and human diseases. Clin Biochem 1999;32:595–603.

5.    Papp LV, Lu J, Holmgren A, Khanna KK. From selenium to selenoproteins: synthesis, identity, and their role in human health. Antioxid Redox Signal 2007;9:775-806.

6.    Rotruck JT, Pope AL, Ganther HE, Swanson AB, Hafeman DG, Hoekstra WG. Selenium: biochemical role as a component of glutathione peroxidase. Science 1973;179(73):588-90.

7.    Zachara BA. Mammalian selenoproteins. J Trace Elem Electrolytes Health Dis 1992;6(3): 137-51.

8.    Brown KM, Arthur JR. Selenium, selenoproteins and human health: a review. Public Health Nutr 2001;4(2B):593-9.

9.    Beckett GJ, Arthur JR. Selenium and endocrine systems. J Endocrinol 2005;184:455-65.

10.  Low SC, Berry MJ. Knowing when not to stop: selenocysteine incorporation in eukaryotes. Trends Biochem Sci 1996;21(6):203-8.

11.  Hatfield DL, Gladyshev VN. How selenium has altered our understanding of the genetic code. Mol Cell Biol 2002;22:3565-76.

12.  Mullenbach GT, Tabrizi A, Irvine BD, Bell GI, Hallewell RA. Sequence of a cDNA coding for human glutathione preoxidase confirms TGA encodes active site selenocysteine. Nucleic Acids Res 1987;15:5484.

13.  Tujebajeva RM, Copeland PR, Xu XM, Carlson BA, HArney JW, Driscoll DM, et al. Decoding apparatus for eukaryotic selenocysteine insertion. EMBO Rep 2000;1(2):158-63.

14.  Wingler K, Bocher M, Flohe L, Kollmus H, Brigelius-Flohe R. mRNA stability and selenocysteine insertion sequence efficiency rank gastrointestinal glutathione peroxidase high in the hierarchy of selenoproteins. Eur J Biochem 1999;259(1-2):149-57.

15.  Flohe L, Gunzler WA, Schock HH. Glutathione peroxidase: a selenoenzyme. FEBS Lett 1973;32(1):132-34.

16.  Lee BJ, Worland P, Davis JN, Stadtman TC, Hatfield DL. Identification of a selenocysteyl-tRNA (Ser) in mammalian cells that recognizes the nonsense codon, UGA. J Biol Chem 1989;264:9724-7.

17.  Jameson RR, Diamond AM. A regulatory role for Sec tRNA (Ser)Sec in selenoprotein synthesis. RNA 2004;10:1142-52.

18.  Rybka K. Selenoproteins-atypical function of the UGA codon. Postepy Hig Med Dosw 1999;53(4):601-16.

19.  Brigelius-Flohe R. Glutathione peroxidases and redox-regulated transcription factors. Biol Chem 2006;387(10-11):1329-35.

20.  Aumann KD, Bedorf N, Brigelius-Flohe R, Schomburg D, Flohe L. Glutathione peroxidase revisited-simulation of the catalytic cycle by computer assisted molecular modelling. Biomed Environ Sci 1997;10(2-3):136-55.

21.  Ursini F, Maiorino M, Valente M, Ferri L, Gregolin C. Purification from pig liver of a protein which protects liposomes and biomembranes from peroxidative degradation and exhibits glutathione peroxidase activity on phosphatidylcholine hydroperoxides. Biochim Biophys Acta 1982;710(2):197-211.

22.  Brigelius-Flohe R, Aumann KD, Blocker H, Gross G, Kiess M, Kloppel KD, et al. Phospholipid-hydroperoxide glutathione peroxidase. Genomic DNA, cDNA, and deduced amino acid sequence. J Biol Chem 1994;269(10):7342-8.

23.  Takahashi K, Avissar N, Whitin J, Cohen H. Purification and characterization of human plasma glutathione peroxidase: a selenoglycoprotein distinct from the known cellular enzyme. Arch Biochem Biophys 1987;256(2):677-86.

24.  Chu FF, Doroshow JH, Esworthy RS. Expression, characterization, and tissue distribution of a new cellular selenium-dependent glutathione peroxidase, GSH-Px-GI. J Biol Chem 1993;268(4):2571-6.

25.  Flohe, Brigelius-Flohe. Selenium: its molecular biology and role in human health, Selenoproteins of the glutathione system. Norwel 2001;157-78.

26.  Yan H, Harding JJ. Glycation-induced inactivation and loss of antigenicity of catalase and superoxide dismutase. Biochem J 1997;328:599-605.

27.  Davis CD, Uthus EO. Dietary folate and selenium affect dimethylhydrazine-induced aberrant crypt formation, global DNA methylation and one carbon metabolism rats. J Nutr 2003;133(9):2907-14.

28.  McIntosh GH, Royle PJ, Scherer BL. Selenised dairy protein and colon cancer inhibition in AOM induced rats. Asia Pac J Clin Nutr 2004;13:S93.

29.  Davis CD, Zeng H, Finley JW. Selenium-enriched broccoli decreases intestinal tumourigenesis in multiple intestinal neoplasia mice. J Nutr 2002;132(2):307-9.

30.  Ghadirian P, Maisonneuve P, Perret C, Kennedy G, Boyle P, Krewski D, et al. A case-control study of toenail selenium and cancer of the breast, colon, and prostate. Cancer Detect Prev 2000;24(4):305-13.

31.  Chu FF, Esworthy RS, Chu PG, Longmate JA, Huycke MM, Wilczynski S, et al. Bacteria-induced intestinal cancer in mice with disrupted GPX1 and GPX2 genes. Cancer Res 2004;64(3):962-8.

32.  Mates JM. Effects of antioxidant enzymes in the molecular control of reactive oxygen species toxicology. Toxicology 2000;153(1-3):83-104.

33.  Brigelius-Flohe R. Tissue-specific functions of individual glutathione peroxidases. Free Radic Biol Med 1999;27(9-10):951-65.

34.  Imai H, Narashima K, Arai M, Sakamoto H, Chiba N, Nakagawa Y. Suppression of leukotriene formation in RBL-2H3 cells that overexpressed phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase. J Biol Chem 1998;273(4):1990-7.

35.  Flohe L. Glutathione peroxidase. Basic Life Sci 1988;49:663-8.

36.  Brigelius-Flohe R. Glutathione peroxidases and redox-regulated transcription factors. Biol Chem 2006;387:1329-35.

37.  Chada S, Whitney C, Newburger PE. Regulation of human glutathione peroxidase gene expression by selenium. Blood 1989;74(7):2535-41.

38.  Tan M, Li S, Swaroop M. Transcriptional activation of the human glutathione peroxidase promoter by p53. J Biol Chem 1999;274(17):12061-6.

39.  Gladyshev VN, Factor VM, Housseau F, Hatfiels DL. Contrasting patterns of regulation of the antioxidant selenoproteins thioredoxin reductase and glutathione peroxidase in cancer cells. Biochem Biophys Res Commun 1998;251(2):488-93.

40.  Salonen JT, Alfthan G, Huttunen JK, Pikkarainen J, Puska P. Association between cardiovascular death and myocardial infarction and serum selenium in a matched-pair longitudinal study. Lancet 1982;2(8291):175-9.

41.  Upchurch GR Jr, Welch GN, Fabian AJ, Freedman JE, Johnson JL, Keaney JF Jr, et al. Homocyst(e)ine decreases bioavailable nitric oxide by a mechanism involving glutathione peroxidase. J Biol Chem 1997;272(27):17012-7.

42.  Yang P, Bamlet WR, Ebbert JO, Taylor WR, de Andrade M. Glutathione pathway genes and lung cancer risk in young and old populations. Carcinogenesis 2004;25(10):1935-44.

43.  Gouaze V, Andrieu-Abadie N, Cuvillier O, Malagarie-Cazenave S, Frisach MF, Mirault ME, et al. Glutathione peroxidase-1 protects from CD95-induced apoptosis. J Biol Chem 2002;277(45):42867-74.

44.  Gladyshev VN, Stadtman TC, Hatfield DL, Jeang KT. Levels of major selenoproteins in T cells decrease during HIV infection and low molecular mass selenium compounds increase. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:835-9.

45.  Makropoulos V, Bruning T, Schulze-Osthoff K. Selenium-mediated inhibition of transcription factor NF-kappa B and HIV-1 LTR promoter activity. Arch Toxicol 1996;70(5):277-83.

46.  Arthur JR. The glutathione peroxidases. Cell Mol Life Sci 2000;57:1825-35.

47.  Saito Y, Nishio K, Ogawa Y, Kimata J, Kinumi T, Yoshida Y, et al. Turning point in apoptosis/necrosis induced by hydrogen peroxide. Free Radic Res 2006;40(6):619-20.

48.  Sappey C, Legrand-Poels S, Best-Belpomme M, Favier A, Rentier B, Piette J. Stimulation of glutathione peroxidase activity decreases HIV type 1 activation after oxidative stress. AIDS Res Hum Retroviruses 1994;10(11):1451-61.

49.  Aillet F, Masutani H, Elbim C, Raoul H, Chene L, Nugeyre MT, et al. Human immunodeficiency virus induces a dual regulation of Bcl-2, resulting in persistent infection of CD4(+) T- or monocytic cell lines. J Virol 1998;72(12):9698-705.

50.  Hu YJ, Dolan ME, Bae R, Yee H, Roy M, Glickman R, et al. Allelic loss at the GPX-1 locus in cancer of the head and neck. Biol Trace Elem Res 2004;101(2):97-106.

51.  Whitin JC, Tham DM, Bhamre S, Ornt DB, Scandling JD, Tune BM, et al. Plasma glutathione peroxidase and its relationship to renal proximal tubule function. Mol Genet Metab 1998;65:238-45.

52.  Avissar N, Finkelstein JN, Horowitz S, Willey JC, Coy E, Frampton MW, et al. Extracellular glutathione peroxidase in human lung epithelial lining fluid and in lung cells. Am J Physiol Lung Cell 1996;270:L173-82.

53.  Godeas C, Tramer F, Micali F, Roveri A, Maiorino M, Nisii C, et al. Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPX) in rat testis nuclei is bound to chromatin. Biochem Mol Med 1996;59(2):118-24.

54.  Flohe L. Selenium in mammalian spermiogenesis. Biol Chem 2007;388:987-95.

55.  Singh A, Rangasamy T, Thimmulappa RK, Lee H, Osburn WO, Brigelius-Flohe R, et al. Glutathione peroxidase 2, the major cigarette smoke – inducible isoform of GPX in lungs, is regulated by Nrf2. Am J Respir Cell Mol Biol 2006;35(6):639-50.

56.  Reddy K, Tappel AL. Effect of dietary selenium and autoxidized lipids on the glutathione peroxidase system of gastrointestinal tract and other tissues in the rat. J Nutr 1974;104:1069-78.

57.  Takebe G, Yarimizu J, Saito Y, Hayashi T, Nakamura H, Yodoi J, et al. A comparative study on the hydroperoxide and thiol specificity of the glutathione peroxidase family and selenoprotein P. J Biol Chem 2002;277:41254-8.

58.  Avissar N, Ornt DB, Yagil Y, Horowitz S, Watkins RH, Kerl EA, et al. Human kidney proximal tubules are the main source of plasma glutathione peroxidase. Am J Physiol 1994;266:C367-75.

59.  Whitin JC, Bhamre S, Tham DM, Cohen HJ. Extracellular glutathione peroxidase is secreted basolaterally by human renal proximal tubule cells. Am J Physiol Renal Physiol 2002;283:F20-8.

60.  Avissar N, Slemmon JR, Palmer IS, Cohen HJ. Partial sequence of human plasma glutathione peroxidase and immunologic identification of milk glutathione peroxidase as the plasma enzyme. J Nutr 1991;121:1243-9.

61.  Pushpa V, Burdsal CA. Rat phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase: cDNA cloning and identification of multiple transcription and translation sites. J Biol Chem 1985;270:26993-9.

62.  Robertson RP, Harmon JS. Pancreatic islet beta-cell and oxidative stress: The importance of glutathione peroxidase. FEBS Lett 2007;581(19):3743-8.

63.  Back TG, Moussa Z. Diselenides and allyl selenides as glutathione peroxidase mimetics. Remarkable activity of cyclic seleninates produced in situ by the oxidation of allyl omega-hydroxyalkyl selenides. J Am Chem Soc 2003;125(44):13455-60.

64.  Konorev EA, Kennedy MC, Kalyanaraman B. Cell-permeable superoxide dismutase and glutathione peroxidase mimetics afford superior protection against doxorubicin-induced cardiotoxicity: the role of reactive oxygen and nitrogen intermediates. Arch Biochem Biophys 1999;368(2):421-8.

65.  Jauslin ML, Wirth T, Meier T, Schoumacher F. A cellular model for Friedreich Ataxia reveals small-molecule glutathione peroxidase mimetics as novel treatment strategy. Hum Mol Genet 2002;11(24):3055-63.

Pregledni članak

 

Krzysztof Celiński, Agnieszka Mądro. Molekularni mehanizmi i biokemijski biljezi akutnog pankreatitisa. Biochemia Medica 2008;18(2):175-82.

 

Odjel za endoskopiju Klinike za gastroenterologiju, Medicinski fakultetF. Skubiszewski”, Lublin, Poljska

*Adresa za dopisivanje: celinski [at] mp [dot] pl

 

Sažetak

Unatoč nedavnim iskoracima u ispitivanju etiopatogeneze akutnog pankreatitisa (AP), još uvijek nisu objašnjeni svi čimbenici koji određuju nastup i tijek te bolesti. Istraživači se usredotočuju na ispitivanje čimbenika koji uvjetuju razvoj teškog AP, te razmatraju genetičku predispoziciju, vrstu mogućih odgovornih čimbenika kao i istodobno prisutna oboljenja. Najbitnija zadaća preostaje, međutim, procjena osjetljivosti i specifičnosti biokemijskih i seroloških biljega u dijagnozi i prognozi razvoja teškog AP te njihova klinička dostupnost. Aktivnost lipaze u serumu je pouzdaniji dijagnostički biljeg AP, nego aktivnost serumske amilaze. Tripsinogen-aktivacijski peptid (TAP) omogućava ranu dijagnozu AP. Korisni predskazatelji težine bolesti mogu uključivati prokalcitonin i TAP u mokraći, interleukine 6 i 8 u serumu, 24-satnu polimorfonuklearnu elastazu, te 48-satni C-reaktivni protein.

Istraživači se usredotočuju na potragu za najboljim mogućim prognostičkim čimbenikom AP. U kliničkoj se praksi, međutim, dijagnoza temelji na biološkim biljezima, kliničkoj procjeni i drugim laboratorijskim rezultatima koji su uključeni u Ransonovu ljestvicu ili APACHE II, te na slikovnim pretragama koje se koriste za određivanje pokazatelja težine bolesti kompjutorskom tomografijom (engl. computer tomography severity index, CTSI). Točnu prognozu tijeka AP nije moguće načiniti sve dok nisu određeni svi ti parametri kako bi se moglo započeti s najboljom mogućom terapijom.

Ključne riječi: akutni pankreatitis, lipaza, amilaza, prokalcitonin, CRP, interleukini

Pristiglo: 3. prosinca 2008.                                                                                                                                Prihvaćeno: 24. siječnja 2008.

 

Uvod

Usprkos nedavnim napredovanjima postignutima u istraživanju etiopatogeneze akutnog pankreatitisa (AP), još nisu razjašnjeni svi čimbenici koji određuju nastup i tijek te bolesti. Klasično se AP definira kao akutan upalni proces koji se razvija unutar gušteračne žlijezde s manjom ili većom uključenošću okolnog tkiva i/ili drugih organa (1). U većini je slučajeva to samoograničavajući proces, no u 20% oboljelih razvija se težak oblik nekroze s višeorganskim komplikacijama. Težak oblik AP uzrokom je do 50% smrtnih slučajeva (1). U slučaju pankreatične nekroze postoje dva razdoblja obilježena povećanom smrtnošću: prvo unutar prvih 7 dana od nastupa bolesti zbog višeorganskog zatajivanja, te drugo, kasnije razdoblje obično 2 tjedna nakon nastupa (kasna smrtnost) koje je najčće uzrokovano infekcijama s lokalnim komplikacijama (npr. apscesi) ili općim infekcijama (npr. septikemija) (2).

Istraživači se usredotočuju na istraživanje čimbenika koji uvjetuju razvoj teškog AP, te uzimaju u obzir genetičku predispoziciju, vrstu mogućeg odgovornog čimbenika i prateća oboljenja. Eksperimentalna istraživanja pridaju veliku pozornost vrednovanju učinaka ishemije na razvoj AP (3,4). Ipak, najvažnija zadaća ostaje procjena osjetljivosti i specifičnosti biokemijskih biljega u prognoziranju rizika za razvoj teškog AP, te procjena njihove kliničke dostupnosti (5).

Najpoznatiji mehanizmi razvoja AP su, primjerice, aktivacija intrapankreatičnog enzima potaknuta aktivacijom tripsinogena u tripsin, nakon koje slijedi otpuštanje posrednika upale iz infiltrirane pankreatične vezivne strome - tj. citokina, adhezijskih molekula, čimbenika aktivacije trombocita (engl. platelet activating factors, PAF), dušičnog oksida (NO), reaktivnih oblika kisika, te lizosomskih enzima (6).

 

Molekularni mehanizmi AP

Uloga genetičkih čimbenika

Nedavno je istraživanje ukazalo da aktivaciji tripsinogena prethodi izmijenjena aktivacija miogenom aktivirane protein-kinaze (MAP), p38MAP-kinaze i c-jun aminoterminalne kinaze (JUN). Koncentracija p38MAP-kinaze raste najbrže, s vršnom koncentracijom nakon 3 sata. Aktivnost JUN-kinaze je najviša nakon 12 sati, a nakon 24 sata više se ne može detektirati (7,8).

Nuklearni transkripcijski faktor-κβ (NF-κβ) je poveznica između daljnjih stadija upalnog odgovora i imune reakcije te je primarni poznati regulator genskog izražaja mnogih posrednika upale. NF-κβ aktiviraju citokini, oksidacijski stres ili endotoksemija. NF-κβ se zatim premješta iz citoplazme u jezgru gdje se veže za specifične DNA-promotorske jedinice i potiče prijepis izvornih gena. Broj tako potaknutih posrednika upale dokazuje da je taj faktor uvelike uključen u pokretanje i širenje upalne reakcije s lokalne na opću razinu (9,10).

 

Uloga inhibitora proteolitičkih enzima

Gušterača u zdravom tijelu ima mnoge mehanizme koji je štite od samodigestije od svojih vlastitih enzima. Proteolitičke enzime, od kojih je tripsinogen najvažniji, stvaraju acinarne stanice kao proenzime, a u dvanaesniku ih aktiviraju crijevne endopeptidaze. Enterokinaza iz površine membrane hidrolizira vezu Lys23-Ile24 i otpušta krajnji oktapeptid, nazvan tripsinogen-aktivacijski peptid (TAP). I sam tripsin može aktivirati tripsinogen. Također, pankreatični sekrecijski tripsin-inhibitor (PSTI) štiti gušteraču od aktivacije tripsinogena u lobularnim stanicama. On se veže za tripsin u omjeru 1:1. Procjenjuje se da je molarni omjer PSTI i tripsina 1:10. Ako je aktivirano više od 10% tripsinogena, zaštitni mehanizmi više nisu učinkoviti (11). Osim PSTI, i sam tripsin može ograničiti svoju aktivnost razlaganjem veze Arg117 u molekuli tripsinogena. Usto su istraživanja potvrdila prisutnost izoforme ljudskoga tripsinogena, tj. mezotripsinogena koji je rezistentan na inhibitore tripsina. Ispitivanje njegove biološke funkcije je rezultiralo dvjema oprečnim teorijama: da mezotripsin može ili prerano aktivirati ili razgraditi pankreatične zimogene te time ili potaknuti ili zaštititi od patogeneze AP. Sposobnost mezotripsina da se veže za inhibitore uzrokovana je jednom mutacijom koja mezotripsinu pridaje jedinstvenu novu funkciju. Istraživači predlažu da biološka funkcija ljudskog mezotripsina uključuje razgradnju inhibitora tripsina u probavnom sustavu. Neadekvatna aktivacija mezotripsinogena u gušterači može pridonijeti razvoju AP (12).

Jedan od rijetkih uzroka AP je genetičko oboljenje koje je ovisno o genskoj mutaciji kationičkog tripsinogena. Genetičkim je istraživanjima otkrivena mutacija na poziciji 122 (R122H) gdje je histidin zamijenjen argininom (13). Ta je zamjena odgovorna za spontanu aktivaciju tripsina zbog autolize i počinje povezivanjem Arg122-Lys123. Jednom kad je tripsinogen aktiviran i njegova koncentracija nadmaši koncentraciju PSTI, aktiviraju se i ostali enzimi te se razvija AP. Za mutacije gena PSTI smatra se da preinačuju tijek AP time što smanjuju prag AP i povećavaju težinu upalnog procesa (14).

 

Biokemijski biljezi AP

Dijagnostički biljezi

Mnogi se biološki biljezi koriste za dijagnosticiranje i predviđanje težine AP. Ako se koriste usporedno s kliničkim simptomima, oni pomažu u dijagnozi i pokretanju pravodobnog liječenja. Najuobičajeniji biljezi uključuju lipazu i amilazu. Oba ta enzima luče pankreatične acinarne stanice (15,16). Njihov sadržaj u serumu ovisi o vremenu koje je proteklo od nastupa prvih pritužbi na bol i druge abdominalne simptome, koncentraciji triglicerida i drugim kroničnim stanjima kao što je npr. zatajivanje bubrega (17). Aktivnost amilaze može ostati normalna u bolesnika kod kojih postoji zlouporaba alkohola unatoč očiglednim kliničkim simptomima AP. Najveća se aktivnost tog enzima bilježi između 2 i 12 sati od nastupa simptoma i smanjuje se kako simptomi slabe.

Mnogo osjetljivija i specifičnija jest aktivnost lipaze, osobito u bolesnika kod kojih postoji zlouporaba alkohola. Najveća aktivnost tog enzima prisutna je između 4 i 8 sati od nastupa simptoma. Danas je uobičajena praksa da se za dijagnosticiranje AP koristi jedino aktivnost lipaze, jer istodobno određivanje i aktivnosti amilaze ne osigurava veću dijagnostičku točnost (18). Sljedeći dijagnostički biljeg jest aktivnost alanin-aminotransferaze (ALT). Povišene aktivnosti koje koreliraju s aktivnošću amilaze i lipaze odgovorne su za 95%-tnu žučnu etiologiju AP. Vrijednosti > 150 mg/L smatraju se graničnima. Tripsinogenom aktivirani protein (TAP) u mokraći je koristan biljeg u dijagnozi i procjeni težine AP. Povećane vrijednosti tog biljega zapažaju se nekoliko sati (6-12) nakon nastupa simptoma no, na žalost, on jedva da je klinički koristan zbog svoje ograničene raspoloživosti (19).

Iako su nalazi u povijesti bolesti najvažniji u slučaju AP povezanog s alkoholom, dijagnozu u dvojbenim slučajevima olakšava određivanje disijalotransferina u krvnom serumu koji predstavlja tipičan biljeg izražene zlouporabe alkohola. Ako se izmjeri 24 sata nakon prijama, taj biljeg povećava vjerojatnost dijagnoze AP povezanog s alkoholom od 64% na 94% (20).

 

Prognostički biljezi

Uloga C-reaktivnog proteina

Predviđanje težine bolesti je važno u obradi bolesnika s AP. S time u vezi najuobičajeniji biološki biljeg jest C-reaktivni protein (CRP). CRP je protein akutne faze kojeg obilato stvaraju hepatociti. To stvaranje potiču citokini kao što su interleukin 6 (IL-6), čimbenik nekroze tumora alfa (engl. tumor necrosis factor alpha, TNF-a) i interleukin 1-beta (IL-1beta) (21). Pojačana aktivnost CRP je usko povezana s težinom AP i tendencijom razvoja nekroze gušterače. Granična vrijednost iznosi 150 mg/L. Na žalost, koncentracija CRP značajno raste 24-48 sati nakon nastupa bolesti (19,22) te je stoga beskoristan tijekom prvih 24 sata (23). Osjetljivost CRP je 37-77% kod dokazivanja teškog AP unutar 24 sata i raste sve do 83-100% 48 sati nakon pojave prvih simptoma (24). Slične rezultate je dobio i Gürleyik. On je utvrdio da je osjetljivost CRP 48 sati nakon nastupa bolesti bila 84%, specifičnost 73%, a pozitivna prediktivna vrijednost (PPV) 50,1% (25).

Kako se za osjetljivost CRP ispostavilo da je vrlo mala unutar 24 sata od nastupa bolesti, potraga za ranim biljezima usmjerena je prema citokinima. Radi se o skupini različitih peptida koji pokazuju signalne karakteristike. Skupina se dijeli u monokine, limfokine, kemokine, hematopoetine i interferone. Ti proteini često pokazuju biološka svojstva iako imaju i neke zajedničke osobine: aktivni su u vrlo malim koncentracijama, ne stvaraju se neprekidno, no stanice se potiču na njihovu sitnezu, imaju biološke učinke vezanjem za visokospecifične receptore na ciljanoj staničnoj površini, a imaju i plejotrofno djelovanje (2,6).

 

Uloga citokina

Za prognozu AP najvažniji je IL-6 kojega stvaraju monociti, makrofagi, limfociti T i B, endotel, epitel i fibroblasti, hondroblasti i osteociti. Koncentracija mu raste između 18 i 48 sati od nastupa bolesti. IL-6 predstavlja čimbenik koji započinje stvaranje proteina akutne faze u jetri (CRP) i pojačava sintezu IL-2 i njegova receptora na površini T-limfocita. Suprotno od ostalih citokina, lako ga se otkriva u cirkulaciji i pokazuje tipičnu endokrinu aktivnost (2,26). Jiang je utvrdio da je nakon 24 sata IL-6 pokazao veću osjetljivost (100%), specifičnost (89,9%) i PPV (91%) nego CRP i TNF-a, čime je naglašena njegova korisnost u procjeni težine bolesti tijekom prvih 24 sata (27).

Drugi važan citokin je IL-8. Taj kemokin stvaraju brojne stanice opremljene s TNF-a i IL-1-receptorima. Vjerojatno je da su acinarne stanice gušterače primaran izvor IL-8 i ostalih citokina (28). Berney je utvrdio da je koncentracija IL-8 u serumu povezana s težinom bolesti, posebice kad upala organa postane opći proces (29). Najviše su mu koncentracije zapažene između 12 i 24 sata od nastupa bolesti (5). Slično kao i ostali kemokini, IL-8 pretvara djelomično neaktivne integrine u molekule s aktivnom konfiguracijom (26). IL-8 stoga može biti vrlo koristan u procjeni težine AP u ranom stadiju tog oboljenja.

IL-15 je citokin koji ima mnoga biološka svojstva IL-2. Njegove su koncentracije ispitivane u odnosu na težinu AP, višeorganske komplikacije i infekcije. Koncentracija tog citokina bila je visoka u bolesnika s disfunkcijom više organa, infekcijama te u bolesnika koji su umrli tijekom AP. IL-15 je korisniji od CRP, IL-6 ili IL-8 u predviđanju težine AP (30).

Član skupine monokina IL-18 također se, u odnosu na svoje blaže oblike, oslobađa u značajno višim koncentracijama u ranim stadijima pankreatične nekroze tijekom AP (31). IL-18 može aktivirati pomoćničke limfocite Th1 i B-limfocite te jača obranu od infekcija. S druge strane on potiče otpuštanje TNF-α, kemokina i INFγ. Ukazano je da IL-18 djeluje kao značajna poveznica u poremećenom imunom odgovoru kod nekrotičkog oblika AP.

Kao i IL-18 iz skupine monokina, TNF-a je biološki biljeg koji se razmatra kod procjene težine AP. Tijekom AP oslobađa se u jetri, plućima i slezeni. TNFa i IL-1 su glavni i najvažniji posrednici upale u AP (26). TNFa je ključni regulator proupalnih citokina i molekula adhezije leukocita. Može biti koristan u procjeni težine bolesti i indvidualne sklonosti za razvijanje organskih komplikacija i septičnog šoka. TNFa se, međutim, brzo ispire iz seruma tako da njegova osjetljivost i PPV uvelike ovise o vremenskom podudaranju s prvim simptomima (32). S obzirom da se čini da je TNFa ključni citokin u razvoju AP, on je također postao važnim ciljem terapije. Prvi članci istraživača etanercepta, inhibitora TNFa koji se primjenjuje u liječenju AP u miševa, već su objavljeni no, unatoč obećavajućim rezultatima, nužna su daljnja promatranja (33).

 

Ostali prognostički čimbenici

Prokalcitonin (PCT) je također koristan biljeg u procjenjivanju težine AP. Povećane koncentracije PCT u serumu bilježe se između 24 i 36 sati, osobito u bolesnika s inficiranom nekrozom (34). Takvo je zapažanje potvrđeno istraživanjem u više centara u kojima su uspoređene koncentracije PCT s koncentracijama CRP. Oba su parametra praćena uzastopno 21 dan. Za razliku od CRP, koncentracija PCT je bila značajno povišena u slučaju pankreatične nekroze, u bolesnika sa sindromom višeorganske disfunkcije (engl. multiorgan dysfunction syndrome, MODS), u svih bolesnika kod kojih je bio nužan naknadan kirurški zahvat, te u onih koji su umrli od AP. Istraživači su također ukazali na određivanje PCT kao jedinstvenog parametra rizika za razvoj komplikacija (35,36).

Fosfolipaza A2 je biljeg koji je povezan ne samo s pankreatičnom nekrozom već i s pulmonarnim komplikacijama tijekom AP (37). Visoke vrijednosti u serumu određuju se 24 sata nakon nastupa AP.

Prisutnost plućnih komplikacija je također povezana s matriks-metaloproteinazom-9 (MMP-9) koja se rano pojavljuje u krvnom serumu. Karakterizira ju negativna prediktivna vrijednost (NPV) od 96,2% i PPV koji dostiže 100% (38,39).

U istom je kontekstu ispitivan inhibicijski čimbenik migracije makrofaga (engl. macrophage migration inhibitory factor, MIF). On može pojačati upalnu reakciju uključenjem citokina na mjestu upale. Njegove su visoke vrijednosti zapažene 24 sata nakon nastupa AP u bolesnika u kojih se razvila pankreatična nekroza; taj čimbenik, međutim, nije korelirao s višeorganskim komplikacijama (40).

Povećane vrijednosti topljivog trombomodulina (sTM) pojavljuju se iza visokog MIF. Zapažene su nakon 48 sati u serumu bolesnika kod kojih postoji rizik razvoja pankreatične nekroze (41).

Čimbenik aktivacije trombocita (engl. platelet-activating factor, PAF) je proupalni fosfolipid iz biološki aktivne skupine triglicerida. Ti spojevi sudjeluju u procesima cijeljenja rana, angiogenezi i apoptozi, uključujući razvoj upale u tijeku AP (42).

Još jedan rani prognostički biljeg AP je polimorfonuklearna elastaza. Njena osjetljivost u prvih 24 sata hospitalizacije bolesnika kod predviđanja teškog oblika AP iznosi 92%, a specifičnost 91%. Polimorfonuklearna elastaza pokazuje 78%-tni PPV i 96%-tni NPV. Sve te karakteristike čine taj parametar vrijednim prognostičkim biljegom AP. Usto, on je lako dostupan u kliničkoj praksi (43).

Istraživači se usredotočuju na potragu za najboljim mogućim prognostičkim čimbenikom AP. U kliničkoj se praksi, međutim, dijagnoza temelji na biološkim biljezima, kliničkoj procjeni i ostalim laboratorijskim rezultatima uključenima u Ranson-ljestvicu ili APACHE II, te na slikovnim ispitivanjima koja se koriste da bi se definirao kompjutorsko-tomografski pokazatelj težine bolesti (CTSI). Točnu prognozu tijeka AP nije moguće postaviti sve dok nisu određeni svi ti parametri tako da se može započeti s najboljom mogućom terapijom.

 

Literatura

1.    Bradley El III. A clinically based classification system of acute pancreatitis. Arch Surg 1993;128:586-90.

2.    Osman MO, Jensen SL. Acute pancreatitis: the pathophysiological role of cytokines and integrins. New trends for treatment. Dig Surg 1999;16:347-62.

3.    Warzecha Z, Dembiński A, Ceranowicz P, Dembiński M, Cieszkowski J, Kuśnierz-Cabala B, et al. Influence of ischemic preconditioning on blood coagulation, fibrinolytic activity and pancreatic repair in the course of caerulein-induced acute pancreatitis in rats. J Physiol Pharm 2007;58:303-19.

4.    Dembiński A, Warzecha Z, Ceranowicz P, Dembiński M, Cieszkowski J, Pawlik WW, et al. Effect of ischemic preconditioning on pancreatic regeneration and pancreatic expression of vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor-a in ischaemia/reperfusion-induced pancreatitis. J Physiol Pharm 2006;57:39-58.

5.    Carroll JK, Herrick B, Gipson T, Lee SP. Acute pancreatitis: diagnosis, prognosis and treatment. Am Fam Physician 2007;75:1513-20.

6.    Wereszczyńska-Siemiątkowska U, Siemiątkowski A. [Rola układu immunologicznego w ostrym zapaleniu trzustki-znaczenie cytokin i cząsteczek przylegania]. Medical Science Review 2002; 84-90. (na poljskom)

7.    Apte M, McCarroll J, Pirola R, Wilson J. Pancreatic MAP kinase pathways and acetaldehyde. Novartis Found Symp 2007;285:200-11.

8.    Ren HP, LiZS, Xu GM, Tu ZX, Shi XG, Jia YT, Gong YF. Dynamic changes of mitogen-activated protein kinase signal transduction in rats with severe acute pancreatitis. Chin J Dig Dis 2004;5:123-5.

9.    Samuel I, Zaheer A, Fisher RA. In vitro evidence for role of ERK, p38 and JNK in exocrine pancreatic cytokine production. J Gastrointest Surg 2006;10:1376-83.

10.  Schmid RM, Adler G. NF-κβ/Rel/lκβ: implications in gastrointestinal diseases. Gastroenterology 2000;118:1208-28.

11.  Naruse S. Molecular pathophysiology of pancreatitis. Intern Med 2003;42: 288-9.

12.  Szmola R, Kukor Z, Sahin-Toth M. Human mesotrypsin in a unique digestive protease specialized for the degradation of trypsin inhibitors. J Biol Chem 2003;278:48580-9.

13.  Whitcomb DC, Gorry MC, Preston RA, Furey W, Sossenheimer MJ, Ulrich CD et al. Hereditary pancreatitis is caused by a mutation in the cationic trypsinogen gene. Nat Genet 1996;14:141-5.

14.  Etemad B, Whitcomb DC. Chronic pancreatitis: diagnosis, classification and a new genetic developments. Gastroenterology 2001;120:682-707.

15.  Michell RM, Byrne MF, Baillie J. Pancreatitis. Lancet 2003;361:1447-55.

16.  Clavien PA, Burgan S, Moossa AR. Serum enzymes and other laboratory tests in acute pancreatitis. Br J Surg 1989;76:1234-43.

17.  Smotkin J, Tenner S. Labolatory diagnostic tests in acute pancreatitis. J Clin Gastroenterol 2002;34:459-62.

18.  Adler G. Acute pancreatitis. Falk Symposium 161. Future Perspectives in Gastroenterology, 2007; 61.

19.  Neoptoloemos JP, Kemppainen EA, Mayer JM, Fitzpatrick JM, Raraty MG, Slavin J et al. Early prediction of severity in acute pancreatitis by urinary activation peptide: a multicentre study. Lancet 2000;355:1955-60.

20.  Methuen T, Kylänpää L, Kekäläinen O, Halonen T, Tukiainen E, Sarna S, et al. Disialotransferrin, determined by capillary electrophoresis, is an accurate biomarker for alcoholic cause of acute pancreatitis. 2007;34:405-9.

21.  Vermeire S, van Assche G, Rutgeerts P. The role of C-reactive protein as an inflammatory marker in gastrointestinal diseases. Nat Clin Pract Gastroentrol Hepatol 2005;2:580-6.

22.  Frossard JL, Hadengue A, Pastor CM. New serum markers for the detection of severe acute pancreatitis in humans. Am J Respir Crit Care Med 2001;164: 162-0.

23.  Olczyk P, Kozma EM, Olczyk K, Komosińska-Vassev K. Biochemical diagnostics in acute pancreatitis and outcome prediction. Przeg Lek 2004;61: 1420-7.

24.  Triester SL, Kowdley KV. Prognostic factors in acute pancreatitis. J Clin Gastroenterol 2002;34:167-6.

25.  Gürleyik G, Emir S, Kilicoglu G, Arman A, Saglam A. Computerized tomography severity index, APACHE II score and serum CRP concentration for predicting the severity of acute pancreatitis. JOP 2005;10:562-7.

26.  Norman JG, Fink GW, Denham W, Yang J, Carter G, Sexton C, et al. Tissue-specific cytokine production during experimental acute pancreatitis. Dig Dis Sci 1997;42:1783-8.

27.  Jiang CF, Shiau YC, Ng KW, Tan SW. Serum interleukin-6, tumor necrosis factor alpha and C-reactive protein in early prediction of severity of acute pancreatitis. J Chin Med Assoc 2004;67:442-6.

28.  Brady M, Bhatia M, Zagorski J. Expression of the rat chemokines in inflammation. Arch Immunol Ther Exp 1999;60:370.

29.  Berney T, Gasche Y, Robert J, Jenny A, Mensi N, Grau G et al. Serum profiles of interleukin-6, interleukin-8 and interleukin10 in patients with severe and mild acute pancreatitis. Pancreas 1999;18:317-77.

30.  Ueda T, Takyeama Y, Yasuda T, Shinzeki M, Nakajima T, Takase K, et al. Serum interleukin-15 level is a useful predictor of the complications and mortality in severe acute pancreatitis. 2007;142:319-26.

31.  Hanck C, Bertsch T, Rossol S, Kurimoto M. Enhanced serum levels of IL-18 in patients with severe acute pancreatitis. Digestion 1999;60:379.

32.  Malleo G, Mazzon E, Siriwardena AK, Cuzzocrea S. Role of tumor necrosis factor-alpha in acute pancreatitis: from biological basis to clinical evidence. Shock 2007;28:130-40.

33.  Malleo G, Mazzon E, Genovese T, Di Paola R, Muia C, Centorrino T, Siriwardena AK, Cuzzocrea S. Etanercept attenuates the development of cerulean-induced acute pancreatitis in mice: a comparison with TNF-alpha genetic deletion. Shock 2007;27:542-51.

34.  Sato N, Endo S, Kasai T, Inoue Y, Fujino Y, Onodera M, et al. Relationship of the serum procalcitonin level with the severity of acute pancreatitis. Res Commun Mol Pathol Pharmacol 2004;115-116:243-9.

35.  Rau BM. Predicting severity of acute pancreatitis. Curr Gastroenterol Rep 2007;9:107-15.

36.  Bülbüller N, Dogru O, Ayten R, Akbulut H, Ilhan YS, Cetinkaya Z. Procalcitonin is a predictive marker for sever acute pancreatitis. Ulus Travma Acil Cerrahi Derg 2006;12:115-20.

37.  Browne GW, Pitchumoni CS. Pathophysiology of pulmonary complications of acute pancreatitis. World J Gastroentrol 2006;12:7087-96.

38.  Keck T, Jargon D, Klünsch A, Thomusch O, Richter S, Friebe V.MMP-9 in serum correlates with the development of pulmonary complication in experimental acute pancreatitis. Pancreatology 2006;6:316-22.

39.  Chen P, Yuan Y, Wang S, Zhan L., Xu J. Serum matrix metalloproteinase 9 as a marker for the assessment of severe acute pancreatitis. Tohoku J Exp Med 2006;208:261-6.

40.  Rahman SH, Menon KV, Holmfield JH, McMahon MJ, Guillou JP. Serum macrophage migration inhibitory factor is an early marker of pancreatic necrosis in acute pancreatitis. ANN Surg 2007;245:282-9.

41.  Lu XL, Cai JT, Lu XG, Si JM, Qian KD. Plasma level of thrombomodulin is an early indication of pancreatic necrosis in patients with acute pancreatitis. 2007; 46: 441-5.

42.  Liu LR, Xia SH. Role of platelet-activating factor in the pathogenesis of acute pancreatitis. World J Gastroenterol 2006;12:539-45.

43.  Dominguez-Munoz JE, Villanueva A, Larino J, Mora T, Barreiro M, Iglesias-Canle J., Iglesias-Garcia J. Accuracy of plasma levels of polymorphonuclear elastase as early prognostic marker of acute pancreatitis in routine conditions. Eur J Gastroenterol Hepatol 2006;18:79-83.

Izvorni znanstveni članak

 

Margareta Radić Antolic1, Renata Zadro1*, Dubravka Sertić2, Boris Labar2. Praćenje odgovora bolesnika oboljelih od kronične mijeloične leukemije na liječenje inhibitorima tirozin-kinaze kvantitativnom lančanom reakcijom polimeraze u stvarnom vremenu. Biochemia Medica 2009;19(1):63-72.
 
1Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Klinički bolnički centar Zagreb, Zagreb
2Klinika za unutarnje bolesti, Klinički bolnički centar Zagreb, Zagreb
Corresponding author*:  rzadro [at] mef [dot] hr
 
Sažetak
 
Uvod: Kroz povijest je terapija kronične mijeloične leukemije (engl. chronic myeloid leukemia, CML) imala puno revolucionarnih pomaka,među kojima je najvažniji uvođenje imatinib mesilata (engl. imatinib mesylate, IM). Preciznija procjena terapijskog odgovora na IM i točno mjerenje stupnja smanjenja prijepisa BCR-ABL, može se postići upotrebom kvantitativne lančane reakcije polimeraze u stvarnom vremenu (engl. real-time quantitative polymerase chain reaction, RQ-PCR).
Cilj: Kvantificirati prijepise BCR-ABL kod bolesnika s CML i promatrati odgovor na liječenje inhibitorima tirozin-kinaze.
Materijali i metode: U istraživanje je bio uključen 31 bolesnik liječen pomoću IM. Napravljena je RQ-PCR prema protokolu Europe Against Cancer s ABL kao „kućepaziteljskim” genom (engl. housekeeping gene) i izračunat je omjer BCR-ABL/ABL. Bolesnici su podijeljeni u skupine prema kriterijima Europske mreže za leukemiju (engl. European Leukemia Net) za postizanje značajnog molekularnog odgovora (engl. major molecular response, MMoR). I. skupina sastojala se od 11 bolesnika sa smanjenjem višim od 3 log, II. skupina od 13 bolesnika sa smanjenjem nižim od 3 log, a III. skupina od 7 bolesnika koji su bili manje od 18 mjeseci na kontrolama i praćenju.
Rezultati: Bolesnici I. skupine, koji su bili pozitivni ili negativni na prijepis BCR-ABL, odgovarali su na terapiju u vremenu od 2 godine praćenja i kontrola te su ispunili kriterije za povoljnu dugoročnu prognozu. Bolesnici II. skupine nisu odgovarali na terapiju pomoću IM te su zahtijevali drugačiji terapijski pristup, višu dozu istog inhibitora tirozin-kinaze ili drugu generaciju lijeka. Sedmoro bolesnika III. skupine kojima je nedavno dijagnosticirana bolest, praćeni su manje od 18 mjeseci pa im se MMoR nije mogao procijeniti. Primjenom iste analogije kao kod prve dvije skupine, može se napraviti prognoza tijeka bolesti.
Zaključak: Naši rezultati pokazuju da je RQ-PCR obvezna metoda za pažljivo promatranje odgovora na liječenje inhibitorima tirozin-kinaze, radi omogućavanja ispravne terapije te kako bi se odlučilo treba li mijenjati terapiju, a u slučaju da treba, kada to učiniti.
Ključne riječi:kronična mijeloična leukemija; imatinib mesilat; kvantitativna lančana reakcija polimeraze; značajni molekularni odgovor.
 
Pristiglo: 6. lipnja 2008.                                                                                                           Prihvaćeno: 19. studenog 2008.
 
Uvod
 
Kronična mijeloična leukemija (engl. chronic myeloid leukemia, CML) otkrivena je u prvoj polovini 19. stoljeća (1). Ovaj tip leukemije obilježava pojačana granulocitopoeza u koštanoj srži i perifernoj krvi. Bitan znak CML je tzv. filadelfijski kromosom (engl. Philadelphia chromosome, Ph chromosome), rezultat translokacije t(9;22) najvjerojatnije u jednoj hematopoetskoj matičnoj stanici. Taj tip preraspodjele gena s uskog dijela kromosoma (engl. breakpoint cluster region, BCR) na kromosomu 22 na područje kinaze ABL na kromosomu 9, rezultira stvaranjem fuzijskog gena BCR-ABL. Proizvod fuzijskog gena je protein BCR-ABL, čija prejaka tirozin-kinazna aktivnost stimulira povećano stvaranje stanica (2).
Kroz povijest je bilo puno revolucionarnih pomaka u terapiji CML. Jedan od najčešće upotrebljavanih lijekova 50-ih godina prošloga stoljeća bio je busulfan, no nakratko je zamijenjen hidroksikarbamidom. Za interferon-alfa, koji je uveden u terapiju 80-tih godina, dokazano je da dovodi do negativnog nalaza Ph kromosoma u koštanoj srži. Između 1980. i 2000. presađivanje koštane srži bila je prva terapijska opcija kod mladih bolesnika s HLA-podudarnim darivateljima (engl. HLA-matched donors). Najvažnije otkriće u liječenju bio je inhibitor tirozin-kinaze ABL, imatinib mesilat (engl. imatinib mesylate, IM). IM je 2-fenilaminopirimidinski spoj, mala molekula koja uspješno blokira kinaznu aktivnost proteina BCR-ABL. IM zauzima mjesto vezanja ATP u proteinu BCR-ABL, uzrokujući zatvorenu konfiguraciju i inhibiciju enzimske aktivnosti proteina (2). IM se uzima oralno s početnom dozom od 400 mg na dan i zlatni je standard za prvu terapiju kod bolesnika s tek dijagnosticiranom CML, zbog ograničene toksičnosti i visoke stope povoljnog terapijskog odgovora.
Učestalost potpunog citogenetičkog odgovora (engl. complete cytogenetic response, CCyR) vrlo je visoka kod bolesnika koji su uzimali IM, što se vidi iz činjenice da u praćenim uzorcima nije nađena pozitivna Ph metafaza. Jednom kada bolesnik postigne CCyR, kvantitativna lančana reakcija polimerazom u stvarnom vremenu (engl. real-time quantitative polymerase chain reaction, RQ-PCR) je metoda koja daje najviše informacija o količini prijepisa BCR-ABL (1,4). Kod ove je metode broj prijepisa BCR-ABL u korelaciji s brojem prijepisa kontrolnog gena (ABL), koji je u stanicama zahvaćenim leukemijom izražen u približno istoj količini kao i u zdravim stanicama. Općenito se rezultat izražava kao logaritam smanjenja omjera BCR-ABL/ABL. Smanjenje od 3 ili više log omjera BCR-ABL/ABL unutar 18 mjeseci zove se značajnim molekularnim odgovorom (engl. major molecular response, MMoR) (2,4). Pokazalo se da je točno mjerenje smanjenja prijepisa BCR-ABL obrnuto proporcionalno s vjerojatnošću progresije bolesti (1).
Nadalje, bolesnici koji su odgovorili na terapiju mogu ostati pozitivni i stabilni ili negativni za prijepis BCR-ABL tijekom kontrola i praćenja. Za bolesnike koji ne odgovaraju na lijek ili za one koji nikada ne odreagiraju na terapiju, praćenje omjera BCR-ABL/ABL od velike je važnosti, kako bi se mogla revidirati strategija terapije. Velik dio tih bolesnika razvija otpornost na lijek, što je uzrokovano mutacijama na području kinaze ABL (5) ili pokazuju nedefinirane individualne farmakokinetičke varijacije. Moguće liječenje takvih bolesnika jest povećanje doze IM (600 ili 800 mg na dan), korištenje inhibitora tirozin-kinaze druge generacije (nilotinib, dasatinib) ili presađivanje koštane srži (2).
Cilj ovoga istraživanja bio je procijeniti djelotvornost protokola liječenja i postići bolju procjenu odgovora pojedinih bolesnika na liječenje pomoću IM primjenom osjetljive tehnike mjerenja omjera BCR-ABL/ABL metodom kvantitativne lančane reakcije polimeraze, kako bi se bolesnici stratificirali prema riziku od relapsa bolesti te kako bi se individualizirao protokol liječenja.
 
Materijali i metode
 
U istraživanje je bio uključen 31 bolesnik (13 žena i 18 muškaraca) s dijagnozom CML. Desetoro bolesnika bilo je prethodno liječeno busulfanom ili interferonom-alfa, dok je kod 21 bolesnika CML bila tek nedavno dijagnosticirana. Postavljanje dijagnoze i liječenje odvijalo se na Klinici za unutarnje bolesti Kliničkog bolničkog centra Zagreb. Početna doza IM za sve bolesnike bila je 400 mg na dan. Bolesnici su praćeni 39 mjeseci (medijan; raspon 3–81).
RNA je izolirana iz koštane srži ili stanica periferne krvi pomoću komercijalnog reagens paketa QuickPrep mRNA purification kit (GE Healthcare, UK) prema uputama proizvođača. RQ-PCR je provedena prema protokolu EAC uz primjenu tehnologije TaqMan (LightCycler, Roche) (6). Reverzna transkripcija RNA odvijala se u volumenu reakcijske smjese od 20 μL uporabom FirstStrand cDNA synthesis kit (Amersham Biosciences, UK). Amplifikacija fuzijskog gena BCR-ABL i ABL kao kontrolnog gena (RQ-PCR) napravljena je setom FusionQuantKit za analizu gena BCR-ABL metodom RQ-PCR Mbcr (Ipsogen, France) prema uputama proizvođača. Svi su uzorci fuzijskog gena BCR-ABL i gena ABL analizirani tri puta te je izračunat omjer BCR-ABL/ABL (7).
Od neliječenih bolesnika pri dijagnozi je iz odnosa BCR-ABL/ABL dobivena standardizirana osnovna vrijednost koja je zatim upotrebljena za izračun log vrijednosti pada fuzijskog prijepisa u svim uzorcima u vremenu praćenja (1,6)
Bolesnici su podijeljeni u skupine prema izračunatom log smanjenju omjera BCR-ABL/ABL tijekom 18 mjeseci promatranja na IM terapiji. U I. skupini bilo je 11 bolesnika koji su postigli više od 3 log smanjenja u 18 mjeseci, u II. skupini bilo je 13 bolesnika koji su imali smanjenje manje od 3 log u 18 mjeseci terapije pomoću IM, dok je u III. skupini bilo 7 bolesnika koji su bili na promatranju manje od 18 mjeseci.
 
Rezultati
 
Ukupno je 31 bolesnik s dijagnosticiranom CML započeo terapiju pomoću IM (400 mg na dan) i bio na promatranju 39 mjeseci (medijan; raspon 3–81). Tijekom razdoblja promatranja i odlazaka na kontrole 6 od 31 bolesnika bilo je negativno za prijepis BCR-ABL, što je izmjereno pomoću RQ-PCR. Rezultati stope terapijskog odgovora na IM unutar 18 mjeseci za I. i II. skupinu te posljednji uzorak promatranja III. skupine prikazani su na slici 1.
 
 
Slika 1. Log smanjenje omjera BCR-ABL/ABL u ispitivanim grupama dosegnuto u 18 mjeseci (grupa I i II) i u uzorcima praćenim <18 mjeseci (grupa III). MMoR – glavni molekularni odgovor.
 
Rezultati 11 bolesnika (I. skupina) koji su postigli smanjenje od 3 ili više log i time ispunili kriterije za MMoR prikazani su u tablici 1. Shematski prikaz promatranja IM terapije i reakcije na terapiju u toj skupini nalazi se na slici 2a. Ti su bolesnici bili promatrani tijekom 39 mjeseci (medijan; raspon 22–63) a MMoR su zadržali 21 mjesec (medijan; raspon 4–45). Od trenutka postizanja MMoR kod šestoro tih bolesnika, uključujući i troje prethodno liječenih busulfanom i interferonom-alfa, prijepis BCR-ABL je bio negativan tijekom 25 mjeseci (medijan; raspon 4–45). Niti kod jednog od tih bolesnika nije bilo recidiva bolesti. Ostalih četvoro bolesnika bilo je periodično pozitivno na prijepis BCR-ABL u promatranom vremenu od 29 mjeseci (medijan; raspon 11–42). Jedan od njih više nije reagirao na terapiju te je, nakon 11 mjeseci promatranja i kontrola, došlo do recidiva. Samo je jedan bolesnik pozitivan za prijepis BCR-ABL odgovorio na terapiju tijekom 14 mjeseci, u jednom trenutku odgovor se izgubio, no nije došlo do recidiva.
 
Tablica 1. Rezultati praćenja grupe I
 
 
Rezultati 13 bolesnika (II. skupina) koji u 18 mjeseci nisu odgovorili na IM terapiju prikazani su u tablici 2. Shematski prikaz promatranja IM terapije bez postignutog MMoR u II. skupini nalazi se na slici 2b. Kod ovih bolesnika promjene u terapiji dogodile su se nakon 27-mjesečnog promatranja (raspon 7–67 mjeseci) kad je šest bolesnika započelo s povećanom dozom IM (600 ili 800 mg na dan). U razdoblju praćenja od 15 mjeseci (raspon 6–41) nitko od njih nije pozitivno odgovorio na terapiju. Jedan od ovih bolesnika započeo je uzimati dasatinib, nakon što se pokazalo da IM terapija nije uspješna (vrijeme praćenja 41 mjesec) i u 9 mjeseci je postigao više od 3 log smanjenja. Ostala dva bolesnika na terapiji dasatinibom postigla su manje od jednog log smanjenja u 14, odnosno 25 mjeseci praćenja i dolazaka na kontrolu. Druga su dva bolesnika bila na terapiji nilotinibom, od kojih je jedan u 10 mjeseci postigao smanjenje od samo 0,2 log, a drugi 2,2 log u 5 mjeseci. Bolesnik negativan za prijepis BCR-ABL, kod kojega nije došlo do odgovora na IM terapiju, bio je 11 mjeseci kasnije podvrgnut presađivanju koštane srži. Sedmoro bolesnika iz ove skupine bilo je prethodno liječeno busulfanom i interferonom-alfa. Petoro od njih, kao i dvoje od šestoro bolesnika sa novodijagnosticiranom CML, nisu odgovorili na promjenu terapije. Za dva bolesnika koji su prethodno liječeni busulfanom i interferonom-alfa ne postoje podaci o tijeku terapije.
 
 
Tablica 2. Rezultati praćenja grupe II
 
 
 
 
Slika 2. Praćenje bolesnika na terapiji s IM: a) odgovor na terapiju IM u grupi I, b) bez odgovora na terapiju IM u grupi II. BMT – transplantacija koštane srži, MMoR – glavni molekularni odgovor
 
 
III. skupina uključivala je sedam bolesnika kojima je nedavno dijagnosticirana CML (Tablica 3.) i koji su bili na promatranju manje od 18 mjeseci (medijan 8 mjeseci, raspon 3–12 mjeseci) te im se stoga MMoR nije mogao procijeniti. Dvoje od njih postiglo je smanjenje 3 log u 3, odnosno 10 mjeseci praćenja, ostalo dvoje postiglo je smanjenje od 2 log u 3, odnosno 8 mjeseci. Posljednja 3 bolesnika postigla su smanjenje manje od 2 log u 6 mjeseci (medijan, raspon 3–12).
 
Tablica 3. Rezultati praćenja grupe III
 
 
Rasprava
 
U hematologiji su metode mjerenja osnovni alati, naročito u slučaju leukemije, gdje su brojanje i identifikacija stanica u krvi i koštanoj srži tradicionalne metode (8). Dugo se odgovor na terapiju za CML mjerio brojem stanica zahvaćenih leukemijom koje potiču od pojačane granulocitopoeze. S vremenom je poboljšanje terapije počelo zahtijevati osjetljivije tehnike za bolju procjenu odgovora (9). Šezdesetih godina prošloga stoljeća otkrivena je specifična anomalija kromosoma u CML, poznata kao Ph kromosom. Identifikacija i kvantifikacija Ph pozitivnih metafaza postala je dragocjen podatak pri potvrđivanju dijagnoze i praćenju terapijskog odgovora (1,2). Međutim, želja za daljnjim unapređenjem osjetljivosti dovela je do uvođenja molekularnih tehnika za mjerenje prijepisa BCR-ABL. Otkriće inhibitora tirozin-kinaze ABL, imatinib mesilata, bila je revolucionaran korak u liječenju CML a jedina metoda za mjerenje razine postignute remisije je kvantitativna lančana reakcija polimerazom u stvarnom vremenu (2,7,11). Mjerenje razine prijepisa BCR-ABL, izraženog kao log smanjenja omjera BCR-ABL/ABL, rabi se u svrhu omogućavanja bolje procjene terapijskog odgovora na IM pojedinačnih bolesnika te za ocjenu djelotvornosti protokola liječenja. Može se rabiti i za stratifikaciju bolesnika prema riziku od pojave recidiva, a presudan je u preispitivanju terapijske strategije.
Iako potpuna procjena odgovora prema udruženju Europske mreže za leukemiju (engl. European Leukemia Net) uključuje kliničku procjenu, krvnu sliku, citogenetičku analizu koštane srži i izračunavanje omjera BCR-ABL/ABL svaka 3 mjeseca od početka terapije (2), u ovom istraživanju je za promatranje bolesnika s CML u standardnom protokolu liječenja pomoću IM primijenjeno samo log smanjenje omjera BCR-ABL/ABL. Općenito, smanjenje omjera BCR-ABL/ABL u bliskoj je uzajamnoj vezi s zadovoljavajućim hematološkim i citogenetičkim odgovorom. Poznato je da je smanjenje omjera BCR-ABL/ABL od 2 log tijekom 12 mjeseci promatranja u skladu s Ph negativnim nalazom u koštanoj srži (CCyR) (10). U tom je razdoblju RQ-PCR jedini način za daljnje promatranje molekularnog odgovora koji ovisi o stopi i stupnju smanjenja prijepisa BCR-ABL (2,11).
Bolesnici I. skupine odgovorili su na terapiju i bili su pozitivni ili negativni za prijepis BCR-ABL tijekom dvogodišnjih dolazaka na kontrolu i promatranja te su ispunili kriterije za povoljnu dugoročnu prognozu prema navodima iz literature (10). Unatoč tome, praćenje treba provoditi neograničeno dugo te uključiti i bolesnike s negativnim prijepisom BCR-ABL što je različito od potpune molekularne remisije jer je RQ-PCR nedovoljno osjetljiva metoda (2,11). Rezultati I. skupine pokazuju, da čak i kod takvih bolesnika, terapijski odgovor (MMoR) može izostati te mogu doživjeti recidiv zbog stečene otpornosti na IM ili zbog interakcija s drugim lijekovima. Jedan od bolesnika nije više odgovarao na terapiju u trenutku kad je počeo uzimati kompetitivni lijek (tamsulosin hidroklorid). Taj je bolesnik, kad je prestao uzimati tamsulosin hidroklorid, postao opet negativan za prijepis BCR-ABL. Teoretski, mehanizam reakcije mogao bi biti kompeticija s IM za prenosioce te posljedično tome stanična raspoloživost IM. Još je jedan bolesnik pozitivan za prijepis BCR-ABL, koji je pozitivno odgovarao na terapiju, doživio recidiv nakon 11 mjeseci, što predstavlja razlog više da ove bolesnike valja pažljivije promatrati, kako bi se mogao predvidjeti tijek bolesti i mogući recidiv.
Bolesnici iz II. skupine nisu reagirali na terapiju pomoću IM. Većini je CML dijagnosticirana godinama prije uvođenja IM u terapiju CML, pa su uzimali busulfan i interferon-alfa u različitim razdobljima, te stoga nisu reprezentativni za procjenu djelotvornosti liječenja. Za mali broj bolesnika iz ove skupine kojima je nedavno dijagnosticirana CML i kod kojih uzimanjem IM nije došlo do reakcije bio je, prema navodima iz literature, potreban drukčiji pristup: viša doza IM i drugih inhibitora tirozin-kinaze (10). Naši su rezultati pokazali da je povećana doza IM izazvala trenutan odgovor kod malog broja bolesnika, no niti jedan od njih nije dugoročno odgovorio na terapiju (Tablica 2.). S druge strane, uvođenje i upotreba druge generacije inhibitora tirozin-kinaze ABL, dasatiniba i nilotiniba, što ovisi o dokazanoj točkastoj mutaciji kod bolesnika otpornog na IM (s iznimkom mutiranog klona T315I), daje snažnu stopu povoljnog terapijskog odgovora (2). Rezultati dvaju bolesnika koji su reagirali na terapiju u manje od godinu dana nakon početka terapije, jedan dasatinibom, a drugi nilotinibom, potvrđuju djelotvornost ovih lijekova. Potaknuta su daljnja istraživanja kako bi se ispitala dugoročna djelotvornost ovih lijekova i moguće neželjene nuspojave. Da je presađivanje koštane srži još uvijek terapija prvoga izbora kod mladih bolesnika otpornih na IM s HLA-odgovarajućim darivateljem, potvrđuje slučaj bolesnika iz II. skupine. Taj bolesnik nije reagirao na terapiju IM, no nakon transplatacije je u godinu dana praćenja postigao i zadržao MMoR.
 
Ako se upotrijebi analogija dviju posljednjih skupina, može se zaključiti da bi se daljnji tijek bolesti mogao predvidjeti i za bolesnike III. skupine, za sedmoro bolesnika kojima je nedavno dijagnosticirana CML i kod kojih je primijenjen IM kao prva linija terapije. Dva bolesnika postigla su smanjenje više od 3 log jedan u 6, a drugi u 10 mjeseci. Druga dva su u 3, odnosno 8 mjeseci postigli smanjenje više od 2 log. Razumno je očekivati da ti bolesnici postignu i zadrže MMoR. Zadnja su tri bolesnika u 6 mjeseci imali smanjenje manje od 2 log, ali je još uvijek prerano predviđati neuspjeh, usprkos slabom terapijskom odgovoru na IM.
Zaključno, uspjeh terapije pomoću IM u liječenju CML potaknuo je izradu preporuka koje se temelje na objavljenim istraživanjima (1,2,6,7). Bolesnici kojima je dijagnosticirana CML, trebali bi proći početno liječenje pomoću IM (početna doza 400 mg na dan) i u slučaju pozitivne reakcije, terapiju treba nastaviti bez vremenskog ograničenja. Svi se bolesnici trebaju pratiti u određenim razdobljima, što uključuje izradu kliničke procjene, krvne slike, citogenetičke procjene koštane srži i mjerenja fuzijskog prijepisa BCR-ABL svaka 3 mjeseca, kako bi se na svakoj kontroli odredilo radi li se o osobi koja ne odgovara na terapiju pomoću IM i otporna je na IM. Bolesnici kod kojih terapija pomoću IM nema uspjeha ili koji više ne reagiraju na nju, moraju proći probir na mutacije kinaze ABL, kako bi se omogućila odgovarajuća promjena u terapiji. Uvođenje i upotreba druge generacije inhibitora tirozin-kinaze ovisi o točkastoj mutaciji otkrivenoj na genu ABL te se ne preporuča bolesnicima s mutiranim klonom T315I. Takvi bolesnici imaju mogućnost presađivanja koštane srži ili primjene kemoterapije (hidroksikarbamid, interferon-alfa ili citarabin).
Rezultati zabilježeni u ovom istraživanju potvrđuju da pridržavanje preporuka omogućuje optimalno liječenje bolesnika s CML.
 
Literatura
 
 1.   Hughes T, Deininger M, Hochhaus A, Branford S, Radich J, Kaeda J, et al. Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood 2006;108:28-37.
 2.   Goldman JM. How I treat chronic myeloid leukemia in the imatinib era. Blood 2007;110: 2828-37.
 3.   Kantarjian HM, Cortes J, Guilhot F, Hochhaus A, Baccarani M, Lokey L. Diagnosis and management of chronic myeloid leukemia: a survey of American and European practice patterns. Cancer 2007;109:1365-75.
 4.   Baccarani M, Saglio G, Goldman J, Hochhaus A, Simonsson B, Appelbaum F, et al. Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European Leukemia Net. Blood 2006;108:1809-20.
 5.   De Keersmaecker K, Cools J. Chronic myeloproliferative disorders: a tyrosine kinase tale. Leukemia 2006;20:200-5.
 6.   Gabert J, Beillard E, van der Velden VH, Bi W, Grimwade D, Pallisgaard N, et al. Standardization and quality control studies of ‘real-time’ quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia 2003;17:2318-57.
 7.   Branford S, Cross NC, Hochhaus A, Radich J, Saglio G, Kaeda J, et al. Rationale for the recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts in patients with chronic myeloid leukaemia. Leukemia 2006;20:1925-30.
 8.   Morley A. Quantifying leukemia. N Engl J Med 1998;339:627-9.
 9.   Cross NC. Minimal residual disease in chronic myeloid leukaemia. Hematol Cell Ther 1998;40:224-8.
10.   Hochhaus A, Druker B, Sawyers C, Guilhot F, Schiffer CA, Cortes J, et al. Favorable long-term follow-up results over 6 years for response, survival, and safety with imatinib mesylate therapy in chronic-phase chronic myeloid leukemia after failure of interferon-alpha treatment. Blood 2008;111:1039-43.
11.   Marušić Vrsalović M, Kušec R, Pejša V, Romić Ž. Comparison of sensitivity of nested PCR and quantitative PCR in Bcr-Abl p210 transcript detection in chronic myelogenous leukemia. Biochemia Medica 2007;17:109-15.

Pregledni članak

 

Syed Kashif Nawaz, Shahida Hasnain*. Pleotropni učinci polimorfizma ACE. Biochemia Medica 2009;19(1):36-49.
 
Odsjek za mikrobiologiju i molekularnu genetiku, Sveučilište u Punjabu, Lahore, Pakistan
 
Corresponding author*: genetic [at] brain [dot] net [dot] pk
 
Sažetak
 
Angiotenzin-konvertirajući enzim (engl. angiotensin converting enzyme, ACE) ima vitalnu ulogu u normalnoj ljudskoj fiziologiji zbog svojeg izravnog djelovanja u sustavu renin-angiotenzin-aldosteron (RAAS), sustavu kinin-kalikrein, in vitro razgradnji amiloid-beta-peptida, aktivnosti GPI-aze (glikozilfosfatidilinozitol, GPI) te u signalnoj transdukciji. Budući da na aktivnost ACE snažno utječe insercijsko-delecijski (I/D) polimorfizam gena ACE, prikupljeno je mnoštvo podataka, kako bi se razjasnila udruženost I/D polimorfizma s kardiovaskularnim i ostalim bolestima poput šećerne bolesti, dijabetičke nefropatije, dijabetičke retinopatije, ateroskleroze, koronarne bolesti srca, moždanog udara, hipertenzije, Alzheimerove bolesti, karcinoma i Parkinsonove bolesti. Ovaj će se pregled ograničiti na učinak I/D polimorfizma gena ACE na dugovječnost s obzirom na patofiziologiju nekih bolesti.
Ključne riječi: polimorfizam ACE; dugovječnost; prerana smrtnost; kardiovaskularne bolesti
 
Pristiglo: 22. listopada 2008.                                                                                                     Prihvaćeno: 8. prosinca 2008.
 
Angiotenzin-konvertirajući enzim (ACE)
Angiotenzin-konvertirajući enzim (engl. angiotensin converting enzyme, ACE) je karboksipeptidaza ovisna o kloridima i cinku, prisutna na površini epitelnih i endotelnih stanica. Kod ljudi se mogu naći njegove dvije izoforme. Jedna je veći protein sastavljen od 1300 aminokiselina (150–180 kDa) i zove se somatski ACE (sACE), zbog prisutnosti u somatskim tkivima. sACE se može usidriti u plazmatskoj membrani preko transmembranske domene ili može biti prisutan u krvi u topljivom obliku (1). Druga je izoforma manji protein sastavljen od 730 aminokiselina (100–110 kDa), prisutan samo u testisima te se stoga i zove germinalni ili testikularni oblik ACE (tACE). Njegova funkcija još nije sasvim jasna, no čini se da je uključen u fiziologiju muške plodnosti (2). Ove se dvije izoforme razlikuju u broju aktivnih mjesta: sACE ima dva aktivna mjesta, dok tACE ima samo jedno (3).
Glavne funkcije ACE su slijedeće:
- pretvorba dekapeptida angiotenzina I (neaktivna komponenta) u oktapeptid angiotenzin II (aktivna komponenta). Angiotenzin II uzrokuje suženje krvnih žila (vazokonstrikciju), otpuštanje aldosterona, posreduje u staničnom rastu i proliferaciji te inducira disfunkciju endotela (4-7);
- razgradnja bradikinina (neurokinin koji uzrokuje proširenje krvnih žila) omogućujući time sužavanje krvnih žila (3);
- put signalne transdukcije (8);
- in vitro razgradnja amiloid-beta-peptida (9);
- aktivnost GPI-aze čime se omogućuje otpuštanje glikozilfosfatidilinozitola (GPI) vezanog za membranu (10).
Genetika angiotenzin-konvertirajućeg enzima
Gen odgovoran za ekspresiju oba oblika sACE i tACE nalazi se na lokusu 17q23, dugačak je 21 kb i sastavljen od 26 eksona i 25 introna. Za ekspresiju pojedinih izoformi odgovorni su različiti promotori. Promotor za sACE leži u 5bočnoj regiji prvog eksona i odgovoran je za transkripciju eksona 1-12 i 14-26, dok promotor za tACE leži unutar introna 12 i regulira transkripciju eksona 13-26 (11,12). Mjesta inicijacije za transkripciju dviju mRNA koje dekodiraju te izoforme udaljena su 5,7 kb jedno od drugoga, a mjesta poliadenilacije su udaljena 628 bp (13).
Polimorfizam I/D u genu ACE
Rigat i sur. su 1990. uočili da u intronu 16 gena ACE dolazi do umetanja sekvence od 287 bp (NCBI ref. SNP ID: rs1799752) (14), rezultirajući intronskim (I) alelom, dok je delecijski (D) alel prisutan ako nema te insercije. Taj je polimorfizam odgovoran za razinu aktivnosti ACE, koja se udvostručava kod D/D homozigota, u odnosu na I/I homozigota. Kod I/D heterozigota, prisutna je srednja aktivnost gena ACE. Ta je kodominacija primijećena u aktivnosti gena ACE i u plazmi i u tkivu (15).
Otkrivanje polimorfizma I/D
Rigat i sur. su za otkrivanje I/D polimorfizma pomoću lančane reakcije polimeraze (engl. polymerase chain reaction, PCR) rabili set početnica na bočnoj strani regije insercije (14). Problem s uporabom ove metode je 5-10% pogrešaka pri genotipiziranju, pri čemu dolazi do predominantnog umnožavanje D alela, pa se jedan dio I/D heterozigota pogrešno prikazuje kao D/D heterozigoti (16). Za točnu genotipizaciju takvu je pogrešku bilo potrebno ukloniti. U tu su svrhu razni znanstvenici usvojili razne strategije. Shanguman i sur. su 1993. rabili 5%-nu otopinu dimetil-sulfoksida (DMSO) i sense početnicu na 5’ insercijskom kraju sekvence zajedno sa standardnom antisense početnicom (17). Kasnije je točnost metode poboljšana modifikacijom PCR, koja podrazumijeva postupno sniženje temperature prijanjanja (engl. step down PCR modification) (18).
Višestruka PCR metoda (engl. multiplex PCR) i PCR u stvarnom vremenu (engl. real-time PCR) također su se upotrebljavale u otkrivanju I/D polimorfizma, no niti jedna od njih nije uspjela zamijeniti Shangumanovu metodu, zbog problema povezanih s obradom nakon same metode PCR, kao što su elektroforeza na agaroznom gelu kod višestruke PCR i visoki troškovi PCR u stvarnom vremenu (19,20). Nedavno su Koyama i sur. (2008.) opisali brzu i jednostavnu tehniku koja obuhvaća denaturirajuću tekućinsku kromatografiju visoke djelotvornosti (engl. denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC). U uvjetima koji nisu denaturirajući, ona analizira PCR produkt za probiranje I/D polimorfizama u epidemiološkim genetskim istraživanjima (21). Ta metoda otklanja mogućnost pogrešnog određivanja i nudi 100% točnost kod I/D heterozigota, no zbog visokih troškova kromatografije nije isplativa.
Učinci polimorfizma I/D na ljudsko zdravlje
Utjecaj I/D polimorfizma na patofiziologijske uvjete kroz aktivnost ACE rezultirao je mnoštvom podataka koji svjedoče o njegovoj povezanosti s nekoliko bolesti (Tablica 1.). U ovom se pregledu o njegovoj ulozi u ljuskom zdravlju raspravlja u svjetlu prethodnih istraživanja o nekoliko pokazatelja zdravlja populacije.
 
Tablica 1. Udruženost bolesti s polimorfizmom gena ACE
 
 
Rast i polimorfizam ACE
Unutarmaterična okolina ima očigledan učinak na ekspresiju gena ACE koji naposlijetku utječe na trudnoću i početnu težinu novorođenčadi. Kajantie i sur. (2004.) su primijetili povezanost I/I genotipa s kraćim trajanjem trudnoće i većom težinom kod poroda, što kod odraslih neizravno znači da postoje manji izgledi za razvoj koronarne bolesti srca, šećerne bolesti tipa 2, inzulinske rezistencije i metaboličkog sindroma (22-24). Tako je, dakle, razvijen koncept da je alel I odgovoran za veću tjelesnu težinu pri porodu. Taj je koncept bio prihvatljiv sve dok Hindmarsh i sur. (2007.) nisu ustvrdili kako ne postoji povezanost genotipa ACE novorođenčeta ili njegovih roditelja sa porođajnom težinom (25). Međutim, I/I genotip pokazao je svoju pozitivnu ulogu u ranom rastu djece koja su unutar jedne fiskalne godine dobila na težini, povisio im se indeks tjelesne mase i povećao opseg nadlaktice u usporedbi s djecom s D/D genotipom, gdje većina ispitanika nije pokazivala promjene ili su pokazivali sniženje mjerenih parametara. Distribucija I/D genotipa bila je ravnomjerna u svim kategorijama. Ti su učinci bili istaknutiji kod muške populacije. Dakle, I/I genotip ima pozitivne učinke na rani rast nakon poroda.
Šećerna bolest i polimorfizam ACE
Postoje mnoga istraživanja koja pokazuju utjecaj I/D polimorfizma gena ACE na pojavu šećerne bolesti (26-29). No, nedavno objavljeni rezultati ne potvrđuju prethodne nalaze. Primjerice, opsežno praćenje u trajanju od 10,2 godina izvršeno kod 24.309 bjelkinja bez šećerne bolesti na početku ispitivanja nije uspjelo dokazati bilo kakvu povezanost ACE genotipa i šećerne bolesti (30). Taj se rezultat ponavljao u mnogim drugim istraživanjima na ispitanicima iz različitih etničkih skupina te na ispitanicima s nefropatijom i bez nje (31-33). Dakle, polimorfizam gena ACE ne može se predodrediti kao nezavisan čimbenik odgovoran za šećernu bolest. U svakom su slučaju potrebna daljnja istraživanja ostalih djelotvornih genetskih i okolišnih čimbenika, kako bi se utvrdila uloga polimorfizma ACE kod pojave šećerne bolesti.
Dijabetička nefropatija i polimorfizam ACE
Dijabetička nefropatija je najčešći razlog smrtnosti kod kroničnih bolesnika sa šećernom bolešću. Klinički uzrok bolesti varira od bolesnika do bolesnika. Meta-analiza Nga i sur. (2005.) na 14.727 bolesnika pokazala je značajno viši rizik od dijabetičke nefropatije kod nosilaca alela D, nego kod skupine sa genotipom divljeg tipa (I/I) (OR = 1,28; 95% CI = 1,14-1,45) (34). Rezultati Movvea i sur. (2007.) također su dokazali da su nosioci alela D koji boluju od šećerne bolesti tipa 2 podložniji dijabetičkoj nefropatiji (35).
Dijabetička retinopatija i polimorfizam ACE
Dijabetička retinopatija je sljepoća zbog oštećenja mrežnice uslijed komplikacija šećerne bolesti. Dosada se pretpostavljalo da je ACE glavni gen kandidat s predispozicijama za razvoj dijabetičke retinopatije. Rezultati Globocnik-Petrovica i sur. (2003.) pokazali su da nema povezanosti ACE genotipa s neproliferativnom, proliferativnom ili teškom proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (36). Međutim, istraživačke skupine Matsumota (2000.) i Fenghhija (2008.) promatrale su česte pojave genotipa D/D kod bolesnika koji boluju od proliferativne dijabetičke retinopatije u populaciji Japana (37) i Irana (38). Rezultati istraživanja Wiwanitkita i suradnika (2008.) također su zanijekali povezanost polimorfizma gena ACE s razvojem dijabetičke retinopatije (39). Zbog tih proturječnih rezultata teško je definirati ulogu polimorfizma gena ACE u razvoju dijabetičke retinopatije.
Ateroskleroza i polimorfizam gena ACE
Ateroskleroza se može dijagnosticirati mjerenjem debljine intime medije (engl. intima-media thickness, IMT), prilikom obdukcije i određivanjem stupnja koronarne kalcifikacije. Sayed-Tabatabaei i sur. (2003.) objavili su meta-analizu 23 objavljena članka do listopada 2002. s 9.833 ispitanika na temu ispitivanja povezanosti polimorfizma gena ACE s aterosklerozom, koja se temeljila na mjerenjima IMT (40). Podaci su pokazali jaku povezanost između alela D i uobičajene IMT karotidnih arterija. Ta je povezanost bila jača kod ispitanika s cerebrovaskularnim bolestima, šećernom bolešću ili povišenim krvnim tlakom. Slične su rezultate objavili Pawel i sur. (2008.) te Kretowski i sur. (2007.) (41,42). Treba primijetiti da pokusi koji uključuju dijagnostiku za vrijeme obdukcije i koronarnu kalcifikaciju za otkrivanje ateroskleroze nisu pokazali povezanost polimorfizma gena ACE s aterosklerozom (43,44). Nepodudarni rezultati dobiveni različitim dijagnostičkim metodama zahtijevaju pouzdanije dijagnostičke metode za potvrdu prisustva bolesti, što će pomoći pri pronalaženju uloge polimorfizma ACE kod ateroskleroze.
Povišeni krvni tlak i polimorfizam gena ACE
Za D/D genotip se vjerovalo da je povezan s povišenim krvnim tlakom, zbog povećane aktivnosti ACE. Kod različitih su varijanta gena ACE postojali različiti izgledi za pojavu povišenog krvnog tlaka, uslijed starenja i poremećenog noćnog krvnog tlaka (45,46). Prva je meta-analiza temeljena na 23 istraživanja s 28 kontrolnih skupina i 6.923 ispitanika pokazala 10%-no, ali statistički neznačajno, povećanje rizika od pojave povišenog krvnog tlaka. U svakom slučaju, postojala je statistički značajna povezanost između D/D genotipa i povišenog krvnog tlaka kod ispitanica i Azijata (47). Druga se meta-analiza ograničila na bijelce, no niti ona nije pokazala povezanost između ACE genotipa i povišenog krvnog tlaka (48). Rezultati Miyame i sur. (2007) i Glavnika i Petrovica (2007.) također ne pokazuju utjecaj alela genotipa ACE na pojavu povišenog krvnog tlaka (49,50). Postojanje proturječnih rezultata ukazuje na složenu interakciju polimorfizma gena ACE s čimbenicima okoline i ostalim genetskim čimbenicima za pojavu povišenog krvnog tlaka. Nedavno su Bautista i sur. (2008.) objavili da je genotip nezavisan čimbenik kod povišenog krvnog tlaka među Latinoamerikancima. Sličan je rezultat objavljen kod populacije Kineza, kod muške populacije u Bangladešu, Japanu i Argentini (51-55). Međutim, Napoles i sur. (2007.) nisu pronašli povezanost ACE genotipa i hipertenzije u Kubanskoj populaciji (56). Dakle, treba primijetiti da je utjecaj polimorfizma gena ACE različit kod različitih etničkih skupina. On predskazuje utjecaj različitih načina života i čimbenika okoline koji uzrokuju povišeni krvni tlak kod različitih etničkih skupina.
Koronarne srčane bolesti i polimorfizam gena ACE
Uloga D/D genotipa kod infarkta miokarda koju su promatrali Cambien i sur. (1992.) pobudila je veliko zanimanje znanstvenika, no proturječni su je rezultati učinili spornom (57). Meta-analiza koja je uključivala 1.918 ispitanika bijelaca (1.196 ispitanika eksperimentalne i 722 ispitanika kontrolne skupine) nije pokazala razliku u genotipu (P > 0,05), niti u alelima ACE (P > 0,05) između ispitanika eksperimentalne i ispitanika kontrolne skupine. Ukupni omjer rizika (OR) za alel D kao nezavisan čimbenik kod pojave moždanog udara bio je 1,31 u recesivnom modelu i 1,14 u dominantnom modelu. Taj rezultat pokazuje da je učinak alela D u recesivnom modelu skroman, ali nezavisan čimbenik rizika za pojavu moždanog udara (58). Međutim, te rezultate nije potvrdila opsežna meta-analizasastavljena od 46 istraživanja uključujući ukupno 32.175 ispitanika bijelaca (48). Njeni su rezultati pokazali povezanost polimorfizma gena ACE s aktivnosti enzima u plazmi, no ne i s kardiovaskularnim bolestima. Istraživanja meta-analize na populaciji Azijata također su pokazala nepostojanje povezanosti genotipa ACE i pojave bolesti (59). Slijedećih su godina ponovljeni isti rezultati (60,61). Može se zaključiti da ACE genotip ne pokazuje jaku udruženost s infarktom miokarda.
Alzheimerova bolest i polimorfizam ACE
Zbog in vitro razgradnje amiloid-beta-peptida koju provodi ACE, pretpostavljalalo se da ACE ima zaštitnu ulogu protiv Alzheimerove bolesti. Prvo su Kehoe i sur. (1999.) promatrali pozitivnu povezanost između I alela i Alzheimerove bolesti (62). Nakon toga su otkrili da je polimorfizam SNP rs 4343 pokazuje jaču povezanost s Alzheimerovom bolesti od SNP rs 4291, za koji se mislilo da je genetska varijanta odgovorna za nastanak Alzheimerove bolesti (63). Učinci polimorfizma gena ACE na Alzheimerovu bolest su nadalje potvrđeni meta-analizom Lehmanna i sur. (2005.) (64). Ta je meta-analiza uključivala 39 istraživanja, 6.037 bolesnika s Alzheimerovom bolesti i 12.099 kontrolnih ispitanika. Rezultati su ukazali na to da nosioci D/D polimorfizma imaju smanjeni rizik (OR = 0,81; 95% CI = 0,72-0,90; P < 0,001) za razvoj Alzheimerove bolesti. Kod I/I homozigota nije nađena povezanost, dok su heterozigoti bili skloniji razvoju Alzheimerove bolesti. Slični su rezultati zabilježeni među sjevernim Europljanima, bijelcima koji žive u južnijim krajevima i istočnim Azijatima. U svakom slučaju, kod sjevernih Europljana su obje analize, analiza povezanosti i Hardy-Weinbergova analiza, iz nepoznatog razloga ukazivale na djelomičnu heterogenost. Ti su rezultati ponovljeni i u drugim istraživanjima (65,66). Također su objavljeni neki nepodudarni rezultati koji otvaraju put daljnjim istraživanjima u potvrđivanju uloge gena ACE u manifestaciji bolesti (67-69). Postojanje većeg broja rezultata koji potvrđuju udruženost, nego onih koji ju negiraju, postavlja pretpostavku da nekoliko čimbenika igra ulogu u odluci je li polimorfizam gena ACE varijanta gena kandidata odgovorna za Alzheimerovu bolest.
Parkinsonova bolest
Malo se napravilo u pronalaženju bilo kakve povezanosti polimorfizma gena ACE s Parkinsonovom bolesti. Lin i sur. (2003.) su proveli istraživanje parova koje je obuhvaćalo 127 sporadično odabranih bolesnika s Parkinsonovom bolesti i 198 zdravih kontrolnih ispitanika. Primijetili su da je homozigotni D/D genotip bilo učestaliji kod bolesnika s Parkinsonovom bolesti, nego kod kontrolnih ispitanika (P = 0,048). Unatoč tome, nije bilo statistički značajne razlike u raspodjeli alela (P = 0,133) (70). Stupnjevita logistička regresija potvrdila je nezavisnu ulogu D/D genotipa kao čimbenika rizika za razvoj Parkinsonove bolesti (OR = 1,32; 95% CI = 1,12-2,16).
Lin i sur. (2007.) također su primijetili da je I/D polimorfizam gena ACE primarni predskazatelj pojave psihoze potaknute L-dopom kod bolesnika s Parkinsonovom bolesti (71). Dakle, preporuča se ACE genotipizacija kod bolesnika s Parkinsonovom bolesti, kako bi se identificirali bolesnici kod kojih postoji rizik od psihoze potaknute L-dopom te kako bi se umanjili izgledi razvoja psihoze. Ta istraživanja nisu dovoljna za donošenje krajnjeg zaključka o ulozi polimorfizma gena ACE, već traže potvrdu jednim kohortnim istraživanjem za praćenje kasne faze Parkinsonove bolesti.
Karcinom i polimorfizam gena ACE
Uključenost polimorfizma gena ACE u pojavu nekoliko malignih bolesti, proliferaciju i migraciju tumorskih stanica, angiogenezu i razvoj metastaza posredovana je angiotenzinom I/I, što dokazuje da je angiogenetski čimbenik i čimbenik rasta (72). Ta je informacija postala temeljem mnogih istraživanja povezanosti koja su se odnosila na različite vrste karcinoma. Spomenut ćemo rezultate samo nekih.
Karcinom dojke
Godine 2003. Koh i sur. su u okviru kohortnog istraživanja ispitali 189 slučajno odabranih bolesnica s karcinomom dojke i 671 kontrolnu ispitanicu, kako bi ispitali povezanost polimorfizma gena ACE sa karcinomom dojke u Singapuru (73). Primijećeno je da su nositeljice alela I imale manji rizik od karcinoma dojke od nositeljica alela D, što ukazuje na činjenicu da renin-angiotenzinski sustav može služiti kao terapijski cilj za liječenje i prevenciju karcinoma dojke. Taj su rezultat poduprla i mnoga druga istraživanja (74-76).
Karcinom usne šupljine
Vairaktaris i sur. (2007.) su primijetili da kod I/I homozigota postoji trostruko viši rizik od karcinoma usne šupljine, bez obzira na to je li bolesnik pušač ili konzumira alkohol, je li bolest u ranom ili uznapredovalom stadiju te ima li u obiteljskoj anamnezi slučajeva karcinoma ili trombofilije (77). Za potvrdu gore navedenih rezultata potrebno je provesti više analiza na većem uzorku.
Karcinom želuca
Röcken i sur. (2005.) nisu našli udruženost polimorfizma gena ACE s karcinomom želuca, no iste su godine Goto i sur. dobili nepodudarne rezultate (72,78). Njihovi su se rezultati temeljili na istraživanju na 454 Japanca koji su prošli sistematski pregled i 202 bolesnika s karcinomom želuca. Nije pronađena udruženost polimorfizma sa seropozitivnosti na Helibacter pylori ili atrofijom želuca. Međutim, I/D nosioci imaju povećani rizik od karcinoma želuca (OR = 1,59; 95% CI = 1,02-2,48).
Karcinom debelog crijeva
Röcken i sur. (2007.) proveli su pokuse u kojima su metodama kvantitativne lančane reakcija polimerazom nakon reverzne transkripcije (engl. reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) i imunohistokemije provjeravali lokalnu ekspresiju gena ACE kod karcinoma i adenoma debelog crijeva (79). Rezultati su pokazali veću proizvodnju proteina ACE kod adenoma (17 Š81%Ć) i epitelnih stanica raka (22 Š100%Ć) nego kod odgovarauće kripte koja nije maligna i površinskog epitela (2 Š10%Ć kripta i 2 Š9%Ć epitel). Štoviše, pronađena je povezanost polimorfizma gena ACE sa spolno specifičnim razlikama kod prvotne veličine tumora i stope preživljavanja bolesnika. U usporedbi s bolesnicima, kod bolesnica s rakom debelog crijeva češće je ustanovljen I/D genotip nego genotipovi I/I i D/D. Tumori kod I/D i D/D nosilaca (muškaraca) bili su veći nego kod muškaraca s genotipom I/I. Iste su godine rezultati Nikiteasa i sur. negirali gore navedene rezultate te postavili pretpostavku da polimorfizam gena ACE može biti povezan sa sklonosti ka karcinomu debelog crijeva (80).
Rad mišića i polimorfizam ACE
Proširenje krvnih žila ovisno o endotelu može se povećati aerobnim vježbama kod zdravih osoba uslijed povišenja stvaranja dušik-oksida (NO) i smanjenja inaktivacije NO, što dovodi do povećanja bioraspoloživosti NO. Poboljšanje stanja vazodilatacije izotoničnim vježbanjem varira kod polimorfizma gena ACE. Kod nosilaca I/I genotipa stanje se proširenih krvnih žila može značajnije poboljšati, nego kod I/D i D/D nosilaca (81). Dakle, genotip I/I pojačava izglede za poboljšanje stanja proširenih krvnih žila tijekom aerobnog vježbanja.
Raspodjela učestalosti genotipa ACE ukazuje na činjenicu da su genotipovi I/I i I/D česti kod vrhunskih sportaša, trkača na duge staze, veslača i planinara, dok se genotip D/D može najčešće naći među vrhunskim francuskim biciklistima (82,83). Moran i sur. (2006.) su primijetili vezu alela I s fenotipovima povezanim, prije sa snagom, nego s izdržljivošću kod 1.027 grčkih adolescenata (84). To ukazuje na složeniju ulogu gena ACE u ljudskom fizičkom radu, nego što se o tome prethodno izvještavalo. Taj rezultat očigledno nije u skladu s rezultatima prethodnih pokusa. Međutim, ta se istraživanja ne mogu uspoređivati zbog visoke selekcije i relativno male populacije na kojoj su izvedena. Jasno je, dakle, da postoji skroman utjecaj gena ACE na fizički rad kod opće populacije. Ostaje jedini izazov uočiti mehanizam utjecaja polimorfizma gena ACE na rad u odnosu na fenotipove.
Imunitet i polimorfizam ACE
Učinci genotipa ACE na imunitet i imune poremećaje bio je također temom od interesa u prethodnom desetljeću. Temeljitije će se obraditi nekoliko istraživanja ističući važnost polimorfizma gena ACE.
Sepsa
Cogulu i sur. (2008.) su detaljno istražili ulogu I/D polimorfizma gena ACE u obrani od sepse kod djece (85). Primijetili su da nosioci alela I (genotipa I/I ili I/D) imaju povećani rizik u usporedbi s D/D nosiocima. Taj rezultat ukazuje na zaštitnu ulogu genotipa D/D kod sepse. Budući da se taj rezultat temelji na istraživanju s malim brojem ispitanika (N = 287) potrebno ga je ponoviti na većoj populaciji kako bi se bez ikakve sumnje mogao stvoriti zaključak.
Astma i alergijski rinitis
Pojava simptoma astme kod nekih bolesnika i alergijskog rinitisa kod drugih postavlja pretpostavku o uključenosti genetskih čimbenika. Lue i sur. (2006.) pokušali su saznati genetsku osnovu za dva različita fenotipa te su zbog toga istraživali polimorfizam gena ACE (86). Proveli su genotipizaciju ACE kod 106 djece s alergičnim rinitisom bez astme, 105 djece iste dobi i spola s alergičnim rinitisom i astmom te 102 zdrave djece. Za svaki je uzorak izmjerena i ukupna koncentracija imunoglobulina u serumu (IgE), IgE osjetljivost na specifične alergene i broj eozinofilnih granulocita. Češća pojava genotipa D/D kod djece koja su imala i alergijski rinitis i astmu nego kod djece s alergijskim rinitisom no bez astme ukazuje na zaštitnu ulogu genotipa D/D u razvoju fenotipa astme kod djece s alergijskim rinitisom.
Sistemski eritemski lupus
Manifestacija sistemskog eritemskog lupusa (engl. systemic lupus erythematosus, SLE) uslijed polimorfizma gena ACE potvrđena je istraživanjem Leeja i sur. (2006.) u meta-analizi u kojoj su usporedili 13 različitih istraživanja na 1.411 bolesnika oboljelih od SLE i 1.500 kontrolnih ispitanika (87). Primijećen je trend povezanosti genotipa D/D (OR = 1,212; 95% CI = 0,966-1,520; P = 0,097) i alela D sa SLE kod bolesnika bijelaca (OR = 1,157; 95% CI = 0,991-1,349; P = 0,064); međutim, rezultat nije bio statistički značajan. Očito je, dakle, da nema udruženosti između polimorfizma ACE i SLE.
Kosti i polimorfizam gena ACE
Osteoporoza, bolest kostiju, je multifaktorski problem kod muškaraca i žena u starijoj životnoj dobi. Postoji malo podataka koji razjašnjavaju ulogu I/D polimorfizma gena ACE u manifestaciji i liječenju osteoporoze. Postoje podaci koji ukazuju na povezanost polimorfizma ACE s osteoporozom (88). Rezultati pokazuju da mala aktivnost enzima povezana s I/I genotipom ima pozitivnu ulogu u liječenju osteoporoze. U presječnom istraživanju 3.887 Kineza (N = 1.958) i Kineskinja (N = 1.929) Lynn i sur. (2006.) su primijetili da I/I nosioci imaju bolje učinke liječenja ACE inhibitorima od I/D ili D/D nosilaca (89,90). O sličnim su učincima I/I genotipa polimorfizma ACE izvijestili Woods i sur. (2001.) tijekom hormonske nadomjesne terapije (91). Može se zaključiti da je I/D polimorfizm ACE također povezan i s koštanom patofiziologijom.
Dugovječnost i polimorfizam ACE
Povezanost različitih bolesti s polimorfizmom ACE (Tablica 1.) daje mu ulogu pokazatelja dugovječnosti. Kako bi potvrdili tu hipotezu, Schachter i sur. (1994.) su napravili genotipizaciju 338 osoba koji su navršili 100 godina i 164 kontrolnih ispitanika u dobi od 20 do 70 godina u okviru kohorte koju je potvrdio Centar za istraživanje ljudskih polimorfizama (franc. Centre d’Etude du Polymorphisme Humain, CEPH) u Parizu, Francuska (92). Njihovi su rezultati bili neočekivani te su ukazali na češću pojavu genotipa D/D u skupini stogodišnjaka nego u kontrolnoj skupini (40% prema 26%, P = 0,01). Isti je pokus ponovljen 2000. s 560 dodatnih francuskih stogodišnjaka, od kojih je svaki stavljen u par s mlađim ispitanikom istoga spola i zemljopisnog podrijetla. No, ti rezultati nisu pokazali razliku između stogodišnjaka i kontrolnih ispitanika (93). Slični su zaključci dobiveni rezultatima istraživanja Nacmiasa i sur. (2007.) (67).
U populacijskoj studiji Aras-Vasqueza i sur. (2003.) je kod 6.968 starijih osoba provedena genotipizacija i nije pronađena udruženost polimorfizma ACE s dugovječnošću, već s preranom smrtnošću, što je uobičajeno kod pušača s D/D genotipom, dok raspodjela učestalosti nije bila statistički značajno različita kod nepušača (94). Prema tome, polimorfizam ACE pokazuje statistički značajnu povezanost sa smrtnošću u ranoj životnoj dobi uslijed kardiovaskularnih bolesti i onih koje nisu kardiovaskularne naravi u prisutnosti ostalih fizičkih i okolišnih čimbenika.
 
Zaključak
 
Starenje je posljedica složene interakcije genetskih i epigenetskih čimbenika te čimbenika okoline, ali se čini da još jedna jaka genetska komponenta ima jak utjecaj na život do duboke starosti. Za polimorfizam gena ACE se smatralo da je odgovoran za dugovječnost zbog svoje uloge u razvoju mnogih bolesti. U početku se mislilo da je I/I genotip povezan s povećanom porođajnom težinom, što je bio znakom zdrave budućnosti u starijoj životnoj dobi. Međutim, kasnije je ustanovljeno da nema povezanosti između porođajne težine i genotipa, već da na rani rast nakon rođenja utječu I/I ili I/D genotip. Zaštitni učinci alela I/I u slučaju kardiovaskularnih bolesti i komplikacija uslijed šećerne bolesti nisu jednoznačno dokazani i stoga su još uvijek sporni. Te nam činjenice pokazuju da polimorfizam gena ACE ima malu ulogu u predskazivanju dugovječnosti.
 
Literatura
 
 1.   Zhao Y, Xu C. Structure and function of angiotensin converting enzyme and its inhibitors. Chin J Biotech 2008;24:171-6.
 2.   Turner AJ, Hooper NM. The angiotensin-converting enzyme gene family: genomics and pharmacology. Trends Pharmacol Sci 2002;23: 177-83.
 3.   Jaspard E, Wei L, Alhenc-Gelas F. Differences in the properties and enzymatic specificities of the two active sites of angiotensin I-converting enzyme (kininase II). Studies with bradykinin and other natural peptides. J Biol Chem 1993;268:9496-503.
 4.   Erdos EG, Skidgel RA.The angiotensin I-converting enzyme. Lab Invest 1987;56:345-8.
 5.   Brewster UC, Perazella MA The renin-angiotensin-aldosterone system and the kidney: effects on kidney disease. Am J Med 2004;116:263-72.
 6.   Carluccio M, Soccio M, De Caterina R. Aspects of gene polymorphisms in cardiovascular disease: the renin-angiotensin system. Eur J Clin Invest 2001;31:476-88.
 7.   Rajagopalan S, Kurz S, Munzel T, Tarpey M, Freeman BA, Griendling KK, Harrison DG. Angiotensin II-mediated hypertension in the rat increases vascular superoxide production via membrane NADH/NADPH oxidase activation. Contribution to alterations of vasomotor tone. J Clin Invest 1996;97:1916-23.
 8.   Fleming I. Signaling by the angiotensin-converting enzyme. Circ Res 2006;14:98:887-96.
 9.   Hu J, Igarashi A, Kamata M, Nakagawa H. Angiotensin-converting enzyme degrades Alzheimer amyloid beta-peptide (A beta); retards A beta aggregation, deposition, fibril formation; and inhibits cytotoxicity. J Biol Chem 2001;276:47863-8.
10.   Kondoh G, Tojo H, Nakatani Y, Komazawa N, Murata C, Yamagata K, et al. Angiotensin-converting enzyme is a GPI-anchored protein releasing factor crucial for fertilization. Nat Med 2005;11:160-6.
11.   Hubert C, Houot AM, Corvol P, Soubrier F. Structure of the angiotensin I-converting enzyme gene. Two alternate promoters correspond to evolutionary steps of a duplicated gene. J Biol Chem 1991;266: 15377-83.
12.   Howard TE, Shai SY, Langford KG, Martin BM, Bernstein KE. Transcription of testicular angiotensin-converting enzyme (ACE) is initiated within the 12th intron of the somatic ACE gene. Mol Cell Biol 1990;10: 4294-302.
13.   Thekkumkara TJ, Livingston W3rd, Kumar RS, Sen GC. Use of alternative polyadenylation sites for tissue-specific transcription of two angiotensin-converting enzyme mRNAs. Nucleic Acids Res 1992;20:683-7.
14.   Rigat B, Hubert C, Alhenc-Gelas F, Cambien F, Corvol P, Soubrier F. An insertion/deletion polymorphism in the angiotensin I-converting enzyme gene accounting for half the variance of serum enzyme levels. J Clin Invest 1990;86:1343-6.
15.   Sayed-Tabatabaei FA, Oostra BA, Isaacs A, van Duijn CM, Witteman JCM. ACE polymorphisms. Circ Res 2006;98:1123-33.
16.   Odawara M, Matsunuma A, Yamshita K. Mistyping frequency of the angiotensin converting enzyme gene polymorphism and an improved method for its avoidance. Hum Gen 1997;100:163-6.
17.   Shanguman V, Sell KW, Saha BK. Mistyping ACE heterozygotes. Genome Res 1993;3:120-1.
18.   Chiang FT, Hsu KL, Chen WM, Tseng CD, Tseng YZ. Determination of angiotensin converting enzyme gene polymorphisms: step down PCR increases detection of heterozygotes. Clin Chem 1998;44:1353-6.
19.   Evans AE, Poirier O, Kee F, Lecerf L, McCrum E, Falconer T, et al. Polymorphisms of the angiotensin-converting-enzyme gene in subjects who die from coronary heart disease. QJM 1994;87:211-4.
20.   Lin MH, Tseng CH, Tseng CC, Huang CH, Chong CK, Tseng CP. Real time PCR for rapid genotyping of angiotensin converting enzyme insertion/deletion polymorphism. Clin Biochem 2001;34:661-6.
21.   Koyama RG, Castro RMRPS, De Mello MT, Tufik S, Pedrazzoli M. Simple detection of large InDeLS by DHPLC: the ACE gene as a model. J Biomed Biotech 2008;568183.
22.   Kajantie E, Rautanen A, Kere J, Andersson S, Yliharsila H, Osmond C, et al. The effects of the ACE gene insertion/deletion polymorphism on glucose tolerance and insulin secretion in elderly people are modified by birth weight. J Clin Endocrinol Metab 2004;89:5738-41.
23.   Barker DJP, Osmond C, Forsen TJ, Kajantie E, Eriksson JG. Trajectories of growth among children who have coronary events as adults. N Engl J Med 2005;353:1802-9.
24.   Rotteveel J, van Weissenbruch MM, Twisk JWR, de Waal HAD. Infant and childhood growth patterns, insulin sensitivity, and blood pressure in prematurely born young adults. Pediatrics 2008;122:313-21.
25.   Hindmarsh PC, Rodeck CH, Humphries SE. Polymorphisms in the angiotensin converting enzyme gene and growth in the first year of life. Ann Hum Gen 2007;71:176-84.
26.   Feng Y, Niu T, Xu X, Chen C, Li Q, Qian R, et al. Insertion/deletion polymorphism of the ACE gene is associated with type 2 diabetes. Diabetes 2002;51:1986-8.
27.   Daimon M, Oizumi T, Saitoh T, Kameda W, Hirata A, Yamaguchi H, et al. The D allele of the angiotensin-converting enzyme insertion/deletion (I/D) polymorphism is a risk factor for type 2 diabetes in a population-based Japanese sample. Endocr J 2003;50:393-8.
28.   Stephens JW, Dhamrait SS, Cooper JA, Acharya J, Miller GJ, Hurel SJ, Humphries SE. The D allele of the ACE I/D common gene variant is associated with type 2 diabetes mellitus in Caucasian subjects. Mol Genet Metab 2005;84:83-9.
29.   Singh PP, Naz I, Gilmour A, Singh M, Mastana S. Association of APOE (Hha1) and ACE (I/D) gene polymorphisms with type 2 diabetes mellitus in North West India. Diabetes Res Clin Pract2006;74:95-102.
30.   Conen D, Glynn RJ, Buring JE, Ridker PM, Zee RY. Renin-angiotensin and endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms are not associated with the risk of incident type 2 diabetes mellitus: a prospective cohort study. J Intern Med 2007;263:376-85.
31.   van-Valkengoed IGM, Stronks K, Hahntow IN, Hoekstra JBL, Holleman F. The angiotensin converting enzyme insertion/deletion polymorphism and differences in fasting plasma glucose in Hindustani Surinamese, African Surinamese and ethnic Dutch: the population-based SUNSET-study. Diabetes Res Clin Pract 2008;81:e12-e14.
32.   Arfa I, Abid A, Nouira S, Elloumi-Zghal H, Malouche D, Mannai I, et al. Lack of association between the angiotensin-converting enzyme gene (I/D) polymorphism and diabetic nephropathy in Tunisian type 2 diabetic patients. JRAAS 2008;9:32-6.
33.   Eroglu Z, Cetinkalp S, Erdogan M, Kosova B, Karadeniz M, Kutukculer A, et al. Association of the angiotensinogen M235T and angiotensin-converting enzyme insertion/deletion gene polymorphisms in Turkish type 2 diabetic patients with and without nephropathy. J Diabetes Complications 2008;22:186-90.
34.   Ng DP, Tai BC, Koh D, Tan KW, Chia KS. Angiotensin-I converting enzyme insertion/deletion polymorphism and its association with diabetic nephropathy: a meta-analysis of studies reported between 1994 and 2004 and comprising 14,727 subjects. Diabetologia 2005;48: 1008-16.
35.   Movva S, Alluri RV, Komandur S, Vattam K, Eppa K, Mukkavali KK, et al. Relationship of angiotensin-converting enzyme gene polymorphism with nephropathy associated with type 2 diabetes mellitus in Asian Indians. J Diabetes Complications 2007;21:237-41.
36.   Globocnik-Petrovic M, Hawlina M, Peterlin B, Petrovic D. Insertion/deletion plasminogen activator inhibitor 1 and insertion/deletion angiotensin-converting enzyme gene polymorphisms in diabetic retinopathy in type 2 diabetes. Ophthalmologica 2003;217:219-24.
37.   Matsumoto A, Iwashima Y, Abiko A, Morikawa A, Sekiguchi M, Eto M, Makino I. Detection of the association between a deletion polymorphism in the gene encoding angiotensin I-converting enzyme and advanced diabetic retinopathy. Diabetes Res Clin Pract 2000;50:195-202.
38.   Feghhi M, Nikzamir A, Esteghamati A, Farahi F, Nakhjavani M, Rashidi A. The relationship between angiotensin-converting enzyme insertion/deletion polymorphism and proliferative retinopathy in type 2 diabetes. Diabetes Res Clin Pract 2008; 81:e1-e4.
39.   Wiwanitkit V. Angiotensin-converting enzyme gene polymorphism is correlated to diabetic retinopathy: a meta-analysis. J Diabetes Complications 2008;22:144-6.
40.   Sayed-Tabatabaei FA, Houwing-Duistermaat JJ, van Duijn CM, Witteman JC. Angiotensin-converting enzyme gene polymorphism and carotid artery wall thickness: a meta-analysis. Stroke 2003;34:1634-9.
41.   Pawel N, Iwona Z, Krystian W. The D allele of angiotensin I-converting enzyme gene insertion/deletion polymorphism is associated with the severity of atherosclerosis. Clin Chem Lab Med 2008;46:446-52.
42.   Kretowski A, McFann K, Hokanson JE, Maahs D, Kinney G, Snell-Bergeon JK, et al. Polymorphisms of the renin-angiotensin system genes predict progression of subclinical coronary atherosclerosis. Diabetes 2007;56:863-71.
43.   Scheer WD, Boudreau DA, Hixson JE, McGill HC, Newman WP 3rd, Tracy RE, et al. ACE insert/delete polymorphism and atherosclerosis. Atherosclerosis 2005;178:241-7.
44.   Oei HH, Sayed-Tabatabaei FA, Hofman A, Oudkerk M, van Duijn CM, Witteman JC. The association between angiotensin-converting enzyme gene polymorphism and coronary calcification. The Rotterdam Coronary Calcification Study. Atherosclerosis 2005;182:169-73.
45.   Szadkowska A, Pietrzak I, Klich I, Młynarski W, Bodalska-Lipińska J, Bodalski J. Polymorphism I/D of the angiotensin-converting enzyme gene and disturbance of blood pressure in type 1 diabetic children and adolescents. Przegl Lek 2006;63:32-6.
46.   Freitas SRS, Cabello PH, Moura-Neto RS, Dolinsky LC, Bóia MN. Combined Analysis of genetic and environmental factors on essential hypertension in a Brazilian rural population in the Amazon Region. Arq Bras Cardiol 2007;88:393-7.
47.   Staessen JA, Wang JG, Ginocchio G, Petrov V, Saavedra AP, Soubrier F, et al. The deletion/insertion polymorphism of the angiotensin converting enzyme gene and cardiovascular-renal risk. J Hypertens 1997;15:1579-92.
48.   Agerholm-Larsen B, Nordestgaard BG, Tybjaerg-Hansen A. ACE gene polymorphism in cardiovascular disease: meta-analyses of small and large studies in whites. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000;20:484-92.
49.   Miyama N, Hasegawa Y, Suzuki M, Hida W, Kazama I, Hatano R, et al. Investigation of major genetic polymorphisms in the renin-angiotensin-aldosterone system in subjects with young-onset hypertension selected by a targeted-screening system at university. Clin Exp Hypertens 2007;29:61-7.
50.   Glavnik N, Petrovič D. M235T polymorphism of the angiotensinogen gene and insertion/deletion polymorphism of the angiotensin-1 converting enzyme gene in essential arterial hypertension in Caucasians. Folia Biol (Praha) 2007;53:69-70.
51.   Bautista LE, Vargas CI, Oróstegui M, Gamarra G. Population-based case-control study of renin-angiotensin system genes polymorphisms and hypertension among Hispanics. Hypertens Res 2008;31:401-8.
52.   Zhang YL, Zhou SX, Lei J, Zhang JM. Association of angiotensin I-converting enzyme gene polymorphism with ACE and PAI-1 levels in Guangdong Chinese Han patients with essential hypertension. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao 2007;27:1681-4.
53.   Morshed M, Khan H, Akhteruzzaman S. Association between angiotensin I-converting enzyme gene polymorphism and hypertension in selected individuals of the Bangladeshi population. J Biochem Mol Biol 2002;35:251-4.
54.   Higaki J, Baba S, Katsuya T, Sato N, Ishikawa K, Mannami T, et al. Deletion allele of angiotensin-converting enzyme gene increases risk of essential hypertension in Japanese men: the Suita Study. Circulation 2000;101:2060-5.
55.   Jiménez PM, Conde C, Casanegra A, Romero C, Tabares AH, Orías M. Association of ACE genotype and predominantly diastolic hypertension: a preliminary study. JRAAS 2007;8:42-4.
56.   Nápoles OC, Castellanos MS, Leal L, Casalvilla R, Camacho H, Ferrer A, et al. ACE I/D polymorphism study in a Cuban hypertensive population. Clin Chim Acta 2007;378:112-6.
57.   Cambien F, Poirier O, Lecerf L, Evans A, Cambou JP, Arveiler D, et al. Deletion polymorphism in the gene for angiotensin-converting enzyme is a potent risk factor for myocardial infarction. Nature 1992;359:641-4.
58.   Sharma P. Meta-analysis of the ACE gene in ischaemic stroke. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1998;64:227-30.
59.   Banerjee I, Gupta V, Ganesh S. Association of gene polymorphism with genetic susceptibility to stroke in Asian populations: a meta-analysis 2007. J Hum Genet 2007;52:205-19.
60.   Xu X, Li J, Sheng W, Liu L. Meta-analysis of genetic studies from journals published in China of ischemic stroke in the Han Chinese population. Cerebrovasc Dis 2008;26:48-62.
61.   Dikmen M, Günes HV, Degirmenci I, Ozdemir G, Basaran A. Are the angiotensin-converting enzyme gene and activity risk factors for stroke? Arq Neuropsiquiatr 2006;64:211-6.
62.   Kehoe PG, Russ C, McIlory S, Williams H, Holmans P, Holmes C, et al. Variation in DCP1, encoding ACE, is associated with susceptibility to Alzheimer disease. Nat Genet 1999;21:71-2.
63.   Kehoe PG, Katzov H, Feuk L, Bennet AM, Johansson B, Wiman B, et al. Haplotypes extending across ACE are associated with Alzheimer’s disease. Hum Mol Genet 2003;12:859-67.
64.   Lehmann DJ, Cortina-Borja M, Warden DR, Smith AD, Sleegers K, Prince JA, et al. Large meta-analysis establishes the ACE insertion-deletion polymorphism as a marker of Alzheimer’s disease. Am J Epidemiol 2005;162:305-17.
65.   Kölsch H, Jessen F, Freymann N, Kreis M, Hentschel F, Maier W, Heun R. ACE I/D polymorphism is a risk factor of Alzheimer’s disease but not of vascular dementia. Neurosci Lett 2005;377:37-9.
66.   Sleegers K, den Heijer T, van Dijk EJ, Hofman A, Bertoli-Avella AM, Koudstaal PJ, et al. ACE gene is associated with Alzheimer’s disease and atrophy of hippocampus and amygdale. Neurobiol Aging 2005;26:1153-9.
67.   Nacmias B, Bagnoli S, Tedde A, Cellini E, Bessi V, Guarnieri B, et al. Angiotensin converting enzyme insertion/deletion polymorphism in sporadic and familial Alzheimer’s disease and longevity. Arch Gerontol Geriatr 2007;45:201-6.
68.   Camelo D, Arboleda G, Yunis JJ, Pardo R, Arango G, Solano E, et al. Angiotensin-converting enzyme and alpha-2-macroglobulin gene polymorphisms are not associated with Alzheimer’s disease in Colombian patients. J Neurol Sci 2004;218:47-51.
69.   Bowirrat A, Cui J, Waraska K, Friedland RP, Oscar-Berman M, Farrer LA, et al. Lack of association between angiotensin-converting enzyme and dementia of the Alzheimer’s type in an elderly Arab population in Wadi Ara, Israel. Neuropsychiatr Dis Treat 2005;1:73-6.
70.   Lin JJ, Yueh KC, Chang DC, Lin SZ. Association between genetic polymorphism of angiotensin-converting enzyme gene and Parkinson’s disease. J Neurol Sci 2003;199:25-9.
71.   Lin JJ, Yueh KC, Lin SZ, Harn HJ, Liu JT. Genetic polymorphism of the angiotensin converting enzyme and L-dopa-induced adverse effects in Parkinson’s disease. J Neurol Sci 2007;252:130-4.
72.   Röcken C, Lendeckel U, Dierkes J, Westphal S, Carl-McGrath S, Peters B, et al. The number of lymph node metastases in gastric cancer correlates with the angiotensin I-converting enzyme gene insertion/deletion polymorphism. Clin Cancer Res 2005;11:2526-30.
73.   Koh WP, Yuan JM, Sun CL, van den Berg D, Seow A, Lee HP, Yu MC. Angiotensin I-converting enzyme (ACE) gene polymorphism and breast cancer risk among Chinese women in Singapore. Cancer Res 2003;63:573-8.
74.   González-Zuloeta Ladd AM, Arias-Vásquez A, Sayed-Tabatabaei FA, Coebergh JW, Hofman A, Njajou O, et al. Angiotensin-converting enzyme gene insertion/deletion polymorphism and breast cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005;14:2143-6.
75.   Yaren A, Turgut S, Kursunluoglu R, Oztop I, Turgut G, Kelten C, Erdem E. Association between the polymorphism of the angiotensin-converting enzyme gene and tumor size of breast cancer in premenopausal patients. Tohoku J Exp Med 2006;210:109-16.
76.   Van der Knaap R, Siemes C, Coebergh JW, van Duijn CM, Hofman A, Stricker BH. Renin-angiotensin system inhibitors, angiotensin I-converting enzyme gene insertion/deletion polymorphism, and cancer: the Rotterdam Study. Cancer 2008;112:748-57.
77.   Vairaktaris E, Yapijakis C, Tsigris C, Vassiliou S, Derka S, Nkenke E, et al. Association of angiotensin-converting enzyme gene insertion/deletion polymorphism with increased risk for oral cancer. Acta Oncol 2007;46:1097-102.
78.   Goto Y, Ando T, Nishio K, Ishida Y, Kawai S, Goto H, Hamajima N. The ACE gene polymorphism is associated with the incidence of gastric cancer among H. pylori seropositive subjects with atrophic gastritis. Asian Pac J Cancer Prev. 2005;6:464-7.
79.   Röcken C, Neumann K, Carl-McGrath S, Lage H, Ebert MP, Dierkes J, et al. The gene polymorphism of the angiotensin I-converting enzyme correlates with tumor size and patient survival in colorectal cancer patients. Neoplasia 2007;9:716-22.
80.   Nikiteas N, Tsigris, C, Chatzitheofylaktou A, Yannopoulos A. No association with risk for colorectal cancer of the insertion/deletion polymorphism which affects levels of angiotensin-converting enzyme. In Vivo 2007;21:1065-8.
81.   Tanriverdi H, Evrengul H, Tanriverdi S, Turgut S, Akdag B, Kaftan HA, Semiz E. Improved endothelium dependent vasodilation in endurance athletes and its relation with ACE I/D polymorphism. Circ J 2005;69:1105-10.
82.   Lucía A, Gómez-Gallego F, Chicharro JL, Hoyos J, Celaya K, Córdova A, et al. Is there an association between ACE and CKMM polymorphisms and cycling performance status during 3-week races? Int J Sports Med 2005;26:442-7.
83.   Hruskovicová H, Dzurenková D, Selingerová M, Bohus B, Timkanicová B, Kovács L. The angiotensin converting enzyme I/D polymorphism in long distance runners. J Sports Med Phys Fitness 2006;46:509-13.
84.   Moran CN, Vassilopoulos C, Tsiokanos A, Jamurtas AZ, Bailey ME, Montgomery HE, et al. The associations of ACE polymorphisms with physical, physiological and skill parameters in adolescents. Eur J Hum Genet 2006;14:332-9.
85.   Cogulu O, Onay H, Uzunkaya D, Gunduz C, Pehlivan S, Vardar F, et al. Role of angiotensin-converting enzyme gene polymorphisms in children with sepsis and septic shock. Pediatr Int 2008;50:477-80.
86.   Lue KH, Ku MS, Li C, Sun HL, Lee HS, Chou MC. ACE gene polymorphism might disclose why some Taiwanese children with allergic rhinitis develop asthma symptoms but others do not. Pediatr Allergy Immunol 2006;17:508-13.
87.   Lee YH, Rho YH, Choi SJ, Ji JD, Song GG. Angiotensin-converting enzyme insertion/deletion polymorphism and systemic lupus erythematosus: a meta-analysis. J Rheumatol 2006;33:698-702.
88.   Pérez-Castrillón JL, Justo I, Silva J, Sanz A, Martín-Escudero JC, Igea R, et al. Relationship between bone mineral density and angiotensin converting enzyme polymorphism in hypertensive postmenopausal women. Am J Hypertens 2003;16:233-5.
89.   Lynn H, Kwok T, Wong SY, Woo J, Leung PC. Angiotensin converting enzyme inhibitor use is associated with higher bone mineral density in elderly Chinese. Bone 2006;38:584-8.
90.   Pérez-Castrillón JL, Silva J, Justo I, Sanz A, Martín-Luquero M, Igea R, et al. Effect of quinapril, quinapril-hydrochlorothiazide, and enalapril on the bone mass of hypertensive subjects: relationship with angiotensin converting enzyme polymorphisms. Am J Hypertens 2003;16:453-9.
91.   Woods D, Onambele G, Woledge R, Skelton D, Bruce S, Humphries SE, Montgomery H. Angiotensin-I converting enzyme genotype-dependent benefit from hormone replacement therapy in isometric muscle strength and bone mineral density. J Clin Endocrinol Metab 2001;86:2200-4.
92.   Schachter F, Faure-Delanef L, Guenot F, Rouger H, Froguel P, Lesueur-Ginot L, Cohen D. Genetic associations with human longevity at the APOE and ACE loci. Nat Genet 1994;6:29-32.
93.   Blanche H, Cabanne L, Sahbatou M, Thomas G. A study of French centenarians: are ACE and APOE associated with longevity? C R Acad Sci III 2001;324:129-35.
94.   Arias-Vasquez A, Sayed-Tabatabaei FA, Schut AF, Hofman A, Bertolli-Avella AM, Vergeer JM, et al. Angiotensin converting enzyme gene, smoking and mortality in a population-based study. Eur J Clin Invest 2005;35:444-9.

Prikaz slučaja

 

Dunja Buljubašić1, Tatjana Ladenhauser-Palijan1, Željko Debeljak2*. Homozigotni oblik nasljedne hemokromatoze u bolesnika s beta-talasemijom minor: prikaz slučaja. Biochemia Medica 2009;19(2):199-205.
 
1Klinika za unutarnje bolesti, Klinička bolnica Osijek, Osijek
2Odjel za kliničko laboratorijsku dijagnostiku, Klinička bolnica Osijek, Osijek
Corresponding author*: debeljak [dot] zeljko [at] kbo [dot] hr
 
Sažetak
 
Uvod: Dijagnostički pristup bolesniku koji istodobno boluje od nasljedne hemokromatoze i beta-talasemije može biti dosta složen zbog činjenice da teži oblici beta-talasemije sami po sebi mogu imati za posljedicu hemokromatozu. S druge strane, i najlakši oblik beta-talasemije može dovesti do ozbiljnih manifestacija hemokromatoze u bolesnika s heterozigotnim oblikom HFE polimorfizama. Ova stanja, kao i HFE polimorfizmi naslijeđeni u homozigotnom obliku kao rizični čimbenici za razvoj hemokromatoze mogu imati za posljedicu cirozu jetre i hepatocelularni karcinom pa pravodobno prepoznavanje navedenih stanja ima presudno značenje za dužinu i kvalitetu bolesnikova života.
Metode: Za prikaz slučaja izabran je bolesnik primljen na Kliniku za zarazne bolesti Kliničke bolnice Osijek s febrilitetom, hepatosplenomegalijom i neurološkim simptomima. Kod prijma su učinjene osnovne laboratorijske pretrage te ultrazvučni pregled abdomena i snimanje glave magnetskom rezonancijom. Naknadno je provedena biopsija jetre, elektroforeza hemoglobina te određivanje koncentracije haptoglobina i utvrđivanje Cys282Tyr polimorfizma HFE gena.
Rezultati: Anamnestički podaci i rezultati rutinske laboratorijske obrade su ukazali na mogućnost da bolesnik boluje od beta-talasemije. Proširenom laboratorijskom obradom je dijagnosticirana pigmentna ciroza-hemokromatoza, a potvrđena je dijagnoza beta-talasemije minor. Odgovarajući molekularno-dijagnostički postupak je dokazao prisutnost homozigotnog oblika nasljedne hemokromatoze.
Zaključak: Određivanje koncentracije feritina i zasićenje transferina željezom, elektroforeza hemoglobina i utvrđivanje polimorfizma Cys282Tyr HFE gena pokazali su se ključnim čimbenicima za relativno brzo postavljanje ispravne dijagnoze u prikazanom slučaju istodobnog nasljeđivanja beta-talasemije minor i homozigotnog oblika nasljedne hemokromatoze. Homozigotni oblik nasljedne hemokromatoze uz beta-talasemiju minor objašnjava težinu simptoma prisutnih kod bolesnika u vrijeme hospitalizacije.
Ključne riječi: hemokromatoza; beta-talasemija; zasićenje transferina željezom; HFE; elektroforeza hemoglobina
Pristiglo: 22. ožujka 2009.                                                                                                    Prihvaćeno: 4. svibnja 2009.
 
Uvod
 
U organizmu se normalno nalazi 800-1500 mg željeza koje je uskladišteno u makrofazima u jetri, slezeni i koštanoj srži. Ako unos željeza nadmaši mogućnost njegovog fiziološkog skladištenja u navedenim organima, ono se gomila u parenhimnim stanicama različitih organa u obliku topljivog feritina, a poslije i u obliku netopljivog hemosiderina. Bolest kod koje dolazi do prekomjernog nakupljanja i toksičnog djelovanja iona željeza u jetri, srcu, gušterači, hipofizi, zglobovima i koži naziva se hemokromatozom (1).
Prema etiologiji hemokromatoze mogu biti primarne, tj. genetske i sekundarne. Genetski uvjetovanim hemokromatozama pripadaju nasljedna hemokromatoza (engl. hereditary hemochromatosis, HH), nasljedne hemolitične anemije i kongenitalna atransferinemija, dok se stečena hemokromatoza javlja nakon brojnih transfuzija krvi, primjene parenteralnih pripravaka ili dugotrajnog peroralnog uzimanja željeza, kod nekih oblika hepatitisa, te pijenjem pića koja se proizvode u željeznim posudama (afrička nutricijska hemokromatoza) (1).
Nasljedna hemokromatoza je autosomno-recesivna bolest. Iako učestalost manifestne HH varira ovisno o testovima probira, prosječna učestalost se kreće oko 0,5% (2). Postoji nekoliko tipova HH, a najčešći oblik je tip 1 kod kojeg dolazi do mutacije Cys282Tyr HFE gena smještenog na kratkom kraku kromosoma 6. Proteinski produkt divljeg tipa HFE gena olakšava preuzimanje plazmatskog željeza putem što ga posreduje transferinski receptor u stanicama duodenalnih kripta, dok mutirani protein HFE nema taj učinak. Funkcionalni gubitak proteina HFE uslijed mutacije smanjuje regulacijsku količinu željeza u kriptalnim stanicama i dovodi do povećane ekspresije proteina za transport željeza u enterocitima te do povećane resorpcije željeza iz hrane (2). U prosječno 83% slučajeva klinički manifestne HH riječ je o homozigotima za mutaciju Cys282Tyr (3).
Simptomi bolesti se obično javljaju u dobi nakon 40 godina u muškaraca i nakon 50 godina u žena. Kliničke manifestacije bolesti uključuju učestale infekcije, bolesti jetre, pojačanu kožnu pigmentaciju, šećernu bolest, artropatije, kardiomiopatije i impotenciju. Najčešći razlog javljanja liječniku je umor i artralgija, a većina bolesnika je asimptomatska te se otkrije samo povišena razina željeza u serumu (1).
Rano otkrivanje HH važno je za sprječavanje razvoja najtežih manifestacija, tj. ciroze jetre i hepatocelularnog karcinoma (4). U tu svrhu provodi se dijagnostička obrada koja uključuje laboratorijske analize poput određivanja koncentracije serumskog željeza (> 32 μmol/L), serumskog feritina (> 500 μg/L), zasićenja transferina željezom (> 62%), biopsiju jetre i molekularne analize polimorfizma HFE gena. Odgovarajuće referentne vrijednosti su dane u zagradama. Uz laboratorijsku obradu potrebno je učiniti ultrazvučni pregled abdomena ili primijeniti druge slikovne dijagnostičke tehnike poput kompjutorizirane tomografije ili magnetske rezonancije.
Cilj liječenja je sniženje koncentracije serumskog željeza i njeno održavanje unutar ili blizu referentnih vrijednosti. To se postiže venepunkcijama i/ili primjenom kelirajućih lijekova, npr. desferioksamina. Najvažniji prognostički čimbenik u vrijeme dijagnoze je prisutnost ili odsutnost fibroze ili ciroze jetre. Bolesnici liječeni u fazi prije razvoja ciroze imaju normalan medijan preživljavanja, a oni neliječeni umiru za približno 2 godine, najčešće uslijed zatajivanja srca, ciroze ili hepatocelularnog karcinoma.
Talasemije su heterogena skupina nasljednih hemolitičnih anemija uzrokovanih genetskim poremećajem u sintezi alfa- ili beta-globinskih lanaca. Podskupina beta-talasemija uključuje sindrome poremećene sinteze beta-hemoglobinskih lanaca i javlja se u tri klinička entiteta: beta-talasemija major, intermedija i minor. Kako su mutacije koje dovode do pojave ove bolesti brojne i raznolike, njihovo određivanje se ne provodi prilikom rutinske laboratorijske obrade, već se dijagnoza postavlja prema vrijednostima crvene krvne slike, elektroforeze hemoglobina i prema kliničkoj slici. Kod klinički najlakšeg oblika, beta-talasemije minor (BTM), tj. heterozigotne beta-talasemije, javlja se mikrocitoza i hipokromija eritrocita, s tek naznačenom anemijom, dok je u elektroforezi hemoglobina tek nešto povećan udio hemoglobina A2 (hemoglobin s dva alfa- i dva delta-lanca). Ostali rezultati laboratorijskih analiza su obično unutar referentnih raspona. Za ovaj oblik talasemije nije znakovita pojava hemokromatoze niti se javljaju drugi teži simptomi poput teške anemije, hemolize, koštanih deformiteta itd. koji su znakoviti za beta-talasemiju major i intermediju (2).
Uz HH i teži oblici beta-talasemije mogu samostalno dovesti do klinički značajnih simptoma hemokromatoze. Nadalje, HFE mutacije i BTM se mogu nasljeđivati i zajedno, a utvrđeno je da su u tom slučaju simptomi same hemokromatoze znatno teži (5-7). Čak i neki HFE heterozigoti koji naslijede i BTM mogu pokazivati kliničke značajne hemokromatoze (8,9). Navedene činjenice upućuju na potrebu za osvrtom na dijagnostičke postupke prikladne za prepoznavanje bolesnika koji su istodobno naslijedili obje bolesti, kao i za procjenu rizika za razvoj hemokromatoze u takvih bolesnika. U nastavku se u okviru prikaza bolesnika daje osvrt na diferencijalno-dijagnostičke postupke prikladne za utvrđivanje uzroka i težine hemokromatoze u bolesnika s Cys282Tyr HFE polimorfizmom i beta-talasemijom.
 
Materijali i metode
Prikaz slučaja
Bolesnik A. A. star 46 godina primljen je 2007. godine na Kliniku za zarazne bolesti Kliničke bolnice Osijek zbog febriliteta i lošeg općeg stanja. Ultrazvučnom dijagnostikom u okviru slikovne dijagnostičke obrade potvrđena je difuzno oštećenje jetre i splenomegalija. Zbog nespecifičnih neuroloških smetnja na koje se žalio kod prijma u smislu glavobolje i osjećaja trnjenja kože lica učinjeno je snimanje magnetskom rezonancijom te su opisane zone demijelinizacije frontalno u području bijele moždane tvari. Tijekom boravka na Klinici je prema opisanim simptomima postavljena sumnja na akutni meningoencefalitis.
Kako je anamnestički dobiven podatak da bolesnikova majka boluje od beta-talasemije, kod prijma nije provedena nikakva obrada mikrocitne anemije utvrđene kod bolesnika. U crvenoj krvnoj slici bilježe se slijedeće vrijednosti: koncentracija eritrocita 4,82 x 1012 /L, koncentracija hemoglobina 102 g/L, hematokrit 0,316 L/L, srednji volumen eritrocita 65,5 fL, srednji sadržaj hemoglobina 21,2 pg, srednja koncentracija hemoglobina u eritrocitima 323 g/L i koncentracija trombocita 72 x 109 /L. Ostalim laboratorijskim postupcima utvrđene su granične vrijednosti serumskog željeza (31,6 μmol/L), feritina (3257 μg/L) i zasićenja transferina željezom (77%) uz uredne vrijednosti jetrenih aminotransferaza (aspartat-aminotransferaza 30 U/L, alanin-aminotransferaza 25 U/L, gama-glutamil-transferaza 43 U/L). Uz vrijednosti crvene krvne slike koje su bile u skladu s beta-talasemijom, nalazi koncentracije željeza, zasićenja transferina željezom i feritina ukazali su na moguću prisutnost hemokromatoze. Kako bi se potvrdio nalaz beta-talasemije te utvrdio tip ove bolesti dodatno je učinjena elektroforeza hemoglobina i određivanje koncentracije haptoglobina. Tom je prilikom uočen povišen udio hemoglobina A2 (4,3%) uz normalnu vrijednost hemoglobina F (1,2%) i haptoglobina (0,43 g/L), što je potvrdilo dijagnozu BTM (2).
Budući da su vrijednosti serumskog željeza, feritina i zasićenja transferina željezom bile više nego što se očekuje za BTM, uz fizikalni nalaz hepatosplenomegalije učinjena je biopsija jetre. Dobivena histološka slika odgovarala je pigmentnoj cirozi, hemokromatozi. U daljnjem tijeku je radi definiranja etiologije bolesti provedena PCR-RFLP analiza HFE gena, te je dokazan homozigotni oblik polimorfizma Cys282Tyr. Kod bolesnika je provedeno liječenje desferoksaminom i venepunkcijama.
Bolesnik se nakon dvije godine liječenja subjektivno dobro osjeća. Od kontrolnih dijagnostičkih pretraga učinjen je elektrokardiogram koji je bio uredan, ultrazvuk abdomena opisuje jetru primjerene veličine te uvećanu slezenu (dimenzija oko 17 x 2 cm), bez drugih patoloških nalaza. U laboratorijskim nalazima uočava se mikrocitna hipokromna anemija (koncentracija eritrocita 5,07 x 1012 /L, hemoglobin 114 g/L, srednji volumen eritrocita 69,8 fL, srednji sadržaj hemoglobina 22,5 pg), porast jetrenih aminotransferaza (aspartat-aminotransferaza 81 IU/L, alanin-aminotransferaza 75 IU/L, gama-glutamil transferaza 54 U/L), HbA1c graničnih vrijednosti (6,5%), te visoke vrijednosti feritina (2694 μg/L) i zasićenosti transferina željezom (70%). Vrijednosti serumskog željeza bile su unutar referentnih vrijednosti (29,2 μmol/L). Ostali laboratorijski parametri se nisu značajnije mijenjali u odnosu na početne vrijednosti.
Metode
Od primijenjenih slikovnih postupaka ultrazvučna dijagnostika je provedena na instrumentu Sonoline G50 sa sondom od 3,5 MHz (Siemens AG, Erlangen, Njemačka), dok se za snimanje temeljeno na nuklearnoj magnetskoj rezonanciji rabio instrument EPIOS s jakošću polja od 0,5 T (Shimadzu Co., Kyoto, Japan). Elektrokardiogram je snimljen na uređaju PageWriter 100 (Hewlett-Packard, Palo Alto, SAD). Hematološke laboratorijske analize krvi uzete na EDTA antikoagulans su provedene na uređaju SF-3000 (Sysmex Corporation, Cobe, Japan), a sve automatizirane biokemijske analize u serumu osim niže navedenih su provedene na instrumentu Olympus AU 640 (Olympus, Hamburg, Njemačka). Za određivanje koncentracije haptoglobina u serumu primijenjen je nefelometar BN ProSpec (Siemens AG, Erlangen, Njemačka), a za određivanje HbA1c u krvi uzetoj na EDTA antikoagulans primijenjen je uređaj Dimension RXL (Siemens AG, Erlangen, Njemačka). Elektroforeza hemoglobina je provedena primjenom kita Hydragel Hemoglobin K20 proizvođača Sebia, Inc., Norcross, GA, USA, a histopatološka analiza uzorka dobivenog biopsijom jetre provedena je uz bojenje preparata berlinskim modrilom. Polimorfizam Cys282Tyr HFE gena je utvrđen metodom PCR-RFLP opisanom u literaturi (3).
 
Rasprava
 
Istodobno nasljeđivanje beta-talasemije i različitih mutacija HFE gena je dosad nekoliko puta opisano u literaturi (5-9). Ono što slučaj bolesnika A. A. čini posebnim je neuobičajena pojavnost odnosno težina simptoma, poput ciroze i demijelinizacije te činjenica da je uz beta-talasemiju minor utvrđena homozigotna varijanta Cys282Tyr HFE polimorfizma. U literaturi su se dosad uglavnom obrađivali slučajevi istodobnog pojavljivanja beta-talasemije i heterozigotnih varijanta HFE polimorfizama.
Bolesnik je prilikom prvog pregleda bio bez jasnih kliničkih simptoma koji bi ukazali na moguću hemokromatozu. Štoviše, vodeći su simptomi bili osnova za sumnju na akutni meningoencefalitis. Aktivnosti jetrenih aminotransferaza su bile uredne, što je otežalo dijagnostičku obradu. Od iznimnog značenja se u obradi bolesnika A. A. pokazalo određivanje koncentracije feritina i zasićenosti transferina željezom. Naime, povećane vrijednosti ovih dvaju parametara koji su dio proširene laboratorijske obrade prve su ukazale na hemokromatozu.
Isprva nije bilo jasno značenje beta-talasemije za bolesnikovo stanje preopterećenosti željezom, koja je na osnovi anamneze i rutinskih laboratorijskih nalaza pripisana ovom bolesniku. Iako beta-talasemija može dovesti do pojave hemokromatoze, tek najteži oblici beta-talasemije ili HH mogu dovesti do funkcionalnog hiposplenizma koji se očituje učestalim infekcijama, te do morfološke splenomegalije, što je bio slučaj kod bolesnika A. A. (2). U bolesnika s hemokromatozom se rijetko mogu javiti i neurološki simptomi (10,11), što je također bio slučaj kod ovog bolesnika. No, i takve manifestacije hemokromatoze su spojive samo s težim oblicima beta-talasemije ili HH. Stoga je od presudne važnosti bilo utvrditi tip beta-talasemije. Tek je nakon učinjene elektroforeze hemoglobina postalo jasno da dijagnosticirana beta-talasemija minor samostalno ne može biti uzrokom manifestne hemokromatoze u ovog bolesnika.
Iz prikazanog slučaja se može uočiti da se kod našeg bolesnika već bila razvila pigmentna ciroza jetre, što se smatra jednom od najtežih posljedica neliječene HH. Prisutnost hemokromatoze i ciroze jetre utvrđene biopsijom, te BTM ukazuje na to da je najvjerojatnije riječ o nasljednoj mutaciji HFE gena. Da je doista riječ o homozigotnom obliku HH potvrđeno je molekularnom dijagnostikom. Tek postavljanje dijagnoze HH i BTM nedvojbeno razjašnjava relativno teške i neuobičajene simptome hemokromatoze poput ciroze jetre i demijelinizacije.
Rezultati dijagnostičke obrade dobiveni nakon dvije godine terapije pokazuju neznatno poboljšanje metabolizma željeza. Nažalost, uočava se istodobni porast aktivnosti jetrenih aminotransferaza te granično oštećena funkcija endokrine gušterače. Na temelju navedenih rezultata promjena terapije koja bi trebala ići bilo u smjeru češćih venepunkcija bilo u smjeru promjene doze ili vrste kelatora željeza čini se nužnom. Kako je riječ o dvije nasljedne bolesti koje pod određenim uvjetima mogu dovesti do manifestne hemokromatoze, potrebno je provesti i pregled članova bolesnikove obitelji radi sprječavanja razvoja bolesti.
 
Zaključak
 
Iako je istodobno nasljeđivanje dviju bolesti malo vjerojatno, ono se ne smije isključiti iz dijagnostičkog postupka, što opisani slučaj potvrđuje. Kao ključne čimbenike za postavljanje ispravne dijagnoze u prikazanom slučaju treba navesti određivanje koncentracije feritina i zasićenja transferina željezom, elektroforezu hemoglobina i utvrđivanje polimorfizma Cys282Tyr HFE gena. Bez navedenih laboratorijskih analiza, osobito određivanja koncentracije feritina i zasićenja transferina željezom, postavljanje sumnje na hemokromatozu kao etiološkog čimbenika za pojavu neuobičajenih simptoma zbog kojih je bolesnik hospitaliziran bilo bi značajno odgođeno.
Prikazani slučaj nadalje pokazuje kako se beta-talasemiji kao etiološkom čimbeniku za pojavu hemokromatoze treba pristupiti izrazito oprezno. Samo liječenje beta-talasemije ne može smanjiti simptome zbog kojih je bolesnik hospitaliziran. S druge strane, BTM može dovesti do manifestne hemokromatoze čak i u heterozigota za HFE polimorfizme. Činjenica da je bolesnik A. A. uz BTM homozigot za Cys282Tyr HFE mutaciju može objasniti težinu simptoma koji su uočeni prilikom njegove prve hospitalizacije.
Konačno, kako je asimptomatski tijek HH vrlo dug, njezino rano otkrivanje značajno produžuje život bolesnika te poboljšava njegovu kvalitetu. Budući da se HH i beta-talasemija mogu relativno lako prepoznati na temelju jednostavnih i lako dostupnih laboratorijskih pretraga, od osobitog je značenja njihovo praćenje u obiteljima oboljelih u svrhu otkrivanja nositelja ili asimptomatskih članova. Zbog raznolike kliničke slike i složenih međuodnosa mogućih uzroka hemokromatoze potrebna je pažljiva interpretacija dobivenih rezultata.
 
Zahvala
 
Zahvaljujemo se kolegama specijalistima radiologije, hematologije, infektologije, patologije i medicinske biokemije Kliničke bolnice Osijek na tehničkoj potpori. Osobito se zahvaljujemo doc.dr. A. M. Šimundić i njenim suradnicima na provedenom ispitivanju polimorfizma HFE gena, te prof.dr. B. Dmitroviću na kritičkom osvrtu na tekst.
 
Literatura
 
 1.   Fauci SA, Braunwald E, Kasper DL, Hauser SL, Longo DL, Jameson JL, Loscalzo J, eds. Harrison’s Principles of Internal Medicine. 17th ed. New York: McGraw-Hill, 2008.
 2.   McKenzie SB, ed. Clinical Laboratory Hematology. Prentice Hall, 2006.
 3.   Feder JN, Gnirke A, Thomas W, Tsuchihashi Z, Ruddy DA, Basava A, et al. A novel MHC class I-like gene is mutated in patients with hereditary haemochromatosis. Nat Genet 1996;13:399-408.
 4.   Kowdley KV. Iron, hemochromatosis, and hepatocellular carcinoma. Gastroenterology 2004;127(5 Suppl 1):S79-86.
 5.   Martins R, Picanço I, Fonseca A, Ferreira L, Rodrigues O, Coelho M, et al. The role of HFE mutations on iron metabolism in beta-thalassemia carriers. J Hum Genet 2004;49:651-5.
 6.   Oliveira TM, Souza FP, Jardim AC, Cordeiro JA, Pinho JR, Sitnik R, et al. HFE gene mutations in Brazilian thalassemic patients. Braz J Med Biol Res 2006;39:1575-80.
 7.   Piperno A, Mariani R, Arosio C, Vergani A, Bosio S, Fargion S, et al. Haemochromatosis in patients with beta-thalassaemia trait. Br J Haematol 2000;111:908-14.
 8.   Ruiz-Argüelles GJ, Garcés-Eisele J, Reyes-Núñez V, Sánchez-Anzaldo J, Ruiz-Delgado GJ, Jiménez-González C, Carrera B. Heterozygosity for the H63D mutation in the hereditary hemochromatosis (HFE) gene may lead into severe iron overload in beta-thalassemia minor: observations in a thalassemic kindred. Rev Invest Clin 2001;53:117-20.
 9.   Arruda VR, Agostinho MF, Cançado R, Costa FF, Saad ST. Beta-thalassemia trait might increase the severity of hemochromatosis in subjects with the C282Y mutation in the HFE gene. Am J Hematol 2000;63:230.
10.   Misawa S, Kuwabara S, Matsuda S, Sakakibara Y, Ogawa Y, Tashiro Y, Hattori T. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy associated with idiopathic hemochromatosis. Intern Med 2006;45:871-3.
11.   Demarquay G, Setiey A, Morel Y, Trepo C, Chazot G, Broussolle E. Clinical report of three patients with hereditary hemochromatosis and movement disorders. Mov Disord 2000;15:1204-9.