Contact

Ana-Maria Šimundić
Editor-in-Chief
Clinical Institute of Chemistry
Sestre milosrdnice University hospital
Vinogradska 29
10 000 Zagreb, Croatia

Phone: +385 1 3787 184
Fax: +385 1 3768 280

e-mail address: editorial_office [at] biochemia-medica [dot] com
 

Useful links

Events

imunologija

Izvorni stručn članak

 

Ilza Salamunić1, Branka Pauković Sekulić1, Adela Galetović1, Leida Tandara1, Dušanka Martinović Kaliterna2. Usporedba testa AtheNA Multi-Lyte ANA za određivanje autoantitijela s indirektnom imunofluorescencijom i testom ELISA. Biochemia Medica 2008;18(2):88-98.

1 Odjel za medicinsku laboratorijsku dijagnostiku, Klinički bolnički centar Split, Split

2 Klinika za internu medicinu, Odjel za reumatologiju, Klinički bolnički centar Split, Split

  
*Adresa za dopisivanje: s_ilza [at] yahoo [dot] com
 
Sažetak
Uvod: Nove tehnologije temeljene na istovremenoj višestrukoj detekciji specifičnih antinuklearnih antitijela (engl. multiplexedbeadbaseimmunoassay) poboljšavaju dijagnosticiranje i praćenje autoimunih bolesti.
Cilj našeg ispitivanja bio je utvrditi karakteristike nove metode mnogostrukog određivanja autoantitijela (engl. AtheNA Multi-Lyte ANA test system) u odnosu na dosad korištene metode indirektne imunofluorescencije (IIF ANA) i enzimimunološke metode (ELISA).
Materijali i metode: Obradili smo 897 uzoraka seruma. Svi uzorci ispitani su testom AtheNA Multi-Lyte ANA na 9 specifičnih Ag:SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, ds DNA, centromere B i histone; i imunofluorescencijom. Pozitivni su uzorci analizirani metodom ELISA na specifična autoantitijela protiv SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, ds DNA, centromera B, histona i rezultati uspoređeni testom AtheNA Multi-Lyte ANA.
Rezultati: Podudarnost kvalitativno izraženih rezultata testa AtheNA Multi-Lyte ANA i indirektne imunofluorescencije bila je 92,3% (70% negativnih i 22.3% pozitivnih rezultata). Analitička osjetljivost za specifična autoantitijela kretala se od 80% (Scl-70) do 100% (SSA), a specifičnost od 92,3% (dsDNA) do 98,3% (Sm) između metode AtheNA Multi-Lyte ANA i ELISA. Pozitivni uzorci (200) analizirani su metodom ELISA, a usporedba s testom AtheNA Multi-Lyte ANA za 9 pojedinačnih autoantitijela pokazala je značajnu korelaciju (P < 0,001), kao i procjena slaganja dviju metoda izražena kapa- koeficijentom (P < 0,001).
Zaključak: Naši su rezultati pokazali da za određivanje specifičnih autoantitijela u imunološkom laboratoriju AtheNA Multi-Lyte ANA može zamijeniti metodu ELISA, ali ne u potpunosti metodu IIF ANA.
Ključne riječi: Antinuklearna antitijela, test AtheNA Multi-Lyte ANA, ELISA, autoimune bolesti
Pristiglo: 5. ožujka 2007.                                                                                                  Prihvaćeno: 15. siječnja 2008.
 
 
Uvod
U dijagnostici sistemskih i organospecifičnih bolesti detekcija autoantitijela je jedan od osnovnih imunoloških dijagnostičkih postupaka. Uz kliničke simptome, detekcija specifičnih autoantitijela na jezgrine autoantigene te citoplazmatskih antitijela jest ključna za postavljanje dijagnoze (1). Svaku sistemsku autoimunu bolest, od kojih su najčešće sistemski eritemski lupus (SLE), Sjőgrenov sindrom (SS), polimiozitis (PM), miješana bolest vezivnog tkiva (MCTD), reumatoidni artritis (RA) i jatrogeni lupus, karakterizira određeni profil autoantitijela. U rutinskom radu imunološkog laboratorija koriste se brojne tehnike i metode za dokazivanje ponajprije autoantitijela, a rjeđe antigena (2). U detekciji antinuklearnih autoantitijela (ANA) metoda indirektne imunofluorescencije (IIF) je metoda izbora ako se koristi u pretraživanju seruma (3). Detekcija ANA IIF je mikroskopska tehnika u kojoj iskustvo analitičara ima važnu ulogu, nije standardizirana, omogućava približnu detekciju specifičnog antitijela temeljem specifične fluorescencije, dijagnostički je zahtjevna i vremenski dugo traje. Zbog potreba bržeg dijagnosticiranja bolesti i određivanja specifičnih antitijela razvile su se metode koje je moguće automatizirati i donekle standardizirati (4). Enzimimunokemijska metoda (ELISA) za otkrivanje specifičnog autoantitijela koristi antigene pripremljene iz humanih epiteloidnih stanica (HEp-2) stanica ili rekombinantnim tehnikama. Različiti načini dobivanja antigena često su uzrok različitih rezultata između testova (5). Specifičnost određenog ELISA-testa za određeno autoantitijelo ovisi o antigenu, te je važno da antigeni koji se koriste imaju istu sekvencu, konformaciju i post-translacijsku modifikaciju te da su što sličniji humanom antigenu (6). U novije vrijeme razvoj i primjena tehnika protočne citometrije u kombinaciji s homogenim fluoroimunokemijskim metodama omogućava istovremeno određivanje većeg broja autoantitijela iz jednog uzorka seruma. Polistirenske mikročestice označene su s dva fluorofora. Svaki fluorofor sadrži 10 precizno definiranih različitih koncentracija, odnosno intenziteta fluoroscencije, što omogućava kombinaciju od 100 različito obojenih mikročestica. To bi značilo da se, kada se svaka mikročestica obilježi specifičnim antigenom u homogenoj imunofluorokemijskoj reakciji, može dokazati i do 100 antitijela. Suspenzija čestica prolazi kroz protočnicu, obasjava se s dvije laserske zrake od kojih crvena grupira čestice po boji, tj. specifičnom antitijelu, a zelena ekscitira fluorescenciju specifičnog antitijela te ih kvantificira (7). Jedan od primjera primjene tih tehnika je i test AtheNA Multi-Lyte ANA kojim se kvalitativno određuje nazočnost antinuklearnih antitijela te polukvantitativno istovremeno devet pojedinačnih autoantitijela.
Rezultati se očitavaju na sustavu Luminex 100, protočnom citometru prilagođenom za tehnologiju xMAP.
U detekciji antinuklearnih antitijela važno je znati kada je potrebno zamijeniti IIF ANA s novom tehnologijom mnogostrukog određivanja. Cilj našeg ispitivanja bio je utvrditi karakteristike nove metode mnogostrukog određivanja autoantitijela (engl. AtheNA Multi-Lyte ANA test system) u odnosu na dosad korištene metode indirektne imunofluorescencije (IIF ANA) i enzimimunološke metode (ELISA).
 
Materijali i metode
Ispitanici
Ispitivanje je obuhvatilo 897 ispitanika čije smo uzorke seruma obradili u našem laboratoriju u vremenskom intervalu od 7 mjeseci (od lipnja 2006. do prosinca 2006. godine). Ispitanici su odabrani na temelju dijagnoze ili sumnje na autoimuni poremećaj. Uzorci su podijeljeni u tri skupine:
Prva skupina obuhvaćala je 301 ispitanika s dijagnozama: reumatoidni artritis (N = 122), SLE (N = 101), Sjőgrenov sindrom (N = 9), sistemska skleroza (N = 34) i različiti oblici vaskulitisa (N = 35).
U drugoj je skupini bilo 398 ispitanika s kliničkom sumnjom na određenu autoimunu bolest: reumatoidni artritis (N = 47), SLE (N = 22), Sjőgrenov sindrom (N = 7), sistemska skleroza (N = 23), vaskulitis (N = 29) i sumnju na autoimuni poremećaj (N = 270).
U trećoj je skupini bilo 198 ispitanika bez dijagnoze.
U svim pozitivnim uzorcima određena su specifična autoantitijela protiv antigena SS-A/Ro (SSA), SS-B/La (SSB), Smith (Sm), U1-snRNP (RNP), antitijela protiv topoizomeraze 1 (Scl-70), anti-histidil-tRNA (Jo-1), antitijela protiv dvostruke uzvojnice DNA (dsDNA), antitijela protiv centromerskog proteina B (Centromere B), te antitijela protiv histona.
Nakon centrifugiranja odvojeni serum je pohranjen na temperaturi –20 ºC do provođenja analize.
Ispitivanje je odobrilo Etičko povjerenstvo Kliničke bolnice Split (13).
 
Metode
Test AtheNA Multi-Lyte ANA
897 uzoraka seruma ispitano je metodom mnogostrukog određivanja autoantitijela (AtheNA Multi-Lyte ANA test system, Zeus Scientific, Inc., Raritan, NJ, 08869 USA). Test AtheNA Multi-Lyte ANA se primjenjuje za polukvantitativno određivanje autoantitijela usmjerenih na devet različitih antigena (SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, dsDNA, centromera B i histona te kvalitativno dokazivanje ANA u serumu. Na polistirenskim mikročesticama vezani su pročišćeni antigeni SSA, Sm i histoni, dok su SSB, RNP, Jo-1 i centromera B rekombinantni antigeni. U kvalitativnoj detekciji ANA koriste se ekstrakti stanica HEp-2. Uzorak seruma i kontrole razrijedi se 1:21 s odgovarajućim razrjeđivačem. Suspenzija mikročestica miješa se s razrijeđenim uzorkom i inkubira. Ukoliko su prisutna, autoantitijela iz uzorka vežu se za odgovarajući antigen. Nakon ispiranja nevezanoga materijala doda se konjugat (kozji anti-humani IgG obilježen fluoresceinom). Nakon druge inkubacije pristupa se čitanju rezultata testa AtheNA Multi-Lyte ANA prilagođenom protočnom citometru Luminex 100 (Austin, SAD).
Rezultat je pozitivan ako je interna kontrola (HEp-2) ili bilo koji od devet parametara  120 AU/mL. Za granični rezultat smatra se vrijednost od 100 do 120 AU/mL, dok su negativni svi uzorci čiji intenzitet fluorescencije odgovara vrijednosti < 100 AU/mL.
IIF ANA
Autoantitijela su određena imunofluorescentnom tehnikom u 897 seruma. IIF ANA koristi stanice HEp-2 kao supstrat, a kozji anti-humani IgG obilježen fluorescein-izocijanatom kao konjugat (BioSystem S.A. Costa Brava 30, Barcelona, Španjolska). S uzorkom seruma razrijeđenim fosfatnim puferom u omjeru 1:80 prelije se supstrat te nakon inkubacije od 30 minuta i pažljivog ispiranja nevezanog materijala podloga se prekrije konjugatom. Po završetku inkubacije od 30 minuta i ispiranjem preparata s fosfatnim puferom prisutnost ANA se detektira pod fluorescentnim mikroskopom. Po tipu fluorescencije može se približno odrediti o kojem bi se antitijelu moglo raditi, a primjenom potvrdne metode odredi se točno specifično antitijelo. Uz svaku seriju određivane su pozitivna i negativna kontrola. Pozitivnim rezultatom smatra se razrjeđenje  1:80.
ELISA
Metodom ELISA smo u 200 seruma pozitivnih na antinuklearna antitijela odredili specifična antitijela za SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, dsDNA (Hycor Biomedical Ltd Pentlands Science Park, Bush Loan, Penincula, V. Britanija), centromere B i histone (DiaSorin S.p.A. Via Corescentino 13040 Sallugia, Italija). Jažice mikrotitarskih pločica obilježene su antigenima različitoga podrijetla. SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70 i Jo-1 su goveđeg podrijetla, dsDNA iz telećeg timusa, centromeri B su rekombinantni antigen, a histoni su iz pilećih matičnih stanica. Sve su analize izvedene na automatskom analizatoru (miniBOS, Biomedica Gruppe, GMBH, A-1210, Divischgasse 4, Beč, Austrija).
Nakon automatskog razrjeđenja kontrole i uzorka (1:100) u jažice se pipetira standard, uzorak i kontrola te se za vrijeme inkubacije od 30 minuta specifično vežu autoantitijela za odgovarajući antigen. Po završetku inkubacije suvišak se ispere i dodaje konjugat (anti-humani IgG obilježen peroksidazom) te inkubira. Po završetku inkubacije, reakcija peroksidaze na dodani supstrat (tetra-metil benzidin) se prekida nakon 15 minuta s 0,25 M H2SO4. Apsorbancija se očita na 450 nm, a jačina obojenja propocionalna je količini antitijela u serumu. Prema navodu proizvođača za nepreciznost unutar serije koeficijent varijacije (CV%) kreće se u rasponu za: SSA od 2,8% do 3,1%, SSB od 5,5% do 9,1%, Sm od 5,4% do 8,6%, RNP od 2,9% do 11,2%, Scl-70 od 3,0% do 5,1%, Jo-1 od 3,6% do 6,1%, dsDNA od 3,9% do 6,9%, centromere B od 4,8% do 8,6%, te za histone od 6,6% do 10,6%. CV% za nepreciznost između serija kreće se u rasponu za: SSA od 3,5% do 7,9%, SSB od 3,4% do 6,0%, Sm od 3,2% do 5,1%, RNP od 4,9% do 7,4%, Scl-70 od 6,7% do 9,4%, Jo-1 od 2,7% do 8,3%, dsDNA od 8,4% do 9,8%, centromere B od 6,2% do 11,0%, te histone od 8,3% do 12,9%.
Nalaz je pozitivan ako su rezultati za autoantitijelo na SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70 i Jo-1 > 15 U/mL, graničan ako je između 10 i 15 U/mL, a negativan ako je < 10 U/mL. Za dsDNA vrijednosti > 60 U/mL su pozitivne, od 40 do 60 U/mL granične, a < 40 U/mL su negativne, za centromere B vrijednosti > 11 U/mL su pozitivne, od 8 do 11 U/mL granične, a < 8 U/mL negativne i vrijednosti za histone > 21 U/mL pozitivne, od 15 do 21 U/mL granične, a < 15 U/mL negativne.
U ovom smo radu primijenili navedene referentne vrijednosti proizvođača testova.
 
Statistička analiza
Rezultati su obrađeni pomoću statističkog programa SPSS V 8.0 (SPSS Inc, Chicago, IL). Izračunani su koeficijenti korelacije (Spearman rho), uz prihvaćenu razinu značajnosti za P < 0,001, te Cohenov kapa-koeficijent kojim je izražena podudarnost između dvije različite metode za svako antitijelo pojedinačno uz razinu značajnosti P < 0,001.
Osjetljivost i specifičnost testa računane su u odnosu na metodu ELISA koju smo prihvatili kao referentnu metodu i gdje smo definirali: stvarno pozitivne rezultate testa (TP), stvarno negativne rezultate testa (TN), lažno negativne rezultate testa (FN), te lažno pozitivne rezultate testa (FP). Osjetljivost (TP/TP+FN x 100) je izražena kao postotak pozitivnih rezultata u odnosu na pozitivne rezultate testa ELISA, a specifičnost (TN/FP+TNĆ x 100) kao postotak negativnih rezultata u odnosu na negativne rezultate testa ELISA.
 
Rezultati
Antinuklearna antitijela određivali smo kod 897 bolesnika sa sumnjom na autoimune bolesti. Rezultati dobiveni testom AtheNA Multi-Lyte ANA i testom indirektne imunofluorescencije prikazani su u Tablici 1. Kvalitativnom analizom uzoraka s ova dva testa podudarnost rezultata je nađena kod 92,3% uzoraka (70% negativnih i 22,3% pozitivnih). Neslaganje rezultata nađeno je kod 59 (6,6%) uzoraka od kojih je 6 (0,7%) uzoraka bilo lažno pozitivno, 35 (3,9%) lažno negativno, a 18 (2%) je dalo granične rezultate testa AtheNA Multi-Lyte ANA. Svih 35 negativnih uzoraka testa AtheNA Multi-Lyte ANA dalo je negativne rezultate kod testa ELISA, dok su kod testa IIF svi bili pozitivni i to 7 uzoraka je imalo točkastu, a 28 uzoraka homogenu imunofluorescenciju. Svih 6 uzoraka koji su nakon testa AtheNA Multi-Lyte ANA bili pozitivni, a imunofluorescencijom negativni, s ELISA testom su bili pozitivni kao SSA.
 
Tablica 1. Prikaz rezultata dobivenih metodom imunofluorescencije i testom AtheNA Multi-Lyte ANA
 
 
Između 18 graničnih uzoraka nakon testa AtheNA Multi-Lyte, 3 su uzorka bila negativna s IIF ANA, s ELISA-testom SSA pozitivna, a 15 uzoraka je bilo nakon IIF ANA pozitivno. Među 15 uzoraka koji su nakon IIF ANA bili pozitivni, nakon testa ELISA 6 je uzoraka bilo dsDNA pozitivno, 4 Scl-70 pozitivna, dok je 5 uzoraka bilo nakon testa ELISA negativno. Osjetljivost između testa AtheNA Multi-Lyte ANA i testa ELISA je bila od 80% za Scl-70 do 100% za SSA, specifičnost od 92,3% za dsDNA do 98,3% za Sm (Tablica 2).
 
Tablica 2. Osjetljivost i specifičnost metoda AtheNA Multi-Lyte ANA i ELISA
 
Antinuklearna antitijela kod 200 pozitivnih uzoraka koji su usporedno ispitani testovima AtheNA Multi-Lyte ANA i IIF izražena su kao kvalitativni rezultati. Svi pozitivni serumi su ispitani s ELISA-pojedinačnim antigenom i testom AtheNA Multi-Lyte ANA na pojedinačne antigene: SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, dsDNA, centromere B i histone i izraženi su kao polukvantitativni rezultati. Kada su uspoređeni rezultati za pojedinačna autoantitijela testova AtheNA Multi-Lyte ANA i ELISA, za svako autoantitijelo dobivena je značajna korelacija (P < 0,001) (Tablica 3). Za procjenu slaganja dviju metoda pomoću Cohenovog kapa-koeficijenta za svako je pojedinačno antitijelo dobivena također značajna korelacija (P < 0,001) (Tablica 3).
 
Tablica 3. Korelacija specifičnih autoantitijela između AtheNA Multi-Lyte ANA i ELISA i procjena slaganja dviju metoda
 
Kada su uspoređeni rezultati svih 200 uzoraka pozitivnih prema metodama AtheNA Multi-Lyte ANA i ELISA, bez obzira na različitost u metodologiji dobivena je podudarnost rezultata od 90,5% do 100% (Tablica 4).
 
Tablica 4. Podudarnost rezultata među pozitivnim uzorcima seruma za AtheNA Multi-Lyte ANA i metodu ELISA
 
 
Rasprava
Detekcija antinuklearnih antitijela provodi se kod različitih autoimunih sistemskih i organospecifičnih bolesti, uz primjenu brojnih tehnika i metoda kao što su imunofluorescencija, imunodifuzija, enzimska imunometoda, imunoblot i u zadnje vrijeme analiza mnogostrukog određivanja utemeljena na načelu protočne citometrije. Na laboratoriju je zadatak da zajedno s kliničarima odredi metodu koju će primijeniti u detekciji brojnih autoantitijela kako bi se ustanovila ona najznačajnija. Istovremeno primijenjena metoda mora biti brza, učinkovita, jednostavne izvedbe i isplativa. U našem smo radu ispitivali kombinaciju testova kako bismo utvrdili koja od metoda je najučinkovitija za pretraživanje, a potom i utvrđivanje specifičnih autoantitijela. Ipak, potrebno je napomenuti da je jedino zajedno s kliničkom validacijom dobivenih rezultata moguće zaključiti o kliničkoj specifičnosti i osjetljivosti testa.
Indirektna imunofluoroscencija (IIF) je osjetljiva metoda s poznatim ograničenjima kao što su vrsta supstrata, način izvođenja testa, subjektivna interpretacija, niska reproducibilnost i nedostatak standardizacije.
Metoda mnogostrukog određivanja autoantitijela kao test AtheNA Multi-Lyte ANA priređena je za kvalitativnu detekciju ANA i istovremeno za polukvantitativno određivanje IgG-razreda specifičnih antitijela na SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, dsDNS, centromere B i histone antigene u serumu. Sistemske autoimune bolesti karakterizira odnos pojedinih autoantitijela te je nakon pretraživanja uzorka bitno odrediti koja su specifična autoantitijela i u kojoj količini zastupljena.
Usporedbom kvalitativnih rezultata IIF ANA i AtheNA Multi-Lyte ANA podudarnost je iznosila 92,3%. Od 897 testiranih seruma 35 (3,9%) je bilo pozitivno s IIF ANA, a negativno s AtheNA Multi-Lyte ANA (Tablica 1). Oblik fluorescencije ovih uzoraka bio je nespecifičan i izražen kao točkasta i homogena fluorescencija. Pozitivni uzorci s IIF ANA nađeni su u skupini bolesnika sa sumnjom na autoimuni poremećaj i među uzorcima bolesnika bez dijagnoze, što je moguće s obzirom na nespecifičnost i kliničku nedefiniranost ovih uzoraka. IIF ANA detektira brojna autoantitijela na jezgrine centriole, signalne molekule te stanične sastojke koji također mogu biti od koristi u kliničkoj dijagnostici (8,9). Imajući u vidu da veliki broj uzoraka nema utvrđenu dijagnozu te da se među njima nalaze i bolesnici kod kojih postoji sumnja na organospecifičnu bolest, koristili smo razrjeđenja uzorka 1:80, iako je preporuka da se za detekciju kod sistemskih bolesti koristi razrjeđenje 1:160 (10,11).
Nalaz 6 (SSA) pozitivnih i 3 (SSA) granična rezultata primjenom AtheNA Multi-Lyte ANA, a negativnih s IIF ANA potvrđuje da je ANA HEp-2 supstrat nedovoljno osjetljiv za SSA (12). Razlika u negativnim rezultatima ostavlja mogućnost pogrešnog tumačenja rezultata (14-16). Usprkos nedovoljnoj osjetljivosti za SSA i Jo-1 antigen, IIF ANA rijetko daje lažno negativne rezultate. Martins i sur. uspoređivali su metodu ELISA za SSA, SSB, Sm, RNP i Scl-70 s metodom mnogostrukog određivanja testa ENA 5 Luminex. Podudarnost rezultata bila je od 93,6% ili naviše, osjetljivost 50% za Scl-70 do 100% za SSA i specifičnost od 97,9% za Sm do 99,5% za SSB (17). Naši su rezultati pokazali podudarnost od 90,5% za RNP do 100% za SSB, osjetljivost od 80,0% za Scl-70 do 100,0% za SSA i specifičnost 92,3% za dsDNA do 98,3% za Sm između testova AtheNA Multi-Lyte ANA i ELISA (Tablica 2, Tablica 4). Usporedbom testa AtheNA Multi-Lyte ANA i pojedinačnih testova ELISA dobili smo značajnu korelaciju (Spearman R od 0,612 do 0,924, P < 0,001), što je u suglasnosti i s brojnim studijama koje su usporedbom istih metoda pokazale dobru podudarnost (17-21). Nifli i sur. uspoređivali su testove ELISA i AtheNA Multi-Lyte ANA za SSA, SSB, Sm, RNP i dobili značajnu korelaciju (kapa od 0,347 do 0,764, P < 0,001) izuzev za citoplazmatski antigen Jo-1. Zaključili su da test AtheNA Multi-Lyte ANA može zamijeniti pojedinačni test ELISA u mjerenju specifičnih autoantitijela izuzev za antigen Jo-1 kod kojega se vjerojatno koriste različiti epitopi na molekuli antigena u navedenim metodama (20). Usporedba dviju metoda u našem određivanju za sva autoantitijela daje značajnu korelaciju (kapa-koeficijent od 0,834 za SSA do 0,507 za centromere B). Shovman i suradnici uspoređivali su rezultate dobivene metodom ELISA za pretraživanje ANA i test AtheNA Multi-Lyte ANA kod zdravih osoba i dobili su podudarnost u 99% slučajeva, dok je podudarnost iz uzoraka dobivenih iz drugih laboratorija bila 97,7%. Zaključili su da je test AtheNA Multi-Lyte ANA osjetljiv za detekciju ANA (18). Međutim, metoda ELISA za pretraživanje ANA može propustiti neke antigene jer je test pripremljen iz ekstrakta stanica HEp-2 s ograničenim brojem antigena. Usporedbom pojedinačnih rezultata za specifična autoantitijela dobili smo neke razlike (Tablica 4). Svi rezultati koji se nisu podudarali bili su oko graničnih vrijednosti pojedinačnih testova deklariranih prema proizvođačima, izuzev 3 uzorka za Scl-70 i 4 za dsDNA. Razlika u rezultatima za 3 Scl-70 i 4 dsDNA dobivenih kao pozitivni testom ELISA i negativni testom AtheNA Multi-Lyte ANA može biti zbog različite pripreme antigena, prezentacije antigena autoantitijelu, različitih uvjeta u odvijanju reakcije među metodama, razlici u metodologiji, razlici u pripremi antigena (pročišćeni ili rekombinantni), kapacitetu vezanja i koncentraciji drugog antitijela te konjugatu (20,22). Uvjeti testa kao ionska jakost i granična vrijednost (engl. cut off) također utječu na razlike među testovima. Antigeni Scl-70 i dsDNA vezani su kovalentnom vezom za karboksilnu skupinu istaknutu na površini mikročestice te, ukoliko nisu uravnoteženi postupak vezanja, aktivacije, koncentracije mikročestica, kvaliteta vezanja antigena u stabilizirajućoj otopini i postupak ispiranja filtracijom, može doći do lažno negativnog rezultata za specifično antitijelo. Lažno negativni rezultat može prouzročiti pogreške u postavljanju kliničke dijagnoze ili, ukoliko se radi o terapiji, dovesti do pogrešnoga liječenja. Granični se rezultati moraju ili potvrditi kao pozitivni ili odbaciti kao negativni. Važno je znati da se testom AtheNA Multi-Lyte ANA može odrediti 9 specifičnih autoantitijela, dok IIF ANA na stanicama HEp-2 ima veću mogućnost detektiranja brojnih antigena. Razumijevanje razlika u metodama važno je za tumačenje rezultata u kliničkom kontekstu.
 
Zaključak
Testovi AtheNA Multi-Lyte ANA i IIF ANA pokazuju dobru podudarnost kao i usporedba rezultata s pojedinačnim ELISA u sistemskim autoimunim bolestima. Test AtheNA Multi-Lyte ANA omogućava brzu identifikaciju klinički relevantnih autoantitijela u sistemskim autoimunim bolestima bez potrebe daljnjeg testiranja. Za laboratorij je učinkovita, jednostavna za rad i omogućava izradu velikoga broja autoantitijela istovremeno iz jednog uzorka. Važno je znati može li se reći za testove da se dobro podudaraju ili ne, ali bez kliničke evaluacije koja uključuje bolesnike s potvrđenom dijagnozom za autoimunu bolest i one iz zdrave populacije, vrijednosti testa su nepotpune.
 
Literatura
1.    Damoiseaux JGMC, Cohen Tervaert JW. From ANA to ENA: How to proceed? Autoimmunity Reviews 2006;5:10-7.
2.    Gonzáles-Buitrago JM, Gonzáles C. Present and future of the autoimmunity laboratory. Clinica Chimica Acta 2006;365:50-7.
3.    Hayashi N, Kawamoto T, Mukai M, Morinobu A, Koshiba M, Kondo S, et al. Detection of antinuclear antibodies by use of an enzyme immunoassay with nuclear Hep-2 cell extract and recombinant antigens: comparison with iImmunofluorescence assay in 307 patients. Clin Chem 2001;47:1649-59.
4.    Fenger M, Wiik A, Høter-Madsen M, Lykkegaard JJ, Rozenfeld T, Hansen MS, et al. Detection of antinuclear antibodies by solid-phase immunoassays and immunofluorescence analysis. Clin Chem 2004;50:2141-7.
5.    Tan EM, Smolen JS, McDougalJS, Butcher BT, Conn D, Dawkins R, et al. A critical evaluation of enzyme immunoassays for detection of antinuclear autoantibodies of defined specificities. Precision, sensitivity, and specificity. Arthritis Rheum 1999;42:455-64.
6.    Gonzáles-Buitrago JM. Multiplexed testing in the autoimmunity laboratory. Clin Chem Lab Med 2006;44(10):1169-74.
7.    Fritzler MJ. Advances and applications of multiplexed diagnostic technologies in autoimmune diseases. Lupus 2006;15:422-7.
8.    Wiik A, Cervera R, Haass M, Kallenberg C, Khamashata M, Meroni PL, et al. European attempts to set guidelines for improving diagnostics of autoimmune rheumatic disorders. Lupus 2006;15:391-6.
9.    Wiik AS. Anti-nuclear autoantibodies. Clinical utility for diagnosis, prognosis, monitoring, and planning strategy in systemic immunoinflammatory diseases. Scand J Rheumatol 2005;34:260-8.
10. Kavanaugh A, Tomar R, Reveille J, Solomon D, Homburger HA. Guidelines for clinical use of the nuclear antibody test and tests for specific autoantibodies to nuclear antigens. Arch Pathol Lab Med 2000;124:71-81.
11. Wiik AS, Gordon TP, Kavanaugh AF, Lahita RG, Reeves W, Van Venrooij WJ, et al. Cutting edge diagnostics in rheumatology: the role of patients, clinicians, and laboratory scientists in optimizing the use of autoimmune serology. Arthritis Rheum 2004;51:291-8.
12. Itoh Y, Rader MB, Reichlin M. Heterogenity of the Ro/SS-A antigen and autoanti-Ro/SS-A response: evidence of the four antigenetically distinct forms. Clin Exp Immuno 1990;81:45-51.
13. Bossuyt PM, Reitsma JB, Bruns DE, Gatsonis CA, Glasziou PP, Irwing LM, et al. The STARD statement for reporting studies of diagnostics accuracy: explanation and elaboration. Clin Chem 2003;49:7-18.
14. Bayer PM, Fabian B, Hubl W. Immunofluorescence assays (IFA) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) in autoimmune disease diagnostics -technique, benefits, limitations and applications. Scand J Clin Lab Invest Suppl 2001;235:(Suppl)68-76.
15. Dahle C, Skogh T, Aberg AK, Jalal A, Olcen P. Methods of choice for diagnostics antinuclear antibody (ANA) screening. Benefit of adding antigen-specific assays to immunofluorescence microscopy. J Autoimmun 2004;22:241-8.
16. Hoffman IEA, Peene I, Veys EM, De Keyser F. Detection of specific antinuclear reactivities in patients with negative anti-nuclear antibody immunofluorescence screening tests. Clin Chem 2002;48:2171-6.
17. Martins TB, Burlingame R, Von Mühlen CA, Jaskowski TD, Litwin CM, Hill HR. Evaluation of multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for detection of autoantibodies to nuclear antigens. Clin and Dia Lab Immunology 2004;11:1054-9.
18. Shovman O, Gilburd B, Zandman-Goddard G, Yehiley A, Langevitz P, Shoenfeld Y. Multiplexed AtheNA multi-lyte immunoassay for ANA screening in autoimmune diseases. Autoimmunity 2005;38(1):105-9.
19. Rouquette AM, Desqruelles C, Larosche P. Evaluation of the new multiplexed immunoassays, FIDIS, for simultaneous quantitative determination of antinuclear antibodies and comparison with conventional methods. Am J Clin Pathol 2003;120:676-81.
20. Nifli AP, Notas G, Mamoulaki M, Niniraki M, Ampartzaki V, Theodoropoulos PA, et al. Comparison of a multiplex, bead-based fluorescent assay and immunofluorescence methods for the detection of ANA and ANCA autoantibodies in human serum. J Immunol Methods 2006;311:189-97.
21. Biagini RE, Parks CG, Smith JP, Sammons DL, Robertson SA. Analytical performance of the AtheNA MultiLyte ANA II assay in sera from lupus patients with multiple positive ANAs. Anal Bioanal Chem 2007;388;613-8.
22. Binder SR. Autoantibody detection using multiplex technologies. Lupus 2006;15:412-21.
23. Seideman J, Perrit D. A novel monoclonal antibody screening method using the Luminex-100 microsphere system. J Immunol Methods 2002;267:265-71.

 Izvorni znanstveni članak

 

Slavica Dodig1, Daniela Galez2, Ivka Zoričić-Letoja1, Branka Kristić-Kirin1, Kornelija Kovač1, Boro Nogalo1, Jadranka Živčić1, Renata Zrinski-Topić1. C-reaktivni protein i komplement C3 i C4 u djece s latentnom tuberkuloznom infekcijom. Biochemia Medica 2008;18(2):42-51.
 

1 Dječja bolnica Srebrnjak; Referentni centar Ministarstva zdravstva za kliničku alergologiju djece, Zagreb

2 Opća bolnica Karlovac, Karlovac

 

*Adresa za dopisivanje: slavica [dot] dodig [at] zg [dot] t-com [dot] hr
 
Sažetak
Cilj: U posljednje se vrijeme hsCRP (engl. high sensitive CRP) primjenjuje kao prognostički biljeg kronične upale. Cilj ovoga rada bio je ispitati dolazi li do promjene serumske koncentracije hsCRP, C3 i C4 u djece s latentnom tuberkuloznom infekcijom nakon dva mjeseca profilakse izonijazidom.
Ispitanici i metode: Ukupno je ispitano 79-ero djece podijeljene u tri skupine: 1) ispitanici s latentnom tuberkuloznom infekcijom (LTBI); 2) ispitanici s tuberkulozom pluća; 3) klinički zdravi ispitanici upućeni na sistematski pregled, s biokemijsko-hematološkim pokazateljima unutar referentnih vrijednosti za dob – kontrolna skupina. Krv je uzorkovana dvaput: prije započinjanja terapije i poslije dvomjesečne terapije tijekom koje su lijekovi primjenjivani svakodnevno. Imunokemijskim metodama određena je koncentracija hsCRP, C3 i C4.
Rezultati: Koncentracija hsCRP, C3 i C4 u ispitanika s LTBI prije profilakse izonijazidom bila je statistički značajno veća nego u kontrolnoj skupini. Nakon profilakse izonijazidom u osoba s LTBI koncentracija hsCRP bila je statistički značajno manja nego prije primjene izonijazida. Specifičnost je za sve odabrane analite bila veća nego osjetljivost. Granične vrijednosti za hsCRP imale su bolju dijagnostičku učinkovitost nego granične vrijednosti za C3 odnosno C4.
Zaključak: Koncentracija hsCRP može se primijeniti za praćenje bolesnika s LTBI u svrhu procjene odgovora na profilaksu izonijazidom i stupnja aktivnosti bolesti.
Ključne riječi: dijete, komplement C3, komplement C4, C-reaktivni protein, latentna tuberkulozna infekcija, tuberkuloza
Pristiglo: 26. lipnja 2007.                                                                                                   Prihvaćeno: 15. siječnja 2008.
 
 
Uvod
Tuberkuloza (TBC) je bolest označena upalom plućnog parenhima, a uzrokovana je unutarstaničnom bakterijom, mikobakterijem tuberkuloze (M. tuberculosis). Oko 2 milijarde ljudi ima latentnu infekciju mikobakterijem tuberkuloze (LTBI) (1). Budući da od infekcije do očitovanja bolesti može proći i dulje vrijeme, važno je inficirane prepoznati prije početka razvoja bolesti kako bi se pravodobnom profilaksom spriječilo razvijanje bolesti. Tuberkulinski kožni test (engl. tuberculin skin test, TST) kao „zlatni standard“ te in vitro određivanje gama-interferona kao jedna od novijih dijagnostičkih metoda (2,3) (uključujući anamnezu, podatak o kontaktu s TBC bolesnikom, kliničku sliku, rendgenogram prsišta) ključne su pretrage za otkrivanje infekcije M. tuberculosis. Nuspojave primjene antituberkuloznih lijekova, kako u bolesnika s aktivnom tuberkulozom tako i u osoba s LTBI prate se određivanjem kompletne krvne slike, broja trombocita, te testovima za ispitivanje jetrene funkcije (4), a longitudinalno određivanje koncentracije C-reaktivnog proteina (CRP) može se primijeniti kao pokazatelj aktivnosti bolesti (5).
CRP je dobro poznati biljeg akutne upale, koncentracija kojega se u serumu često određuje radi procjene stupnja sistemske upale (6), primjerice kod reumatskih (7) ili crijevnih bolesti (8) ili kako bi se utvrdila bakterijska etiologija neke upale, primjerice pneumonije, kako u odraslih (9) tako i u djece (10). Posljednjih se godina za određivanje vrlo malih koncentracija CRP primjenjuje imunoturbidimetrijska metoda na lateks česticama. Tom se metodom povećava analitička osjetljivost određivanja koncentracije tzv. visoko osjetljivog, hsCRP (engl. high sensitive) u serumu do 0,1 mg/L, što je omogućilo da se određivanje koncentracije hsCRP primjenjuje i kao prognostički upalni biljeg kronične upale u bolesnika s kardiovaskularnim bolestima (11), šećernom bolešću (12,13) i astmom (14,15).
CRP kao protein akutnog odgovora sudjeluje u regulaciji sustava komplementa (16). Ispitivanje uloge sustava komplementa posljednjih godina doživljava preporod zbog njegove uloge ne samo u infekciji, upali ili alergijskoj reakciji, nego i u uklanjanju apoptotičnih stanica (17), u razvoju autoimunih bolesti (18), ali i u mogućoj primjeni u terapijske svrhe (19). Mikobakterij tuberkuloze također može preko humanog monocitnog receptora C1 aktivirati sustav komplementa (20).
Ovim radom željeli smo ispitati dolazi li do promjene u koncentraciji hsCRP, C3 i C4 u djece s latentnom tuberkuloznom infekcijom. Koncentracije hsCRP te komponenata komplementa C3 i C4 određivale su se prije profilakse izonijazidom i poslije dvomjesečne profilakse tijekom koje je izonijazid primjenjivan svakodnevno.
 
Ispitanici i metode
Ispitanici
Ukupno je analizirano 79 ispitanika u dobi od 2,5 mjeseca do 18 godina, koji su u razdoblju od listopada 2005. do siječnja 2007. godine bili upućeni u Dječju bolnicu Srebrnjak, Zagreb radi sistematskog pregleda ili u svrhu otkrivanja moguće infekcije bakterijom M. tuberculosis. Ispitanici su prema dijagnozi svrstani u tri skupine:
1. ispitanici s LTBI (N = 26, dob 1–18 godina) koji su bili u bliskom kontaktu s tuberkuloznim bolesnikom i imaju pozitivan nalaz tuberkulinskog kožnog testa s pročišćenim proteinskim derivatom (engl. purifiedproteinderivative, PPD); ispitanici su kao profilaksu su dobivali izonijazid;
2. djeca s tuberkulozom pluća (N = 18, dob 2,5 mjeseca do 18 godina); dijagnoza je postavljena na temelju kliničke slike, pozitivnog nalaza tuberkulinskoga kožnog testa s PPD, nalaza specifičnih tuberkulotskih promjena na radiogramu pluća, te mikrobiološkog nalaza M. tuberculosis u sputumu, bronhalnom aspiratu ili ispirku želuca. Bolesnici su kao terapiju dobivali 4 antituberkulotika (izonijazid, rifampicin, etambutol, pirazinamid).
3. klinički zdravi ispitanici (N = 35, dob 4–18 godina) upućeni na sistematski pregled, s biokemijsko-hematološkim pokazateljima unutar referentnih vrijednosti za dob.
Krv za analizu uzimana je između 8 i 12 sati. Dva mjeseca nakon uzimanja propisanih lijekova krv je ponovno uzimana u ispitanika s LTBI i bolesnika s TBC. Istraživanje je odobrilo etičko povjerenstvo bolnice, a roditelji su potpisali informirani pristanak.
 
Metode
Određivanje koncentracije hsCRP, C3 i C4
Koncentracija hsCRP (imuno-turbidimetrijska metoda na lateks česticama) te koncentracija C3 i C4 komponente komplementa (imuno-turbidimetrijska metoda) određivane su na biokemijskom analizatoru Olympus AU 400 (Olympus, Tokyo, Japan) uz primjenu reagensa istog proizvođača (Olympus System Reagents, Olympus Diagnostica, Hamburg, Germany).
 
Statističke metode
Pohrana podataka i priprema za statističku analizu učinjena je u programu Excel 2000 programskog paketa Microsoft Office (Microsoft, SAD). Obrada podataka učinjena je u programu za statističku obradu MedCalc 9.4.1.0 (Medisoftware, Mariakerke, Belgium) (21). Varijable koje su slijedile normalnu raspodjelu opisane su aritmetičkom sredinom (x) i standardnom devijacijom (SD), dok su varijable koje nisu slijedile normalnu raspodjelu prikazane medijanom (M) i interkvartilnim rasponom (engl. interquartile range, IQR). Za usporedbu zavisnih varijabla primijenjeni su su parni Studentov t-test (za normalnu razdiobu) i Wilcoxonov test (za asimetričnu razdiobu). Za usporedbu više nezavisnih skupina primijenjen je ANOVA test, odnosno neparametrijski Kruskal-Wallis test za raspodjele koje nisu bile normalne. Vrijednosti P < 0,05 smatrane su statistički značajnima. ROC (engl. Receiver Operating Characteristic) analiza primijenjena je za određivanje optimalne granične vrijednosti, površine ispod ROC krivulje (engl. area under the curve, AUC), specifičnosti, osjetljivosti i prediktivne vrijednosti.
 
Rezultati
Rezultati u ispitanika prikazani su u tablici 1. Statistička analiza pokazala je normalnu razdiobu za sve analite osim za hsCRP u skupini LTBI, uzorak 1. ANOVA test za C3 odnosno C4 pokazao je statistički značajnu razliku između ispitivanih skupina (P = 0,007 odnosno P = 0,001). Koncentracija hsCRP, C3 i C4 u ispitanika s LTBI prije profilakse izonijazidom(uzorak 1) bila je statistički značajno veća nego u djece kontrolne skupine (tablica 2.). Koncentracija hsCRP, C3 i C4 je u bolesnika s TBC prije terapije (uzorak 1) bila statistički značajno veća nego u djece kontrolne skupine.
 
Tablica 1. Koncentracije hsCRP, C3 i C4 u kontrolnoj skupini, skupini djece s LTBI i djece s TBC prije (uzorak 1) i poslije (uzorak 2) terapije.
 
Tablica 2. Statistička značajnost razlike u koncentraciji hsCRP, C3 i C4 između kontrolne skupine i ispitanika s LTBI i TBC (ANOVA test i Kruskal-Wallis test)
 
 
Nakon profilakse izonijazidom (uzorak 2) u djece s LTBI koncentracija hsCRP bila je statistički značajno manja nego prije primjene izonijazida. Jednako tako je koncentracija hsCRP u bolesnika s TBC nakon dvomjesečne terapije (uzorak 2) bila statistički značajno manja (ali je ostala značajno veća u usporedbi s vrijednostima u kontrolnoj skupini). Post hoc test ukazao je na razlike u vrijednostima između uzoraka 1 u skupini LTBI i skupini TB. Kruskal-Wallis test za hsCRP ukazao je na značajne razlike između ispitivanih skupina (P < 0,001). Nije postojala značajna razlika u koncentraciji C3 i C4 prije i poslije terapije niti u skupini LTBI niti u skupini TB. Međutim, postojala je značajna razlika u vrijednostima hsCRP prije i poslije terapije u objema skupinama, LTBI (P = 0,014) i TB (P = 0,026).
Obrađene su ROC krivulje za vrijednosti prije terapije u skupinama LTBI i TB (tablica 3.). U skupini bolesnika s TBC površina ispod krivulje (AUC) bila je statistički značajno veća (P = 0,037) nego u kontrolnoj skupini samo za hsCRP, a u skupini djece s LTBI nije bilo statistički značajne razlike ni za jedan ispitivani parametar (P > 0,05).
 
Tablica 3. ROC analiza prijeterapijskih vrijednosti hsCRP, C3 i C4 u ispitanika s LTBI i bolesnika s tuberkulozom
 
 
Rasprava
Rezultati istraživanja pokazali su da su, u odnosu na kontrolnu skupinu, koncentracije hsCRP, C3 i C4 statistički značajno veće u djece s LTBI (prije profilakse), te u djece s TBC (prije i poslije dvomjesečne antituberkulotske terapije). Istodobno su vrijednosti hsCRP bile značajno manje nakon dvomjesečne terapije (usporedba s vrijednostima prije terapije) u objema skupinama (LTBI odnosno TB).
Bajaj i sur. su još 1989. godine ukazali na mogućnost primjene CRP u procjeni aktivnosti tuberkuloze (5). Međutim, podatci o određivanju koncentracije CRP u serumu bolesnika s tuberkulozom su proturječni. Neki autori opisuju bolesnike s aktivnom tuberkulozom bez povećane koncentracije CRP (22), dok drugi opisuju bolesnike s povećanom koncentracijom CRP (23,24). Naši su rezultati također pokazali da se praćenje koncentracije hsCRP može primijeniti za praćenje upale u bolesnika s TBC odnosno LTBI. U djece s LTBI veću vrijednost ima određivanje koncentracije CRP metodom visoke osjetljivosti (hsCRP), jer može ukazati na umjerene upalne promjene, što metode manje analitičke osjetljivosti ne omogućuju. U tom slučaju granične vrijednosti koje bi mogle razlikovati zdrave od bolesnih značajno su manje (15). U dostupnoj literaturi nismo našli podataka o koncentraciji hsCRP u djece inficirane M. tuberculosis.
Komponenta komplementa C3 može aktivirati alternativni put (20,25), pričemu, čini se, receptor komplementa CR3 na površini makrofaga može posredovati povezivanje M. tuberculosis s makrofagom, ali ne i unutarstanično umnožavanje mikobakterija (26,27). Prema Stokesu i sur. jačina vezanja mikobakterija i makrofaga ovisi o fenotipu makrofaga (28). Dubaniewicz i sur. su opisali povećanje koncentracije C3, ali ne i C4, u bolesnika s aktivnom tuberkulozom (27). U istom istraživanju bolesnici s inaktivnom tuberkulozom nisu imali promijenjene vrijednosti C3 i C4. U našem istraživanju je koncentracija i C3 i C4 bila povećana u osoba s LTBI te u bolesnika s TB.
Činjenica da su vrijednosti za specifičnost bile manje nego vrijednosti za osjetljivost ukazuje na to da se temeljem graničnih vrijednosti mogu bolje izdvojiti zdrave osobe (uistinu negativni rezultati).
Većina djece s početnom tuberkuloznom infekcijom nema simptoma ni komplikacija infekcije (29). Lezije plućnog parenhima nisu vidljive na radiogramu pluća, limfni čvorovi nisu uvećani. Dijete ima samo pozitivan tuberkulinski test. Ovi preliminarni rezultati ukazali su na to da latentna kronična upala nije vjerojatna u djece s pozitivnim PPD i koncentracijama hsCRP, C3 i C4 manjima od graničnih vrijednosti. Konačnu procjenu o profilaksi donijet će liječnik.
Prema našim spoznajama ovo je prvi prikaz hsCRP u djece s LTBI. Nedostatak ovoga istraživanja bio je mali broj ispitanika, čemu možemo pripisati i nedovoljnu statističku značajnost razlike analize ROC krivulje. Potvrde li se rezultati ovoga rada u nekom neovisnom istraživanju na većem broju ispitanika, hsCRP mogao bi se smatrati korisnim biljegom za praćenje bolesnika s LTBI u svrhu procjene odgovora na profilaksu izonijazidom i stupnja aktivnosti bolesti.
 
Literatura
1.    World Health Organization. Global tuberculosis control: surveilleance, planning, financing. WHO Report 2005. Geneva, 2005.
2.    Lalvani A, Pathan AA, McShane H, Wilkinson RJ, Latif M, Conlon CP, et al. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific T-cells. Am J Respir Crit Care Med 2001;163:824-8.
3.    Mazurek GH, LoBue PA, Daley CL, Bernardo J, Lardizabal AA, Bishai WR et al. Comparison of a whole-blood interferon γ assay with tuberculin skin testing for detecting latent Mycobacterium tuberculosis infection. JAMA 2001;286:1740-7.
4.    Targeted Tuberculin Testing and Treatment of Latent Tuberculosis Infection. ATS/CDC Statement Committee on Latent Tuberculosis Infection Membership List, June 2000. Available at: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/rr4906a1.htm. Accessed December 27th 2007.
5.    Bajaj G, Rattan A, Ahmad P. Prognostic value of C-reactive protein i tuberculosis. Indian Pediatr 1989;26:1010-3.
6.    Pepys MB, Baltz MC. Acute phase proteins with special reference to C-reactive protein and related proteins (pentaxins) and serum amyloid A protein. Adv Immunol 1983;34:141-212.
7.    Emery P, Luqmani R. The validity of surrogate markers in rheumatic disease. Br J Rheumatol 1993;32:Suppl 3:3-8.
8.    Walker-Smith JA. Chronic inflammatory bowel disease in children: a complex problem in management. Postgrad Med J 2000;76:469-72.
9.    Lagerstrom F, Engfeldt P, Holmberg H. C-reactive protein in diagnosis of community-acquired pneumonia in adult patients in primary care. Scand J Infect Dis 2006;38:964-9.
10. Korppi M. Non-specific host response markers in the differentiation between pneumococcal and viral pneumonia: what is the most accurate combination? Pediatr Int 2004;46:545-50.
11. Ridker PM. Clinical application of C-reactive protein for cardiovascular disease detection and prevention. Circulation 2003;107:363-9.
12. Coulon J, Willems D, Dorchy H. Increase in C-reactive protein plasma levels during diabetes in infants and young adults. Presse Med 2005;34:89-93.
13. Pradhan AD, Manson JE, Rifai N, Buring JE, Ridker PM. C-reactive protein, interleukin 6, and risk of developing type 2 diabetes mellitus. JAMA 2001;286:327-34.
14. Takemura M, Matsumoto H, Niimi A, Ueda T, Matsuoka H, Yamaguchi M, et al. High sensitivity C-reactive protein in asthma. Eur Respir J 2006;27:908-12.
16. Galez D, Dodig S, Raos M, Nogalo B. CRP in children with asthma and allergic rhinitis. Biochemia Medica 2006;16(2):163-9.
16. Pepys MB, Hirschfield GM. C-reactive protein: a critical update. J Clin Invest 2003:111:1805-12.
17. Botto M. Links between complement deficiency and apoptosis. Arthritis Res 2001;3:207-10.
18. Boackle SA, Holers VM. Role of complement in the development of autoimmunity. Curr Dir Autoimmun 2003;6:154-6.
19. Boackle SA. Complement and autoimmunity. Biomed Pharmacother 2003;57:269-73.
20. Schlesinger LS, Bellinger-Kawahara CG, Payne NR, Horwitz MA. Phagocytosis of Mycobacterium tuberculosis is mediated by human monocyte complement receptors and complement component C3. J Immunol 1990;144:2771-80.
21. MedCalcDownload, Available at: www.medcalc.be/download.php. Accessed December 27th 2007.
22. Ito KM, Yoshiyama T, Wada M, Ogata H. C-reactive protein in patients with bacteriological positive lung tuberculosis. Kekkaku 2004;79:309-11. Available at; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ Accessed August 7th 2007.
23. Peroš-Golubičić T. C-reactive protein in sarcoidosis. Acta Med Iugosl 1991;45:169-74.
24. Koyanagi A, Kuffö, Gresely L, Shenkin A, Cuevas LE. Relationships between serum concentrations of C-reactive protein and micronutrients in patients with tuberculosis. Ann Trop Med Parasitol 2004;98:391-9.
25. Mueller-Ortiz SL, Wanger AR, Norris SJ. Mycobacterial protein HbhA binds human complement component C3. Infect Immun 2001; 69: 7501-11.
26. Velasco-Velazquez MA, Barrera D, Gonzalez-Arenas A, Rosales C, Agramonte-Hevia J. Macrophage – Mycobacterium tuberculosis interactions: role of complement receptor 3. Microb Pathog 2003;35:125-31.
27. Dubaniewicz A, Sztaba-Kania M, Hoppe A. Analysis of some immunological parameters in pulmonary tuberculosis. Pol Merkur Lekarski 2004;16:123-7.
28. Stokes RW, Haidl ID, Jefferies WA, Speert DP. Mycobacteria – macrophage interactions. Macrophage phenotype determines the nonopsonic binding of Mycobacterium tuberculosis to murine macrophages. J Immunol 1993;151:7067-76.
29. Starke JR. Tuberculosis in children. Semin Respir Crit Care Med 2004; 25:353-64.

Izvorni znanstveni članak

 

Hossein Hadinedoushan1, Abbas Aflatounian2, Morteza Anvari3. Uloga IL-2 i reumatoidnog faktora u ponovljenom spontanom pobačaju. Biochemia Medica 2008;18(2):201-5.

1Klinika za imunologiju, Istraživački i klinički centar za neplodnost, Yazd, Iran

2Klinika za ginekologiju i porodništvo, Istraživački i klinički centar za neplodnost, Yazd, Iran

3Klinika za anatomiju, Istraživački i klinički centar za neplodnost, Yazd, Iran

 

*Adresa za dopisivanje: hhadin [at] ssu [dot] ac [dot] ir

 

Sažetak

Cilj: Ponovljeni spontani pobačaj (PSP), tj. ponavljanje triju ili više uzastopnih pobačaja, pojavljuje se u približno 1-2% žena u reproduktivnoj dobi. Pretpostavlja se da bi određeni broj ponovljenih gubitaka trudnoće mogao biti uzročno povezan s imunošću. Svrha ove studije bila je odrediti ulogu interleukina-2 (IL-2) i reumatoidnog faktora (RF) u PSP.

Materijali i metode: Ovo je istraživanje parova provedeno na dvije različite skupine. Prva se skupina sastojala od 56 žena koje su imale tri ili više PSP, a druga od 63 zdrave žene bez pobačaja u anamnezi i uz barem jednu uspješnu trudnoću. U uzorcima seruma ispitana je prisutnost IL-2 pomoću metode ELISA i RF testom lateks-aglutinacije.

Rezultati: Dvije od 56 žena u prvoj skupini imale su IL-2 u serumu. U drugoj skupini nijedna žena nije imala IL-2 u serumu. Također, 53,5% žena u prvoj skupini i 6% žena u drugoj skupini bilo je pozitivno na RF pri različitim titrovima. Postojale su statistički značajne razlike između skupina I i II s obzirom na RF (P = 0,002).

Zaključci: Koncentracija IL-2 ne utječe na ishod trudnoće, dok je prevalencija RF u žena s PSP bila viša nego u normalnih ispitanica. Stoga se preporučuje ispitivanje uloge RF u vezi s ishodom trudnoće.

Ključne riječi: IL-2, reumatoidni faktor, ponovljeni spontani pobačaj

Pristiglo: 27. studenog 2007.                                                                                                                    Prihvaćeno: 27. ožujka 2008.

 

 

Uvod

Ponovljeni spontani pobačaji (PSP) još uvijek predstavljaju učestali reproduktivan problem širom svijeta; tri ili više pobačaja zahvaća 1-2% žena reproduktivne dobi (1). Unatoč nekoliko utvrđenih etioloških čimbenika, uzrok PSP se ne može odrediti u gotovo 50% slučajeva. Pretpostavlja se da određeni broj tih ponovljenih gubitaka trudnoće može biti povezan s imunosnim uzrocima (2). Odgovor T-pomoćničkih stanica (Th) nakon aktivacije je funkcionalno obilježen citokinima koje te stanice proizvode. Stanice Th1 uglavnom luče interleukin (IL)-2, interferon (IFN)-γ i čimbenik nekroze tumora (TNF)-β (3). IL-2 se izrazito ističe među citokinima koji su osobito povezani s preživljenjem zametka. Chaouat i sur. (1990.) su pokazali da primjena IL-2 kod gravidnih miševa uzrokuje pobačaj (4). Reumatoidni faktori (RF) su antitijela koja prepoznaju udio Fc molekula IgG kao svoje vlastite antigene. RF mogu biti bilo kojeg izotipa imunoglobulina (IgM, IgG, IgE). Većina klinički izmjerenih RF su razreda IgM (5). Među zdravom populacijom učestalost pojedinaca pozitivnih na RF iznosi od 1,3 do 4% u bijelaca pa do 30% u nekim plemenima sjevernoameričkih indijanaca (6). Čini se da mala podskupina B-stanica koje izražavaju CD5, a poznate su kao B-1a-stanice, stvaraju RF (7). Mnoge su studije razjasnile temeljnu ulogu T-stanica u promjeni razreda u kojoj stvaranje citokina ima važan učinak na vrstu imunoglobulina koju stvaraju B-stanice (8).

Cilj ove studije bio je usporediti koncentracije IL-2 (citokina Th1) i RF u serumu žena s anamnezom PSP s koncentracijama u kontrolnoj skupini.

 

Materijali i metode

Ispitanice

Ovo je istraživanje parova provedeno u dvije različite skupine upućene u Istraživački i klinički centar za neplodnost Yazd. Prva se skupina sastojala od 56 žena s anamnezom tri ili više PSP, a druga je obuhvaćala 63 zdrave žene bez pobačaja u anamnezi te s barem jednom uspješnom trudnoćom. Uzorci pobačenog zametka imali su normalan kariotip, negativan nalaz za TORCH, bili su bez anatomskih ili endokrinih problema uz odsutnost antifosfolipidnih antitijela razreda IgM i IgG, antikardiolipinskih antitijela razreda IgM, IgG i IgA te antinuklearnih antitijela razreda IgM i IgG. Sve su slučajeve činili primarni PSP. Dobiveni su demografski podatci, o dobi, broju pobačaja i gestacijskoj dobi posljednjeg pobačaja za žene iz skupine s PSP, te o broju trudnoća za žene u kontrolnoj skupini. Lokalno institucionalno prosudbeno tijelo je odobrilo eksperimentalne postupke, a od svake je sudionice dobiven potpisani informirani pristanak.

 

Metode

Prikupljeni su uzorci krvi (5 mL) i serumi su ispitani na prisutnost IL-2 prema uputama proizvođača (Bender Medsystem GmbH, Beč, Austrija). Ukratko, postupak se sastojao od slijedećih koraka: 1) 100 µL svakog uzorka u duplikatu je dodano u jažicu; također, ista je količina razrjeđivača uzorka stavljena u jažice za slijepu probu; 2) 50 µL razrijeđenog Biotin-konjugata je dodano u sve jažice i inkubirano na sobnoj temperaturi tijekom 2 sata; 3) mikrotrake s jažicama isprane su četiri puta i 100 µL razrijeđenog Streptavidin-HRP je dodano svim jažicama; 4) uzorci su najprije inkubirani na sobnoj temperaturi tijekom 1 sata i zatim isprani 4 puta; 5) konačno je otopina TMB-supstrata dodana svim jažicama i inkubirana na sobnoj temperaturi 15 minuta; 6) enzimska je reakcija zaustavljena pipetiranjem 100 µL otopine za zaustavljanje reakcije u jažice i apsorbancija svake mikrojažice je očitana na 450 i 620 nm, kao referentnim valnim dužinama.

Osjetljivost analize IL-2 iznosila je 3,5 pg/mL. Ukupan koeficijent varijacije iz dana u dan iznosio je 5,2%, a u seriji 8%. Prisutnost RF (antihumanog imunoglobulina) određena je testom lateks-aglutinacije (Bionic, Iran) prema uputama proizvođača, a prisutnost aglutinacije je smatrana pozitivnom. Pozitivni su uzorci ispitani u različitim razrjeđenjima do titra 1/64.

 

Statistička analiza

Statistička je analiza provedena pomoću programskog paketa SPSS V 12.0 (SPSS Inc, Chicago, IL). Hi-kvadrat test je primijenjen za usporedbu pojavnosti RF među skupinama.

 

Rezultati

Prosječna dob žena u prvoj skupini bila je 28 ± 4 godine (raspon 21-42), a u drugoj skupini 27 ± 5 godina (raspon 18-37). Među ženama iz dviju skupina nije bilo značajne razlike u dobi. Broj gubitaka trudnoće je varirao od 3 do 10 (4 ± 1). Prosječna gestacijska dob kod posljednjeg pobačaja bila je u prvoj skupini 11,45 ± 2,85 tjedana. Dvije od 56 žena u skupini I imale su IL-2 u serumu (koncentracije 35 pg/mL i 10 pg/mL). IL-2 nije nađen ni kod jedne žene iz skupine II. Također, 53,5% žena u skupini I i 6% žena u skupini II bilo je pozitivno na RF u različitim titrovima (Slika 1.). Postojale su statistički značajne razlike između skupina I i II za RF (P = 0,002).

Slika 1. Učestalost titra RF u skupini s PSP (bolesnice) i kontrolnoj skupini.

 

Rasprava

Prošlih je godina postignut određen napredak u boljem razumijevanju ponovljenog pobačaja te ponudi dijagnostičkih pomagala i obradi. PSP je još uvijek najčća komplikacija tijekom trudnoće (9). Stvaranje citokina i razdioba imunih stanica tijekom trudnoće može pružiti važne informacije za predviđanje ishoda trudnoće, npr. termina ili gubitka trudnoće (10). U ovoj smo studiji određivali citokin IL-2 u žena s anamnezom PSP te u žena reproduktivno podudarne dobi bez pobačaja. Iako nismo mogli otkriti IL-2 u serumima kontrolne skupine, o povišenim koncentracijama IL-2 u normalnoj trudnoći već je izvještavano (11). Takva razlika u rezultatima može biti povezana s dobi ispitanica, kompletima reagencija za mjerenje, rasom i društveno-ekonomskim statusom. Samo su dvije od 56 žena s anamnezom PSP bile pozitivne na IL-2 u serumu. Neke studije ukazuju da limfociti iz periferne krvi žena s PSP, u usporedbi sa ženama s uspješnom trudnoćom, luče povišene koncentracije određenih citokina Th1 kao, primjerice, IL-2 nakon stimulacije mitogenima ili antigenima (12,13). Stvaranje citokina Th1 je, međutim, smanjeno tijekom trudnoće (14). Naši rezultati nisu pokazali sličan obrazac stvaranja IL-2 u ispitivanim uzorcima. Kao dio istraživanja također smo mjerili RF u dvjema skupinama. Rezultati su pokazali da je 53,5% žena s anamnezom PSP bilo pozitivno na RF čija je koncentracija bila značajno viša nego u kontrolnih ispitanica. U nekim je studijama navedeno da određena autoantitijela nepovoljno utječu na tijek trudnoće i fetalnog rasta (15) no jedini članak koji spominje porast RF tijekom trudnoće jest rad Ailusa i sur. (16). U istraživanju autora Iijime i sur. 8,3% žena s anamnezom PSP koje su bile uključene u studiju imalo je RF u serumu (17). RF su autoantitijela povezana s reumatoidnim artritisom koja je moguće otkriti u normalnih pojedinaca, no samo prolazno. Nedavno je dokazano da B-stanice proizvode RF samo kad su aktivirane dvama signalima, tj. jednim zbog uključenosti receptora B-stanica, a drugim zbog prepoznavanja patogeno povezanog molekularnog obrasca preko Toll-like receptora. Stoga ta autoantitijela povezuju prirođeni i stečeni imuni odgovor (18). Poznate su i uloge nekih infektivnih agenasa u ponovljenim pobačajima. Moguća je, međutim, i određena povezanost između mikrobijalnog pobačaja i stvaranja RF.

 

Zaključak

Rezultati koji su postignuti u ovom istraživanju pokazali su da koncentracija IL-2 u serumu nije utjecala na ishod trudnoće. Ipak, prevalencija RF je bila veća među bolesnicama s PSP nego u normalnih žena bez pobačaja. Zbog toga se preporuča istraživanje uloge RF u odnosu na ishod trudnoće.

 

Zahvala

Sveučilište medicinskih znanosti „Shahid Sadoughi University“ pružilo je financijsku potporu ovom istraživanju, a autori su zahvalni za tehničku pomoć g. Hosseinu Fazliju.

 

Literatura

1.     Regan L. Overview of recurrent miscarriage. Gynaecology Forum 1998;3:3-7.

2.     Laird SM, Tuckerman EM, Cork BA, Linjawi S, Blakemore AI, Li TC. A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage. Hum Reprod Update 2003;9(2):163-74.

3.     Mosmann TR, Sad S. The expanding universe of T-cell subsets: Th1, Th2 and more. Immunol Today 1996;3:138-46.

4.     Chaouat G, Menu M, Clark DA, Dy M, Minkowski M, Wegmann TG. Control of fetal survival in CBAč×čDBA/2 mice by lymphokine therapy. J Reprod Fertil 1990;9(2):447-57.

5.     Nielen MMJ, Van Schaardenburg D, Reesink HW, Van de Stadt RJ, Van der Hors-Bruinsma IE, De Koning MH, et al. Specific autoantibodies precede the symptoms of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2004;50:380-6.

6.     Jansen AL, van der Horst-Bruinsma I, van Schaardenburg D, van de Stadt RJ, de Koning MH, Dijkmans BA. Rheumatoid factor and antibodies to cyclic citrullinated peptide differentiate rheumatoid arthritis from undifferentiated polyarthritis in patients with early arthritis. J Rheumatol 2002;29(10):2034-40.

7.     Mantovani L, Wilder RL, Casali P. Human rheumatoid B-1a (CD5+ B) cells make somatically hypermutated high affinity IgM rheumatoid factors. J Immunol 1993;151(1):473-88.

8.     Stavnezer J. Immunoglobulin class switching. Curr Opin Immunol 1996;8:199-205.

9.     Clifford K, Rai R, Watson H, Regan L. An informative protocol for the investigation of recurrent miscarriage: preliminary experience of 500 consecutive cases. Hum Reprod 1994;9:1328-32.

10.   Wegmann TG, Lin H, Guilbert L, Mosmann TR. Bidirectional cytokine interactions in the materno-fetal relatioship: successful allopregnancy is a Th2 phenomenon. Immunol Today 1993;14:353-355.

11.   Favier R, Edelman P, Mary JY, Sadoul G, Douay L. Presence of elevated serum interleukin-2 levels in pregnant women. N Engl J Med 1990;322(4):270.

12.   Hossein H, Mahroo M, Abbas A, Firouzeh A, Nadia H. Cytokine production by peripheral blood mononuclear cells in recurrent miscarriage. Cytokine 2004;28(2):83-6.

13.   Raghupathy R, Makhseed M, Azizieh F, Omu A, Gupta M, Farhat R. Cytokine production by maternal lymphocytes during normal human pregnancy and in unexplained recurrent spontaneous abortion. Hum Reprod 2000:15(3):713-8.

14.   Rezaei A, Dabbagh A. T-helper (1) cytokines increase during early pregnancy in women with a history of recurrent spontaneous abortion. Med Sci Monit 2002:8(8):607-10.

15.   Kotlan B, Padanyi A, Batorfi J, Fulop V, Szigetvari I, Rajczy K, et al. Alloimmune and autoimmune background in recurrent pregnancy loss - successful immunotherapy by intravenous immunoglobulin. Am J Reprod Immunol 2006;55(5):331-40.

16.   Ailus KT. A follow-up study of immunoglobulin levels and autoantibodies in an unselected pregnant population. Am J Reprod Immunol 1994;31(4):189-96.

17.   Iijima T, Tada H, Hidaka Y, Mitsuda N, Murata Y, Amino N. Effects of autoantibodies on the course of pregnancy and fetal growth. Obstet Gynecol 1997;90(3):364-9.

18.   Chaiamnuay S, Bridges SL Jr. The role of B cells and autoantibodies in rheumatoid arthritis: Pathophysiology 2005;12(3):203-16.

Izvorni znanstveni članak

 

Márk Plander1,2, Antal Salamon3, Erzsébet Toldy1,4, Gyula Kiss3, Gábor L. Kovács4,5. Stanično imunosni odgovor u Dupuytrenovoj bolesti. Biochemia Medica 2008;18(2):193-200.

1Središnji laboratorij, Sveučilišna bolnica „Markusovszky”, Szombathely, Mađarska

2Klinika za hematologiju, Sveučilišna bolnica „Markusovszky”, Szombathely, Mađarska

3Klinika za traumatologiju i rekonstruktivnu kirurgiju ruku, Sveučilišna bolnica „Markusovszky”, Szombathely, Mađarska

4Institut za dijagnostiku i management, Sveučilište u Pečuhu, Pečuh, Mađarska

5Institut za laboratorijsku medicinu, Sveučilište u Pečuhu, Pečuh, Mađarska

 

*Adreasa za dopisivanje: gabor [dot] l [dot] kovacs [at] aok [dot] pte [dot] hu

 

Sažetak

Uvod: Patogeneza Dupuytrenove bolesti je nejasna, no mogu se pretpostaviti upalni mehanizmi u njenoj pozadini.

Materijali i metode: Mjerili smo udjele različitih podvrsta monocita i limfocita u perifernoj krvi prema stadiju bolesti kod 39 bolesnika oboljelih od Dupuytrenove bolesti. Rezultate smo usporedili s rezultatima 29 zdravih kontrolnih ispitanika iz iste dobne skupine. Mjerenja su napravljena pomoću protočne citometrije.

Rezultati: U aktivnom su stadiju bolesnici imali bitno povišen udio monocita, NK-stanica sličnih T-limfocitima, dok je udio B-limfocita bio značajno snižen, uključujući CD5+ B-limfocite. Udjeli CD4+, CD8+ T-limfocita i B-limfocita nisu se znatno promijenili. U naprednom su stadiju bolesti udjeli monocita i B-limfocita ostali konstantnima, no značajno su se snizili udjeli T-limfocita. U četiri slučaja među bolesnicima koji boluju od Dupuytrenove bolesti pojavile su se limfoidne neoplazme zrelih B- ili T-limfocita.

Zaključci: Naši rezultati podupiru prijašnja mišljenja da su limfociti povezani s patogenezom Dupuytrenove bolesti te pojačavaju ulogu monocita, NK-stanica sličnih T-limfocitima i promjenu imunosnog odgovora između stadija bolesti.

Ključne riječi: Dupuytrenova bolest, aktivni i uznapredovali stadij, monociti, NK T-limfociti

Pristiglo: 27. prosinca 2007.                                                                                                                                    Prihvaćeno: 18. travnja 2008.

 

 

Uvod

Dupuytrenova bolest (engl. Dupuytren’s disease) kronični je poremećaj, koji karakterizira razvijanje kvržica i čvorića na dlanu šake i/ili tabanu stopala. Te patološke promjene nastaju zbog fibroznih procesa, no točan mehanizam nastanka skvrčenosti još je nejasan. Chiu i McFarlane (1) opisali su klinički i patološki tri stadija bolesti: rani, aktivni i uznapredovali stadij.

Prijašnja su izvješća upućivala da bi upalni mehanizmi mogli biti povezani s patogenezom Dupuytrenove bolesti. Mnogi su autori izvijestili o kvržicama koje su sadržavale upalne stanice; uglavnom limfocite i makrofage (2). Također je biopsijom uočen povećan broj aktiviranih (HLA-DR+) T-limfocita u tkivima (3). Pronađen je i povišen udio aktiviranih T-limfocita u perifernoj krvi bolesnika s Dupuytrenovom bolesti (4). Potvrđena je i uloga citokina koje stvaraju T-limfociti. Transformacijski faktor rasta-β (engl. Transforming Growth Factor-β, TGFβ) izaziva transformaciju fibroblasta u miofibroblaste koji su odgovorni za skvrčavanje aponeuroze (2). Pronađena je bitna veza između Dupuytrenove bolesti, HLA-DR3 te autoantitijela i kolagena tipa I-IV (5).

Naš je cilj bio istražiti ulogu upalnih mehanizama u patogenezi Dupuytrenove bolesti i produbiti saznanja o raspodjeli podvrsta monocita i limfocita sukladno stadiju Dupuytrenove bolesti.

 

Materijali i metode

Bolesnici

U ovo je istraživanje bilo uključeno ukupno 39 odraslih muških bolesnika s Dupuyternovom bolesti raspona godina od 45 do 69 (57 ± 12) i skupina od 29 zdravih muških dobrovoljaca odgovarajuće dobne skupine. Iz istraživanja su isključeni oni bolesnici koji su imali bilo kakvo upalno oboljenje ili neku drugu bolest unutarnjih organa, kao npr. autoimune bolesti, šećernu bolest, cirozu jetre, epilepsiju, poznate zloćudne bolesti. Bolesnici su bili klasificirani prema Chiu i McFarlanovoj kliničkoj i patološkoj podjeli na rani, aktivni i uznapredovali stadiji (1). 23 bolesnika iz skupine s Dupuytrenovom bolesti bili su u aktivnom stadiju (stadij 2) s kvržičastim zadebljanjem na dlanu i zgrčenosti zgloba. Šesnaest je bolesnika bilo u uznapredovalom stadiju (stadij 3) s uznapredovalom zgrčenosti zgloba. Nije primijećeno da je i jedan bolesnik u ranom stadiju imao kvržicu isključivo na dlanu (stadij 1). U 36 slučajeva radilo se samo o jednoj ruci. Kod tri su bolesnika obje ruke bile zahvaćene. Lezije (oštećenja) su se uglavnom nalazile u korijenu četvrtog i petog prsta. Bolesnici su odabrani iz traumatološke ambulante bolnice Markusovszky u Szombathelyu. Uzorkovanje je trajalo 2 godine, do 2007. Istraživanje je provedeno sukladno Helsinškoj deklaraciji, a za protokol istraživanja dobiveno je odobrenje lokalnog etičkog odbora. Svi su bolesnici potpisali informirani pristanak za sudjelovanje u istraživanju.

Imunofenotipizacija

Uzorci periferne krvi stavljeni su u EDTA epruvete i obojeni u roku od 24 sata. Do početka bojenja uzorci su bili čuvani na temperaturi +4 °C. Dnevno je bila napravljena kalibracije fluorescentnih mjerenja pri čemu su se koristile standardizirane površinski fluorescentno označene mikrosfere (FITC/PE). Standardizacija stanične imunofluorescencije zasniva se na kontrolama različitih izotipova. Stanice su prvo prebrojane i nakon toga razrijeđene u PBS puferu na koncentraciju od otprilike 107/mL. Monoklonska antitijela konjugirana s fluorescentnim izotiocijanatom (FITC) ili fikoeritrinom (PE) dodana su u preporučenom volumenu prema uputi proizvođača. Specifičnost i kombinacije primjenjenih monoklonalnih antitijela bile su sljedeće: CD45/CD14, IgG1/IgG2 – kontrole različitih izotipova; CD3/CD19, CD3/CD16+56, CD3/CD4, CD3/CD8, CD5/CD20, CD3/HLA-DR, Kappa LC/CD19, Lambda LC/CD19. Svi su reagensi bili od proizvođača BD Bioscience (San Jose, CA, USA). 100 µL otopine razrijeđenih stanica dodana je prethodno pipetiranim antitijelima i stavljena na 15 minuta u inkubaciju na tamno mjesto na -20 °C. Zatim su eritrociti lizirani na sobnoj temperaturi. Rezultati fluorescencije dobiveni su FACSscan protočnom citometrijom, a analizirani su CellQuestovim programom (BD Bioscience). Od svakog je uzorka prikupljeno 10.000 podataka. Primjeri korištene strategije protočne citometrije prikazani su na Slici 1. Kako bi se analizirale limfocitne subpopulacije, limfociti (prikazani crnom bojom) su razvrstani na osnovi prednjeg (FSC) i bočnog (SSC) raspršenja zrake (Slika 1A). Citotoksični T-limfociti razlikovali su se prema koekspresiji CD3 i CD8 antigena (Slika 1B), dok su se pomoćnički T-limfociti razlikovali prema koekspresiji CD3 i CD4 antigena (slika 1C). NK-stanice (eng. natural killer cells, NK) izražavaju CD16 i CD56 antigene za razliku od CD3, NK T-limfociti CD3 i CD56 dvostruko su pozitivni (slika 1D). B-limfociti nose CD20 antigen i djelomično CD5 antigen (slika 1E).

 

 

Slika 1. Postupak odabira stanica. Limfociti su razvrstani na osnovi prednjeg (FSC) i bočnog (SSC) raspršenja zrake (Slika 1A). Citotoksični T-limfociti CD3 i CD8 dvostruko su pozitivni (gornji desni kvadrant, Slika 1B). Pomoćnički T-limfociti izražavaju zajedno CD3 i CD4 (gornji desni kvadrant, Slika 1C). NK-stanice nose antigene CD56 i CD16 (gornji lijevi kvadrant, Slika 1D), NK T-limfociti su pozitivni na CD3 i CD56 antigene (gornji desni kvadrant, Slika 1D). B-limfociti izražavaju CD20 i B1 populaciju, dakle antigen CD5 (gornji desni kvadrant, Slika 1E).

 

Statistička analiza

Rezultati su izraženi u postotku od ukupnog broja leukocita i u izračunatom apsolutnom broju stanica. Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna pogreška (engl. standard error, SE). Za statističku je analizu korištena jednosmjerna analiza varijance (ANOVA) nakon koje je uslijedio post hoc parni test usporedbe (LSD). Razina vjerojatnosti od < 5 % prihvaćena je kao značajna. Za sve je statističke analize korišten programski paket Statistica za Windows, s intervalom pouzdanosti od 95%.

 

Rezultati

Kod 4 bolesnika iz skupine s Dupuytrenovom bolesti su restrikcijom lakog lanca imunoglobulina i/ili patološkim imunofenotipom dokazane su zrele limfoidne neoplazme u tihom obliku, kao npr. kronična limfocitna leukemija B-stanica (engl. B-cell chronic lymphocytic leukaemia, CLL) i leukemija granuliranih T-limfocita (T-LGL), dok kod ispitanika iz zdrave skupine nije pronađena takva bolest. Limfomi su se nalazili u ranom stadiju bez ikakvih kliničkih znakova.

Ovi su hematološki slučajevi isključeni iz daljnje analize. Statistička razlika među ispitanika kontrolne skupine (N = 29), bolesnika koji boluju od Dupuytrenove bolesti stadija 2 (N = 21) i stadija 3 (N = 14) prikazana je u Tablicama 1 i 2.

 

Tablica 1. Usporedba broja monocita, B-limfocita i NK-stanica između kontrolne skupine i bolesnika s Dupuytrenovom bolesti.

 

Tablica 2. Usporedba broja T-limfocita između kontrolne skupine i bolesnika s Dupuytrenovom bolesti.

 

U oba stadija Dupuytrenove bolesti udio monocita znatno se povisio u usporedbi s kontrolnom skupinom (5,75 ± 0,21 prema 7,49 ± 0,35, P = 0,002 za skupinu s Dupuytrenovom bolesti, i 8,08 ± 0,78, P < 0,001 za kontrolnu skupinu) i ostao gotovo nepromijenjen u naprednom stadiju (Tablica 1). Udio NK T-limfocita također je znatno porasao u stadiju 2 (0,66 ± 0,09 prema 1,07 ± 0,16, P = 0,021), i zatim se snizio u stadiju 3 (0,47 ± 0,1 prema 1,06 ± 0,16, P = 0,012) (Tablica 2.). Tablica 1 prikazuje znatno sniženje udjela B-limfocita (2,88 ± 0,16 prema 2,13 ± 0,21, P = 0,013) uključujući i B1 (koekspresiju CD 20+5+) populaciju (1,44 ± 0,14 prema 0,57 ± 0,09, P = 0,009) kod bolesnika s Dupuytrenovom bolesti u usporedbi sa kontrolnom skupinom. Udio B-limfocita nije se promijenio tijekom bolesti. Nije primijećeno statistički značajno povišenje udjela T-limfocita uključujući populacije pomoćničkih (CD4+) i citotoksičnih (CD8+) između bolesnika s Dupuytrenovom bolesti stadija 2 i zdravih kontrolnih ispitanika (Tablica 2). Udio CD4+/CD8+ T-limfocita snizio se u aktivnom stadiju (Tablica 2). Međutim postotak čitave populacije T-limfocita i populacije pomoćničkih T-limfocita razlikovao se značajno između stadija 2 i 3 kod bolesnika s Dupuytrenovom bolesti (19,02 ± 0,82 prema 15,9 ± 1,38, P = 0,043 za stadij 2 i 13,04 ± 0,85 prema 10,27 ± 1,09, P = 0,023, za stadij 3) (Tablica 2). Udjeli citotoksičnih i aktiviranih (HLA-DR+) T-limfocita i NK-stanica slijedili su promjene u populaciji pomoćničkih T-limfocita, i iako se niti jedan od tih udjela nije znatno promijenio, povećanje HLA-DR+T-limfocita pokazuje jaku tendenciju (P = 0,07) među bolesnicima oba stadija Dupuytrenove bolesti (Tablica 1 i 2).

 

Rasprava

Promatrali smo različite i karakteristične promjene u broju limfocita i monocita u perifernoj krvi sukladno kliničkim stadijima Dupuytrenove bolesti. U aktivnom se stadiju udio monocita i NK T-limfocita značajno povisio. Slično se povisio i udio CD4+, CD8+, aktiviranih T-limfocita i NK-stanica, no te promjene nisu bile značajne. Ovi nalazi potvrđuju prethodna mišljenja da su T-limfociti povezani s patogenezom Dupuytrenove bolesti (3,4). Ovdje nismo istraživali monocite, NK T-limfocite niti stanično imunosni odgovor sukladno stadiju Dupuytrenove bolesti.

Prikazano je i značajno smanjenje udjela B-limfocita, uključujući tzv. B1-stanice (CD5+) što je djelomično povezano s rezultatima Gudmundssona i sur. (4). Oni su izvijestili o snižavanju udjela CD5+ B-limfocita. Naša prethodna zapažanja o prisustvu antinuklearnih antitijela odnose se također na ulogu B-limfocita u Dupuytrenovoj bolesti (6). Fibrozne bolesti, npr. plućna i jetrena fibroza, sistemska skleroza povezane su s protuupalnim T pomoćničkim 2 (TH2) staničnim odgovorom (7-10). TGFβ je jedan od najvažnijih citokina od TH2 posrednim imunosnim odgovorom. Značaj TGFβ u Dupuytrenovoj bolesti dokazali su mnogi autori (10-12). Makrofagi su jedan od glavnih izvora TGFβ i za TGFβ takvog porijekla vjeruje se da je profibrozan (13). Povišen broj monocita u Dupuytrenovoj bolesti može osigurati trajan dotok energije makrofagima u zahvaćenom tkivu.

NK T-limfociti mogu izlučiti tipične TH2 citokine, npr. IL-13 (14). Aktivacija TGFβ1 ovisi o metaloproteinazi matriksa 9 (MMP-9), pospješenoj s IL-13 koji cijepa peptide povezane s latencijom (15). U eksperimentalnim modelima autoimunih bolesti, NK T-limfociti su štitili od šećerne bolesti ili eksperimentalnog autoimunog encefalomijelitisa premještanjem ravnoteže s TH1 prema TH2 imunom odgovoru (16,17). Bolesnici koji boluju od drugih fibroznih bolesti (npr. sistemska skleroza) pokazuju promijenjenu homeostazu B-limfocita sličnu našim rezultatima (18).

U uznapredovalom su se stadiju udjeli CD4+ T-limfocita i NK T-limfocita snizili značajno, dok su se udjeli CD8+ i HLA-DR+ T-limfocita snizili, ali ne značajno. Udjeli monocita i B-limfocita ostali su konstantni u usporedbi s onima u aktivom stadiju. Tendencija snižavanja udjela T-limfocita navodi na razmatranje da je ona dio protuupalne reakcije koja može biti krajnji rezultat TH2 posredovanog imunosnog odgovora. Uzimajući sve u obzir, naši se podaci mogu odnositi na TH2 posredovani imunosni odgovor povezan s masivnom fibrozom u patogenezi Dupuytrenove bolesti. Međutim treba naglasiti da do sada nismo direktno istražili citokinski profil T-limfocita kod Dupuytrenove bolesti. Česta pojava zrelih limfoidnih neoplazmi u tihom obliku među našim bolesnicima s Dupuytrenovom bolesti može podržati hipotezu o autoimunoj pozadini Dupuytrenove bolesti, zato što različite autoimune bolesti, npr. autoimuna hemolitička anemija često kompliciraju CLL. Naravno da je potrebno napraviti velika istraživanja kako bi se opravdala veza između Dupuytrenove bolesti i hematoloških zloćudnih bolesti.

Zaključujemo da su monociti, T-limfociti (a posebno NK T-limfociti) i B-limfociti vjerojatno povezani s patogenezom Dupuytrenove bolesti, te da promijene u njihovom broju mogu ukazivati na upalni mehanizam u tijeku. Međutim, potrebno je dalje istražiti T-limfocite koji prodiru u aponeurozu, raspodijelu i profil citokina u T-limfocitima u perifernoj krvi kod bolesnika s Dupuytrenovom bolesti u ranom stadiju.

 

Zahvale

Uz dužno poštovanje zahvaljujemo Riti Jáger M.D. iz Mađarske banke krvi za kontrolne uzorke krvi i gđi J. Gál te gđi. M. Horváth za tehničku pomoć.

 

Literatura

1.    Chiu HF, McFarlane RM. Pathogenesis of Dupuytren’s contracture: A correlative clinical-pathological study. J Hand Surg 1978;3:1-10.

2.    Thurston AJ. Dupuytren’s disease. J Bone Joint Surg 2003;85:469-77.

3.    Baird KS, Alwan HW, Crossan JF, Wojciak B. T-cell mediated response in Dupuytren’s disease. Lancet 1993;341:1622-3.

4.    Gudmundsson KG, Arngrimsson R, Arinbjarnarson S, Olafsson A, Jonsson T. T- and B-lymphocyte subsets in patients with Dupuytren’s disease. J Hand Surg 1998; 23:724-7.

5.    Neumüller J, Menzel J, Millesi H. Prevalence of HLA-DR3 and autoantibodies to connective tissue components in Dupuytren’s contracture. Clin Immunol Immunpathol 1994;71:142-8.

6.    Salamon A, Józsa L, Toldy E. The role of different factors in the pathogenesis of Dupuytren’s disease. Proceedings of the 8th Congress of the IFSSH. 2001;363-9.

7.    Dlugovitzky D, Bay ML, Rateni L, Urízar L, Rondelli CF, Largacha C, et al. In vitro synthesis of interferon-gamma, interleukin-4, transforming growth factor-beta and interleukin-1 beta by peripheral blood mononuclear cells from tuberculosis patients: relationship with the severity of pulmonary involvement. Scand J Immunol 1999;49:210-7.

8.    Wallace WA, Ramage EA, Lamb D, Howie SE. A type 2 (Th2-like) pattern of immune response predominates in the pulmonary interstitium of patients with cryptogenic fibrosing alveolitis (CFA). Clin Exp Immunol 1995;101:436-41.

9.    Vaillant B, Chiaramonte MG, Cheever AW, Soloway PD, Wynn TA. Regulation of hepatic fibrosis and extracellular matrix genes by the TH response: new insight into the role of tissue inhibitors of matrix metalloproteinases. J Immunol 2001;157:7017-26.

10.  Hasegawa M, Fujimoto M, Kikuchi K, Takehara K. Elevated serum levels of interleukin 4 (IL-4), IL-10 and IL-13 in patients with systemic sclerosis. J Rheumatol 1997;24:328-32.

11.  Bayat A, Stanley JK, Watson JS, Ferguson MW, Ollier WE. Genetic susceptibility to Dupuytren’s disease: transforming growth factor beta receptor (TGFbetaR) gene polymorphisms and Dupuytren’s disease. Br J Plast Surg 2003;56:328-33.

12.  Kloen P, Jennings CL, Gebhardt MC, Springfield DS, Mankin HJ. Transforming growth factor-beta: possible roles in Dupuytren’s contracture. J Hand Surg 1995;20:101-08.

13.  Wynn AT. Fibrotic disease and the TH1/TH2 paradigm. Nat Rev Immunol 2004; 4:583-94.

14.  Godfrey DI, Kronenberg M. Going both ways: immune regulation via CD1d-dependent NKT cells. J Clin Invest 2004;114:1379-88.

15.  Lee CG, Homer RJ, Zhu Z, Lanone S, Wang X, Koteliansky V, et al. Interleukin-13 induces tissue fibrosis by selectively stimulating and activating the transforming growth factor β1. J Exp Med 2001;194:809-21.

16.  Hong S, Wilson MT, Serizawa I, Wu L, Singh N, Naidenko OV, et al. Natural killer T-cell ligand alpha-galactosylceramide prevents autoimmune diabetes in non-obese diabetic mice. Nat Med 2001;7:1052-6.

17.  Jahng AW, Maricic I, Pedersen B, Burdin N, Naidenko O, Kronenberg M, et al. Activation of natural killer T cells potentiates or prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Exp Med 2001;194:1789-99.

18.  Fujimoto M, Sato S. B lymphocytes and systemic sclerosis. Curr Opin Rheumatol 2005;17:746-51.

Prikaz slučaja

 

Ana-Maria Šimundić1*, Marijana Miler1, Nora Nikolac1, Elizabeta Topić1, Dubravka Čaržavec2, Branka Milanović1, Vladimir Stančić2. Bisalbuminemija kod bolesnika iz Hrvatske sa sarkoidozom. Biochemia Medica 2009;19(1):95-100.
 
1Klinički zavod za kemiju, KB „Sestre milosrdnice“, Zagreb
2Klinika za unutarnje bolesti, KB „Sestre milosrdnice“, Zagreb
 
Corresponding author*:  am [dot] simundic [at] gmail [dot] com
 
Sažetak
 
Uvod: Urođena bisalbuminemija je rijetka bolest, najčešće prisutna u benignom obliku, dosad opisivana u nekoliko patoloških stanja. Već su opisane dvije genskevarijante kod dvije hrvatske obitelji. U ovom radu izvještavamo o novom slučaju bisalbuminemije kod bolesnika iz Hrvatske sa sarkoidozom.
Metode: Bolesnik je, od strane liječnika opće prakse, upućen u KB „Sestre milosrdnice“ na dijagnostički pregled pod sumnjom nasarkoidozu. Napravljena je kapilarna elektroforeza proteina u serumu s automatiziranim uređajem za kapilarnu elektroforezu.
Rezultati: Temeljem laboratorijskih i patoloških nalaza potvrđena je sarkoidoza. Elektroforezom u serumu otkrivene su dvije različite frakcije albumina. Dodatna frakcija albumina bila je sporo migrirajuća. Ta sporo migrirajuća frakcija činila je 0,48, a normalna 0,51 ukupnog albumina. Sestra bolesnika također je imala bisalbuminemiju.
Zaključak: Ovo je novi slučaj urođene bisalbuminemije kod bolesnika sa sarkoidozom. Ima li bisalbuminemija ikakve veze sa sarkoidozom, potrebno je tek razjasniti. Svaki slučaj pojave urođenih ili stečenih frakcija albumina trebao bi probuditi pažnju medicinskih biokemičara i kliničara, jer bi mogao pružiti uvid u evoluciju proteina kao i u fizičke, kemijske i molekularne karakteristike albumina.
Ključne riječi: bisalbuminemija; kapilarna zonska elektroforeza; genetička heterogenost; sarkoidoza; albumin u serumu
 
Pristiglo: 18. studenog 2008.                                                                                                  Prihvaćeno: 15. prosinca 2008.
 
Uvod
 
Bisalbuminemija predstavlja rijedak poremećaj karakteriziran pojavom dviju vrpci u albuminskoj frakciji prilikom elektroforeze proteina u serumu. (1). Taj poremećaj albumina može biti urođen ili stečen. Albumin u serumu nije glikoliziran, negativnog je naboja i čini najveći dio plazmatskih proteina. Minchiotti i sur. nedavno su iscrpno izvijestili o mutacijama i polimorfizmima na genu za albumin (2). Dosad je poznato 77 mutacija, od kojih 65 rezultira bisalbuminemijom u serumu, a 12 analbuminemijom (stanje koncentracije albumina u serumu niže od 1 g/L). Urođena bisalbuminemija je autosomno dominantno stanje (3) koje se pojavljuje s učestalošću od 1:1.000 do 1:10.000 (4). Stečeni oblici bisalbuminemije opisani su u bolesnika koji su primili visoke doze penicilina (5,6) te u bolesnika s ascitesom i pseudicistom gušterače (7).
Iako je u većini slučajeva benigna, bisalbuminemija se opisuje u nekoliko patoloških stanja, kao što su nefrotički sindrom (8,9), kronična bolest bubrega (10), Alzheimerova bolest (11) i benigna monoklonska gamapatija (12). Dvije genske varijante već su opisane kod dvije hrvatske obitelji: sporo migrirajući albumin Zagreb i brzo migrirajući albumin Krapina (13, 14).
U ovom članku izvještavamo o bisalbuminemiji kod četrdesetšestogodišnjaka iz Hrvatske, koji boluje od sarkoidoze. Koliko nam je poznato bisalbuminemija još nije opisana u bolesnika s sarkoidozom.
 
Materijali i metode
Prikaz slučaja
Četrdesetšestogodišnjak iz Hrvatske (M.L.), nepušač, upućen je od strane liječnika opće prakse na Kliniku za unutarnje bolesti Kliničke bolnice “Sestre milosrdnice” (Zagreb, Hrvatska) na dijagnostički pregled sa simptomima erytheme nodosum donjih ekstremiteta i bilateralne hilarne limfadenopatije. Bolesnik nije imao temperaturu, nijekao je umor i bilo kakve probleme u dišnom sustavu. Njegova je anamneza uključivala hiperlipidemiju u posljednjih 15 godina i povećano konzumiranje alkohola (1 litra vina dnevno) tijekom posljednje dvije godine. Bolesnik je, prema svojim riječima, tijekom prethodnog tjedna 3 dana preventivno uzimao azitromicin zbog moguće bolesti prenosive ubodom kukca. Tijekom dva tjedna prije dolaska u našu Kliniku, bolesnik je bio na pretragama u drugim ustanovama i dobiveni rezultati bili su sljedeći: scintigrafija kostiju donjeg dijela noge bila je uredna, rendgen donjeg dijela noge pokazao je osteoidni osteom u lijevoj potkoljenici, rendgen prsa otkrio je bilateralnu hilarnu limfadenopatiju, urinokultura je bila negativna, ultrazvuk bubrega pokazao je dvije male ciste na lijevom bubregu. Broj eritrocita, broj leukocita, C-reaktivni protein, mokraćna kiselina i reumatoidni faktor su također bili unutar granica referentnog raspona. Bolesnik je imao normalnu tjelesnu težinu i inače se dobro osjećao. Bolesnik je primljen u našu kliniku na daljnji dijagnostički pregled.
Bolesnik je dao informirani pismeni pristanak za objavljivanje ovog prikaza.
Metode
Naš standardni dijagnostički pregled u slučaju sumnje na sarkoidozu uključuje standardni elektrokardiogram (EKG) te rendgen pluća. Bolesnika je pregledao pulmolog. Napravljena je i spirometrija, kako bi se procijenio forsirani vitalni kapacitet (engl. forced vital capacity, FVC), forsirani ekspiracijski volumen u prvoj sekundi (engl. forced expiratory volume in 1 second, FEV1) te omjer FEV1/FVC.
Od bioloških uzoraka, uzeti su mokraća, serum i plazma (EDTA i citrat), kako bi se načinile rutinske laboratorijske pretrage. Biokemijski parametri određeni su na automatiziranom biokemijskom analizatoru Olympus AU2700 (Olympus, Hamburg, Njemačka). Hematološki i koagulacijski parametri određeni su automatiziranim analizatorima Cell-Dyn Sapphire (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, SAD), odnosno BCS Coagulation Analyzer (Dade Behring, Marburg, Njemačka).
Koncentracije imunoglobulina IgA, IgG i IgM određene su nefelometrijom na automatiziranom analizatoru BN II (Dade Behring, Marburg, Njemačka).
Kapilarna elektroforeza proteina u serumu napravljena je automatiziranim sustavom za kapilarnu elektroforezu Capillarys System (Sebia, Issy-les-Moulinaux, Francuska) prema uputama proizvođača reagensa Capillarys protein(E) 6 (Sebia, Issy-les-Moulinaux, Francuska). Ukratko, uzorci se razrjeđuju u analizatoru u omjeru (1:10) i zatim se injektiraju na anodnom kraju silikonskih kapilara. Molekule s nabojem odvajaju se u bazičnom puferu (pH 9,9) prema elektroforetskoj pokretljivosti na 300 V. Odvajanje proteina odvija se u kapilarama, a proteini se detektiraju na katodnom kraju kapilara pri 200 nm.
Dijagnoza sarkoidoze postavljena je na osnovi bolesnikove anamneze, kliničkih simptoma i laboratorijskih i patoloških nalaza.
 
Rezultati
 
Medicinskim pregledom otkriveno je slijedeće: rendgen bolesnikovih pluća potvrdio je prethodno primijećenu bilateralnu hilarnu limfadenopatiju, bez ikakvih promjena u intersticiju. Spirometrija je pokazala normalnu plućnu funkciju: forsirani ekspiracijski volumen u prvoj sekundi (FEV1) od 4,491 (118%) i forsirani vitalni kapacitet (FVC) od 5,221 (115%); omjer FEV1/FVC bio je 0,95.
Hematološki, koagulacijski te većina biokemijskih parametara bili su unutar granica referentnog raspona, s iznimkom koncentracije ukupnog kolesterola (7,7 mmol/L; preporučena vrijednost <5,0 mmol/L), koncentracije LDL-kolesterola (5,3 mmol/L; preporučena vrijednost <3,0 mmol/L) i aktivnosti angiotenzin-konvertirajućeg enzima (engl. angiotensin-converting enzyme, ACE) (64,5 U/L; referentni raspon <52 U/L) koje su bile povišene. Koncentracija imunoglobulina IgM, IgA i IgG u serumu bila je unutar granica referentnog raspona.
Elektroforeza serumskih proteina otkrila je dvije različite frakcije albuminana anodnom kraju (Slika 1.). Frakcije su bile nejednakih relativnih količina.Nova vrsta albumina bila je sporije migrirajuća nego standardni albumin. Ukupna koncentracija proteina bila je 65 g/L, s omjerom albumina prema globulinu 1,63 (referentni raspon 0,80–2,00). Udjeli sporo migrirajućeg i normalnog albumina bile su 0,48, odnosno 0,51 od ukupnog albumina. Tri, odnosno šest mjeseci nakon prvog posjeta klinici ponovno smo ispitali serum bolesnika, koji je još uvijek imao bisalbuminemiju.
Bolesnikova najbliža rođakinja (sestra, D.L.) također je pristala dati uzorak krvi. Elfelogram serumskih proteina njenog uzorka bio je identičan slici našeg bolesnika s bisalbuminemijom (M.L.), što je ukazalo na nasljednu prirodu te vrste albumina.
 
 
Slika 1. Kapilarna elektroforeza proteina u serumu od bolesnika sa sarkoidozom. Proteini u serumu odijeljeni su u sljedeće frakcije: AlbS (novopronađena frakcija albumina spore migracije), AlbN (standardni albumin), α1, α2, β1, β2 i γ globulini.
 
Rasprava
 
Prije više od 50 godina više je autora opazilo bisalbuminemiju (1,16,17) i od tada je taj poremećaj intenzivno ispitivalo nekoliko istraživačkih skupina. Dosad je velika većina promjena molekule albumina opsežno okarakterizirana (2). Ta su saznanja čvrsta osnova za daljnja istraživanja o svojstvima vezanja liganda na molekule albumina (18,19,14). Iako su opisane frakcije s promijenjenim afinitetom prema trijodtironinu (T3) i tiroksinu (T4) (20), te masnim kiselinama (21), izgleda da je ukupan učinak promjene sekvence aminokiseline na karakteristike vezanja liganda zanemariv i od manjega kliničkog značaja. Nadalje, o bisalbuminemiji se dosad najčešće izvještavalo kao o benignom stanju, zapaženom kao popratna pojava osnovnoj bolesti ili patološkom stanju. Jedinu iznimku predstavlja obiteljska bisalbuminemijska hipertrijodotironinemija o kojoj su prvi put izvijestili Sunthornthepvarakul i sur. (22) kod članova obitelji s Tajlanda s klinički normalnom funkcijom gušterače i visokom koncentracijom ukupnog T3 u serumu. Nakamura i sur. (23) pružili su daljnje dokaze o ulozi frakcija albumina kao uzroka hipertrijodotironinemije u podlozi kod 56-godišnje Japanke. Klinički bi endokrinolozi uvijek trebali uzeti u obzir moguću prisutnost frakcija albumina kod bolesnika s povišenom koncentracijom T3 i T4 ako ne postoje drugi očigledni razlozi za to povećanje. Više je autora prikazalo nadmoćnost kapilarne zonske elektroforeze (engl. capillary zone electrophoresis, CZE) u usporedbi s elektroforezom u agaroznom gelu (engl. agarose gel electrophoresis), zbog bitno poboljšanog razdvajanja albumina, α1 i α2 frakcija (1,12). Stoga, ako se sumnja na prisutnost frakcija albumina, treba provesti kapilarnu zonsku elektroforezu, budući da je to metoda prvog izbora za takve slučajeve.
U ovom smo radu prikazali jedan novi slučaj urođene bisalbuminemije kod bolesnika sa sarkoidozom. Prema našim spoznajama bisalbuminemija do sada nije opisana u bolesnika sa sarkoidozom. Sarkoidoza je bolest nepoznate etiologije, koja zahvaća više organa s višestrukim kliničkim manifestacijama i patološkim nalazima. Ima li pojava bisalbuminemije ikakve važnosti za etiopatofiziološki mehanizam ove bolesti jest pitanje koje tek treba razjasniti. Mi, nažalost, trenutno nismo bili u mogućnosti dalje istražiti sekvencu DNA, kao niti strukturne i funkcionalne osobine ove frakcije albumina. Naš je cilj takvu analizu napraviti u suradnji s drugim istraživačkim skupinama.
I medicinski biokemičari i liječnici bi uvijek trebali biti na oprezu kod svakog novog slučaja pojave urođenih i stečenih frakcija albumina, jer bi to moglo pružiti nove podatke o evoluciji proteina kao i o fizičkim, kemijskim i molekularnim karakteristikama molekule albumina, što može dovesti do otkrića i razvoja novih potencijalnih pristupa terapiji. Ako se, pak,dokaže da je stečena, slučaj bisalbuminemije može ukazati na neko osnovno patofiziološko stanje, kao npr. pseudocistu gušterače, pružajući liječniku dodatne kliničke informacije koje mogu pomoći pri postavljanu diferencijalne dijagnoze.
 
Zahvala
 
Ovaj je rad nastao uz potporu Ministarstva znanosti, obrazovanja i športa Republike Hrvatske; broj projekta: 134-1340227-0200. Nadalje, autori žele iskazati svoju zahvalnost prof. dr. sc. Slavici Dodig iz Dječje bolnice Srebrnjak, za svesrdnu pomoć i vrlo korisne savjete tijekom pripreme rukopisa.
 
Literatura
 
 1.   Sarcione EJ, Aungst W. Studies in bisalbuminemia: Binding properties of the two albumins. Blood 1962;20:156-64.
 2.   Minchiotti L, Galliano M, Kragh-Hansen U, Peters T Jr. Mutations and polymorphisms of the gene of the major human blood protein, serum albumin. Hum Mutat 2008;29:1007-16.
 3.   Kumit DM, Phillip BW, Bruns GA. Confirmation of the mapping assignment of human serum albumin to chromosome 4 using a cloned human albumin gene. Cytogenet Cell Genet 1982;34:282-8.
 4.   Tárnoky AL. Genetic and drug-induced variation in serum albumin. Adv Clin Chem 1980;21:101-46.
 5.   Arvan DA, Blumberg BS, Melartin L. Transient “bisalbuminemia” induced by drugs. Clin Chim Acta 1968;22:211-8.
 6.   Rocha J, Bohner J, Kömpf J. Transient bisalbuminemia: separation by isoelectric focusing of human albumin fractions linked to different numbers of benzylpenicilloyl groups. Electrophoresis 1995;16:1031-3.
 7.   Kobayashi S, Okamura N, Kamoi K, Sugita O. Bisalbumin (fast and slow type) induced by human pancreatic juice. Ann Clin Biochem 1995;32:63-7.
 8.   Hoang MP, Baskin LB, Wians FH Jr. Bisalbuminuria in an adult with bisalbuminemia and nephrotic syndrome. Clin Chim Acta 1999;284:101-7.
 9.   Ahmad J, Khan AS, Siddiqui MA, Tewari SG, Khan RU. Bisalbuminemia in nephrotic syndrome (a case report). Jpn J Med 1984;23:45-7.
10.   Ejaz AA, Krishna M, Wasiluk A, Knight JD. Bisalbuminemia in chronic kidney disease. Clin Exp Nephrol 2004;8:270-3.
11.   Shetty JK, Prakash M, Gopalakrishna K. Bisalbuminemia in an adult male with Alzheimer’s disease. Indian J Med Sci 2007;61:356-7.
12.   Kalambokis G, Kitsanou M, Kalogera C, Kolios G, Seferiadis K, Tsianos E. Inherited bisalbuminemia with benign monoclonal gammopathy detected by capillary but not agarose gel electrophoresis. Clin Chem 2002;48:2076-7.
13.   Dodig S, Cepelak I, Benko B, Raos M, Branovic K. Bisalbuminemia in two Croatian families. Arch Med Res 2000;31:608-12.
14.   Kragh-Hansen U, Campagnoli M, Dodig S, Nielsen H, Benko B, Raos M, et al. Structural analysis and fatty acid-binding properties of two Croatian variants of human serum albumin. Clin Chim Acta 2004;349: 105-12.
15.   Judson MA. Sarcoidosis: clinical presentation, diagnosis, and approach to treatment. Am J Med Sci 2008;335:26-33.
16.   Knedel M. Double albuminemia, a new hereditary protein anomaly. Blut 1957;3:129-34.
17.   Wuhrmann F. Double albumin peak as a hereditary blood protein anomaly. Schweiz Med Wochenschr 1959;89:150-2.
18.   Reed RG. Ligand-binding properties of albumin Parklands: Asp365----His. Biochim Biophys Acta 1988;965:114-7.
19.   Kragh-Hansen U, Chuang VT, Otagiri M. Practical aspects of the ligand-binding and enzymatic properties of human serum albumin. Biol Pharm Bull 2002;25:695-704.
20.   Sarcione EJ, Aungst CW. Bisalbuminemia associated with albumin thyroxine-binding defect. Clin Chim Acta 1962;7:297-8.
21.   Minciotti L, Kragh-Hansen U, Nielsen H, Hardy E, Mercier A-Y, Galliano M. Structural characterization, stability and fatty acid-binding properties of two French genetic variants of human serum albumin. Biochim Biophys Acta 1999;1431:223-31.
22.   Sunthornthepvarakul T, Likitmaskul S, Ngowngarmratana S, Angsusingha K, Kitvitayasak S, Scherberg NH, et al. Familial dysalbuminemic hypertriiodothyroninemia: a new, dominantly inherited albumin defect. J Clin Endocrinol Metab 1998;83:1448-54.
23.   Nakamura S, Kajita Y, Ochi Y. Familial dysalbuminemic hypertriiodothyroninemia in a Japanese kindred. Intern Med 2000;39:50-4.
24.   Jaeggi-Groisman SE, Byland C, Gerber H. Improved sensitivity of capillary electrophoresis for detection of bisalbuminemia. Clin Chem 2000;46:882-3.