Contact

Daria Pašalić
Editor-in-Chief
Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Chemistry
Zagreb University School of Medicine
Šalata ul 2.
10 000 Zagreb, Croatia
Phone +385 (1) 4590 205; +385 (1) 4566 940
E-mail: dariapasalic [at] gmail [dot] com

Useful links

Izvorni znanstveni članak:

Ivana Horvat1, Margareta Radić Antolic2, Renata Zadro2*, Dubravka Sertić3, Boris Labar3. Klinička značajnost otkrivanja mutacije T315I u domeni ABL kinaze kod bolesnika rezistentnih nal iječenje imatinib mesilatom. Biochemia Medica 2010;20(1):75-81.
1Division of Laboratory Diagnostics, University Hospital of Traumatology, Zagreb, Croatia
2Department of Laboratory Diagnostics, University Hospital Centre Zagreb, Zagreb, Croatia
3Hematology Division, Department of Internal Medicine, University Hospital Centre Zagreb, Zagreb, Croatia
*Corresponding author: rzadro [at] mef [dot] hr
 
Sažetak
 
Uvod: Kronična mijeloična leukemija (engl. chronic myeloid leukemia, CML) je mijeloproliferativna bolest koju karakterizira prisutnost fuzijskog gena bcr-abl i posljedično fuzijskog proteina bcr-abl. Iako je otkriće inhibitora tirozin-kinaze (engl. tyrosine kinase inhibitor, TKI), imatinib mesilata (IM) poboljšalo liječenje bolesnika oboljelih od CML, dio bolesnika razvija rezistenciju na lijek, što dovodi do povišene razine bcr-abl prijepisa. Jedan od mogućih razloga te rezistencije su mutacije u domeni ABL kinaze. Neke se mutacije mogu prevladati povećanjem doze lijeka ili primjenom nove generacije TKI. Jedina mutacija rezistentna na trenutno dostupne TKI jest T315I. Cilj ovog istraživanja bio je otkriti da li je prisutnost T315I kod bolesnika rezistentnih na liječenje imatinib mesilatom povezana s povećanom ili neprekidno visokom razinom bcr-abl prijepisa. Također, cilj je bio procijeniti moguću razliku u razini bcr-abl prijepisa kod bolesnika rezistentnih na liječenje imatinib mesilatom sa i bez T315I mutacije.
Ispitanici i metode: U ispitivanje su bila uključena 24 bolesnika oboljela od CML s neodgovarajućim odgovorom na liječenje imatinib mesilatom. Provedena je kvantitativna lančana reakcija polimerazom u stvarnom vremenu (engl. real time quantitative polymesare chain reaction, RQ-PCR) prema protokolu udruženja Europa protiv raka (engl. Europe Against Cancer), a za dokazivanje mutacije T315I rabljena je metoda alel specifične oligonukleotidne PCR (engl. allele specific oligonucleotide PCR, ASO PCR).
Rezultati: Kod 4 od 24 bolesnika dokazana je mutacija T315I (17%). Izračunat je i medijan omjera bcr-abl/abl koji je iznosio 19% za bolesnike s T315I mutacijom i 13% za bolesnike bez mutacije, no razlika između tih dviju skupina nije bila statistički značajna (P = 0,394)
Zaključak: Dokazivanje prisutnosti mutacije T315I ključno je u terapijskom pristupu bolesnicima s CML, budući da je liječenje izbora za nositelje te mutacije transplantacija matičnih stanica.
 
Ključne riječi: kronična mijeloična leukemija; rezistencija na imatinib mesilat; mutacija T315I
 

Received: November 16, 2009

Accepted: December 16, 2009

Uvod
 
Kronična mijeloična leukemija (engl. chronic myeloid leukemia, CML) je mijeloproliferatvna bolest karakterizirana kromosomskom translokacijom t(9;22) (q34;q11), poznatom kao filadelfijski kromosom (engl. Philadelphia chromosome). Posljedica te translokacije je onkogenetički fuzijski gen bcr-abl koji proizvodi protein bcr-abl s pojačanom aktivnošću tirozin-kinaze. Nova saznanja o CML i otkriće molekularnih putova tirozin-kinaze, doveli su do otkrića „pametnog lijeka“, imatinib mesilata (engl. imatinib mesylate, IM), koji se kompetitivno veže na vezna mjesta za ATP i specifično inaktivira bcr-abl kinazu (1,2). Uvođenje IM u liječenje CML omogućilo je visoki postotak citogenetičkih i molekularnih remisija kod većine bolesnika (1). Standardno liječenje kronične faze CML uključuje 400 mg IM na dan s citogenetičkim praćenjem postotka stanica pozitivnih na filadelfijski kromosom i molekularnim praćenjem razine bcr-abl prijepisa metodom kvantitativnog PCR-a (RQ-PCR) (1,3,4).
Međutim, kod određenog broja bolesnika ili uopće nema odgovora ne terapiju imatinib mesilatom, ili se on s vremenom izgubi. Jedan od mogućih razloga za to su mutacije gena za ABL kinazu koje su otkrivene kod više od 50% bolesnika s CML otpornih na liječenje IM (1).
Postoji nekoliko tipova mutacija koje se mogu podijeliti u četiri skupine temeljem kristalografske strukture cABL: mutacije koje se vežu na katalitičku domenu proteina bcr-abl i tako izravno onemogućuju IM, one koje se nalaze unutar ATP veznog mjesta, one koje se nalaze unutar aktivacijske petlje koja sprečava kinazu kako bi postigla neaktivnu konformaciju potrebnu za vezanje IM i one koje se nalaze unutar katalitičke domene (1).
Do sada su opisane barem 73 različite mutacije kod bolesnika s CML rezistentnih na IM (5). Sve mutacije nemaju istu važnost, neke su čak funkcionalno nevažne (3). Prema odgovoru na liječenje IM, mutacije se dijele na visoko rezistentne mutacije u domeni kinaze (T315I, Y253H/K, E255K/V, H396P/R) i umjereno rezistentne mutacije (M244V, M351T, F359V). Umjereno rezistentne mutacije u domeni kinaze mogu se prevladati povišenom dozom lijeka IM od 600 ili 800 mg na dan (1,3).
Razvoj druge generacije inhibitora tirozin-kinaze (engl. tyrosine kinase inhibitor, TKI) nilotiniba i dasatiniba, koji se strukturno razlikuju od IM, koristi bolesnicima nositeljima visoko rezistentnih mutacija, budući da oba lijeka suzbijaju učinak svih poznatih mutacija koje dovode do rezistencije na imatinib, osim mutacije T315I (2,5). To je točkasta mutacija u kojoj dolazi do zamjene C-->T, što dovodi do promjene aminokiseline treonina u izoleucin na položaju 315 (Thr315-->Ile) u cABL. Thr315 se nalazi na ključnom položaju odgovornom za stvaranje vodikovih veza s IM ili drugim TKI, čineći time lijek djelotvornim. Izoleucin sadrži jednu ugljikovodikovu skupinu više u postraničnom lancu, koja stvara steričke smetnje za vezivanje TKI, ali ne utječe na vezivanje ATP (6). Stoga, T315I predstavlja vrstu čuvara (engl. gatekeeper) koji kontrolira ulaz malih molekula inhibitora i zbog toga je tu mutaciju teško nadvladati, ne samo imatinib mesilatom, već i ostalim molekulama koje kompetitiraju s ATP (7). Zbog svih problema povezanih s T315I, liječenje izbora za nositelje T315I mutacije je alogena transplatacija matičnih stanica (1).
Cilj ovog istraživanja bio je otkriti je li prisutnost T315I mutacije kod bolesnika rezistentnih na liječenje imatinib mesilatom povezana s povišenom ili neprekidno visokom razinom bcr-abl prijepisa. Cilj je također bio utvrditi postoji li razlika u razinama bcr-abl prijepisa kod bolesnika rezistentnih na liječenje imatinib mesilatom sa i bez T315I mutacije.
 
Materijali i metode
Ispitanici
U istraživanje su bila uključena 24 bolesnika (10 žena i 14 muškaraca) kojima je dijagnosticirana CML i čiji odgovor na liječenje IM nije bio odgovarajući. Svi bolesnici liječeni su u Zavodu za hematologiju Klinike za unutarnje bolesti Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu i Kliničkog bolničkog centra Zagreb.
Prema Baccaraniju i suradnicima, neodgovarajući se odgovor može podijeliti u tri skupine (3):
1. Suboptimalni odgovor – manji nego značajni molekularni odgovor (engl. majormolecularresponse, MMoR) (MMoR se definira kao omjer bcr-abl/abl ≤ 0,1 prema Međunarodnoj ljestvici (engl. InternationalScale, IS) nakon 18 mjeseci praćenja) ili gubitak MMoR.
2. Bez odgovora na liječenje IM – manji nego potpuni citogenetički odgovor (engl. completecytogeneticresponse, CCyR) (CCyR se definira kao izostanak Ph pozitivnih metafaza nakon 18 mjeseci praćenja) ili gubitak CCyR ili kompletnog hematološkog odgovora.
3. Povećanje veće od 1 log omjera bcr-abl/abl između dva mjerenja tijekom praćenja.
Tijekom istraživanja kod svih je bolesnika bolest bila u kroničnoj fazi.
Metode
RNA i DNA izolirane su iz koštane srži ili perifernih krvnih stanica. Genomska DNA ekstrahirana je metodom isoljavanja (8). Za dokazivanje mutacije T315I primijenjena je metoda alel specifičnog oligonukleotidnog PCR-a (ASO-PCR) prema Kangu i sur. (9). Uzorak DNA bolesnika s potvrđenom mutacijom T315I korišten je kao pozitivni kontrolni uzorak. RNA je izolirana protokolom izdvajanja s trizolom (engl. Trizol RNA extraction protocol) (10) te obrnuto prepisana u cDNA (High capacity cDNA reverse Transcription Kit with RNAse inhibitor, Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija, SAD) prema uputama proizvođača. RQ-PCR je provedena prema protokolu udruženja Europa protiv raka (engl. Europe Against Cancer) (11) tehnologijom TaqMan (LichtCycler, Roche, Mannheim, Njemačka). Umnažanje fuzijskog gena bcr-abl i abl kao kontrolnog gena izvedeno je metodom RQ-PCR (FusionQuant Kit for RQ-PCR analysis of bcr-abl Mbcr, Ipsogen, Marseille, France) prema uputama proizvođača. Omjeri bcr-abl/abl izračunati su prema IS.
Statistička analiza
Podaci su prikazani kao medijan i raspon te su procijenjeni neparametrijskim statističkim testom. Razlike između dviju skupina (s i bez mutacije) ispitane su Mann-Whitneyevim testom, dok je razlika u omjerima bcr-abl/abl između tri ispitivane skupine s neodgovarajućim odgovorom na liječenje IM ispitana Kruskal-Wallisovim testom. Razina statističke značajnosti postavljena je na 0,05. Statistička analiza provedena je programskim paketom MedCalc verzija 9.3.2.0 (Frank Schoonjans, Mariakerke, Belgium).
 
Rezultati
 
Kod 24 bolesnika s CML bez odgovarajućeg odgovora na liječenje IM provedeno je dokazivanje mutacije T315I metodom ASO-PCR. Na slici 1. prikazano je elektroforetsko razdvajanje umnoženih produkata ASO-PCR-om.
Slika 1. Elektroforetsko razdvajanje reprezentativnih ASO-PCR produkata.
 
Rezultati RQ-PCR i status mutacije T315I u skupinama s neodgovarajućim odgovorom na liječenje IM prikazani su u tablici 1. Od 24 ispitana bolesnika, 12 bolesnika nije odgovorilo na liječenje IM (citogenetički podaci nisu prikazani), 6 bolesnika je imalo suboptimalni odgovor,a kod 6 bolesnika je dokazano povećanje omjera bcr-abl/abl više od 1 log između dva mjerenja u praćenju. Kod bolesnika kod kojih nije dokazana mutacija T315I raspon omjera bcr-abl/abl bio je 0,14-46,25%, za razliku od skupine s dokazanom mutacijom T315I čiji je raspon omjera
bcr-abl/abl bio 10,95-30,45%.
 
Tablica 1. Omjeri bcr-abl/abl (medijan i raspon) istatus mutacije T315I kod tri ispitivane skupine s neodgovarajućim odgovorom na liječenje IM
 
Kako bi se odredila razlika u omjerima bcr-abl/abl između skupina bolesnika s i bez mutacije T315I, izračunat je medijan omjera bcr-abl/abl. Rezultati su prikazani u tablici 2. i na slici 2. Kod bolesnika s dokazanom mutacijom T315I, medijan omjera bcr-abl/abl bio je 66% viši nego kod bolesnika bez mutacije T315I.
 
Tablica 2. Omjeri bcr-abl/abl (medijan i raspon) kod T315I pozitivnih i negativnih bolesnika
 
Slika 2. Grafički prikaz omjera bcr-abl/abl za T315I negativne i pozitivne bolesnike.
 
Rasprava
 
Nakon što je prije više od 150 godina CML prvi puta opisana kao bolest, veći je napredak u liječenju učinjen u proteklom desetljeću nego u prvih sto godina od otkrića bolesti. Otkriće tirozin-kinazne aktivnosti proteina bcr-abl, dovelo je do sinteze nove serije spojeva, inhibitora tirozin-kinaze. Jedan od njih, imatinib mesilat, pokazuje vrlo visoku i relativno specifičnu biokemijsku aktivnost te posjeduje prihvatljiv farmakokinetički i toksični profil, pa je vrlo brzo uveden u kliničku praksu (6). To je dovelo do revolucionarnog koraka u liječenju CML, odgovoru na liječenje i naposljetku procjeni liječenja osjetljivijim tehnikama. Stoga je Europska mreža za leukemiju (engl. European Leukemia Net) izradila protokol za obradu CML koji uključuje kliničku procjenu, krvnu sliku, citogenetički pregled koštane srži i molekularno praćenje razine bcr-abl prijepisa svaka 3 mjeseca od početka liječenja (3). Glavni razlog rezistencije na liječenje IM ili recidiva tijekom liječenja IM su točkaste mutacije ABL kinaze (7,12,13). Jedina mutacija rezistentna na trenutno dostupan TKI jest T315I. Stoga je nosiocima mutacije T315I jedino rješenje alogenična transplatacija matičnih stanica. To je razlog zašto je otkrivanje mutacija ABL kinaze vrlo korisno u racionalnoj terapijskoj obradi bolesnika s CML (12).
Postoji nekoliko metoda za otkrivanje mutacija u domeni kinaze. Jedna od najčešće primjenjivanih metoda probira u rutinskom praćenju bolesnika je direktno sekvenciranje. Nedostatak te metode je njena niska osjetljivost (20%). Metoda s višom osjetljivošću od direktnog sekvenciranja je denaturirajuća tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti (engl. Denaturing high performance liquid chromatography) (1-5%). Za razliku od tih metoda, alel specifična oligonukleotidna lančana reakcija polimeraze (engl. Allele-Specific Oligonucleotide PCR, ASO-PCR) ima najvišu osjetljivost koja može doseći čak 0,1%, no probir kroz cijelu domenu gena ABL nije moguć, budući da ta metoda zahtjeva različite početnice za svaku mutaciju (1,2,12,13).
U ovo istraživanje su bila uključena 24 bolesnika s neodgovarajućim odgovorom na liječenje IM i stalnim povećanjem ili visokim omjerom bcr-abl/abl kod praćenja. Sukladno ranije objavljenim podacima, pretpostavili smo da bi mutacija T315I mogla biti razlogom neodgovarajućeg odgovora na terapiju (1). Među svim bolesnicima, u 4 je slučaja otkrivena mutacija T315I (17%). Tri bolesnika s dokazanom mutacijom T315I su iz skupine bez odgovora na liječenje IM, što je bilo i očekivano s obzirom da je taj mutirani podklon rezistentan na liječenje IM (4). Kod jednog bolesnika s dokazanom mutacijom T315I i povećanjem omjera bcr-abl/abl više od 1 log, mutacija se proširila vjerojatno kao rezultat selektivne inhibicije IM (4).
Izračunat medijan omjera bcr-abl/abl iznosio je 19,36% za skupinu pozitivnu na T315I i 12,80% za skupinu negativnu na T315I, no razlika nije bila statistički značajna (P = 0,394). Visoke razine bcr-abl prijepisa povezuju se s lošom prognozom koja uključuje progresiju do blastične krize i upućuje na dokazivanje prisutnosti mutacije T315I (3). Ukoliko se dokaže mutacija T315I, drastično se mijenja terapijski pristup: bolesnik više neće primati skupo i neodgovarajuće liječenje, a dobiva se više vremena za pronalazak darivatelja koštane srži. Stoga praćenje nije samo važno da se osigura najbolje moguće liječenje bolesnika, već je poželjno i s farmakoekonomskog gledišta (13).
U zaključku, otkrivanje mutacije T315I treba biti uključeno u obradu bolesnika oboljelih od CML zajedno s molekularnim, citogenetičkim i kliničkim praćenjem. Rezultat ove analize izravno utječe na terapijski pristup, budući da je liječenje izbora za nosioce mutacije T315I alogenična transplantacija matičnih stanica.
 
Literatura
 
 1. Hehlmann R, Hochhaus A, Baccarani M. Chronic myeloid leukemia. Lancet 2007;370:342-50.
 2. Jones D, Kamel-Reid S, Bahler D, Dong H, Elenitoba-Johnson K, Press R, et al. Laboratory Practice Guidelines for Detecting and Reporting BCR-ABL Drug Resistance Mutations in Chronic Myelogenous Leukemia and Acute Lymphoblastic Leukemia. J Mol Diagn 2009;11;4-11.
 3. Baccarani M, Saglio G, Goldman J, Hochhaus A, Simonsson B, Appelbaum F, et al. Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European Leukemia Net. Blood 2006;108:1809-20.
 4. Goldman JM. How I treat chronic myeloid leukemia in imatinib era. Blood 2007;110: 2828-37.
 5. Baccarani M, Pane F, Saglio G. Monitoring treatment of chronic myeloid leukemia. Haematologica 2008;93:161-6.
 6. Gorre ME, Mohammed M, Ellwood K, Hsu N, Paquette R, Rao PN, Sawyers CL. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification. Science 2001;293:876-80.
 7. Cools J, Maertens C, Marynen P. Resistance to tyrosine kinase inhibitors: calling on extra forces. Drug Resist Updat 2005;8:119-29.
 8. Miller SA, Dykes DD, Polasky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acid Res 1988;16:1215.
 9. Kang HY, Hwang JY, Kim SH, Goh HG, Kim M, Kim DW. Comparison of allele specific oligonucleotide-polymerase chain reaction and direct sequencing for high throughput screening of ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia resistant to imatinib. Haematologica 2006;91:659-62.
10. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987;162:156-9.
11. Gabert J, Beillard E, van der Velden VH, Bi W, Grimwade D, Pallisgaard N, et al. Standardization and quality control studies of ‘real-time’ quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia 2003;17:2318-57.
12. Hughes T, Deininger M, Hochhaus A, Branford S, Radich J, Kaeda J, et al. Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood 2006;108:28-37.
13. Ernst T, Erben P, Müller CM, Paschka P, Schenk T, Hoffmann J, et al. Dynamics of BCR-ABL mutated clones prior to hematologic or cytogenetic resistance to imatinib. Haematologica 2008;93:186-92.